孫軼 袁艷冰 劉放云 劉海燕

氙氣聯(lián)合亞低溫對(duì)少突膠質(zhì)前體細(xì)胞糖氧剝奪后的保護(hù)作用

孫軼 袁艷冰 劉放云 劉海燕

目的 研究氙氣聯(lián)合亞低溫對(duì)少突膠質(zhì)前體細(xì)胞（OPCs）糖氧剝奪損傷后的保護(hù)作用，探討氙氣對(duì)新生兒缺氧缺血性腦病（HIE）的保護(hù)機(jī)制。方法 體外培養(yǎng)大鼠原代OPCs，檢測氙氣聯(lián)合亞低溫對(duì)OPCs糖氧剝奪后凋亡、增殖和分化的影響。結(jié)果 各組細(xì)胞凋亡率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），其中正常對(duì)照組（Ctrl）凋亡率最低為（6.3±1.52）%，而OGD對(duì)照組（OGD Ctrl）凋亡率最高為（70.3±4.72）%，氙氣組（Xe）和亞低溫組（HT）凋亡率分別為（27.3±3.05）%、（31.6±4.5）%，顯著低于OGD對(duì)照組，比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），聯(lián)合治療組（Xe+HT）凋亡率為（15.6±2.51）%，低于氙氣低溫組或亞低溫組，比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；各組OPCs增殖率比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；正常對(duì)照組細(xì)胞呈健康生長，有明顯的三級(jí)以上分支的較長網(wǎng)狀突起形成，計(jì)算成熟細(xì)胞率為（81.0±4.58）%；OGD對(duì)照組細(xì)胞細(xì)胞突起短少而紊亂，次級(jí)以上分支減少，成熟細(xì)胞率為（14.6±3.51）%，OGD對(duì)照組與正常對(duì)照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。氙氣組成熟細(xì)胞率（43.6±3.51）%比OGD對(duì)照組高，低于亞低溫組（53.3±3.21）%，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。聯(lián)合治療組成熟細(xì)胞率（64.6±4.16）%顯著高于單用氙氣或亞低溫組（P＜0.05）。結(jié)論 氙氣聯(lián)合亞低溫治療能保護(hù)OPCs耐受缺氧缺血性損傷的影響，可能是其對(duì)HIE的神經(jīng)保護(hù)機(jī)制之一。

氙氣；亞低溫；糖氧剝奪；少突膠質(zhì)前體細(xì)胞

新生兒缺氧缺血性腦病（hypoxic-ischemic encephalopathy，HIE）是一種能導(dǎo)致新生兒死亡及影響神經(jīng)預(yù)后的嚴(yán)重疾病。亞低溫療法（hypothermia，HT）是目前唯一被循證醫(yī)學(xué)證實(shí)能改善足月兒HIE的神經(jīng)系統(tǒng)預(yù)后并降低死亡率的方法，但療效仍不夠理想［1-3］。在缺血缺氧性腦損傷的新生動(dòng)物中，氙氣（Xenon，Xe）具有顯著的神經(jīng)保護(hù)特性并可與亞低溫起協(xié)同效應(yīng)，可抑制神經(jīng)元凋亡［4-5］。近年研究證明新生兒缺氧缺血不僅損傷腦灰質(zhì)而且損傷腦白質(zhì)［6］，腦白質(zhì)損傷主要表現(xiàn)為少突膠質(zhì)前體細(xì)胞（oligodendrocyte precursor cell，OPCs）增殖，但能分化成熟形成髓鞘的卻很少［7］。本研究在體外制備OPCs糖氧剝奪損傷模型，模擬體內(nèi)缺氧缺血過程，探討氙氣聯(lián)合亞低溫治療對(duì)OPCs增殖和分化的影響，為氙氣對(duì)HIE的保護(hù)作用機(jī)制提供更多的基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與試劑 新生1日齡SPF級(jí)SD大鼠，雄性，由中山醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。Edu細(xì)胞增殖檢測試劑盒、熒光二抗及所有細(xì)胞培養(yǎng)試劑均購自Gibco，氙氣混合氣體購自深圳特種氣體公司。Tunnel細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購自Roche，小鼠抗MBP抗體購自Chemicon。

1.2 少突膠質(zhì)前體細(xì)胞純化分離培養(yǎng) 參考Chen［8］的方法，新生大鼠取大腦進(jìn)行混合膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)，10～12 d后利用振蕩分離和差速貼壁法分離和純化OPCs。

1.3 糖氧剝奪模型（Oxygen-Glucose Deprivation，OGD）及氙氣處理 OPCs增殖培養(yǎng)2 d后更換為經(jīng)過氮?dú)馓幚磉^的無糖無氧DMEM培養(yǎng)基，對(duì)照組為高糖DMEM培養(yǎng)基，OGD組細(xì)胞置于三氣培養(yǎng)箱內(nèi)調(diào)節(jié)成95%N2，5%CO2，37℃培養(yǎng)120 min，完成糖氧剝奪過程。氙氣組細(xì)胞培養(yǎng)基事先通入氙氣混合氣體（50%Xe，25%N2，20%O2，5%CO2）處理，OPCs加入已處理培養(yǎng)基置于密閉的細(xì)胞培養(yǎng)罐中，混合氣體充入培養(yǎng)罐10 min后密閉培養(yǎng)24 h。

1.4 實(shí)驗(yàn)分組 OGD細(xì)胞分為對(duì)照組（OGD Ctrl），氙氣組（Xe），亞低溫組（HT），及聯(lián)合治療組（Xe+HT），此外設(shè)無OGD的正常培養(yǎng)對(duì)照組（Ctrl）。氙氣組及聯(lián)合治療組充入氙氣混合氣體，其它治療組氣體為75%N2，20%O2，以及5%CO2。OGD后亞低溫組及聯(lián)合治療組培養(yǎng)箱溫度為33℃，其余組為37℃。

1.5 OPCs凋亡、增殖及分化檢測 收集各組處理24 h后細(xì)胞，Tunnel免疫熒光染色檢測凋亡，凋亡率以Tunnel陽性細(xì)胞數(shù)占DAPI染色陽性的總細(xì)胞數(shù)比例來表示；或更換正常OPCs增殖培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h，Edu法檢測細(xì)胞增殖，Edu標(biāo)記陽性率=陽性細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)×100%；另外一部分細(xì)胞則在處理后進(jìn)行OPCs分化培養(yǎng)，5 d后進(jìn)行MBP免疫熒光染色。計(jì)算有三級(jí)以上分支，且突起長度超過胞體3倍以上的細(xì)胞所占的比例，即成熟細(xì)胞率。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件包分析本研究數(shù)據(jù)。計(jì)量資料以“x±s”表示，多組間比較采用單因素方差分析(ANOVA)，之后兩兩比較采用LSD檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組細(xì)胞凋亡率的比較 方差分析顯示各組細(xì)胞凋亡率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），其中正常對(duì)照組（Ctrl）因細(xì)胞在正常條件下培養(yǎng)凋亡率最低為（6.3±1.52）%，而OGD對(duì)照組（OGD Ctrl）凋亡率最高為（70.3±4.72）%，氙氣組（Xe）和亞低溫組（HT）凋亡率分別為（27.3±3.05）%、（31.6±4.5）%，顯著低于OGD對(duì)照組，比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），氙氣組（Xe）和亞低溫組（HT）比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，聯(lián)合治療組（Xe+HT）凋亡率為（15.6±2.51）%，低于單用氙氣或亞低溫組，比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

2.2 各組OPCs增殖率的比較 Ctrl組、OGD Ctrl組、Xe組、HT組、Xe+HT組OPCs增殖率分別為（53.6±3.05）%、（47.6± 2.51）%、（56.0±5.57）%、（48.3±7.76）%、（49.0±4.05）%，方差分析顯示各組OPCs增殖率比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.3 氙氣或/和亞低溫處理改善OPCs糖氧剝奪損傷對(duì)分化的影響 正常對(duì)照組細(xì)胞呈健康生長，有明顯的三級(jí)以上分支的較長網(wǎng)狀突起形成，計(jì)算成熟細(xì)胞率為（81.0±4.58）%；OGD對(duì)照組細(xì)胞細(xì)胞突起短少而紊亂，次級(jí)以上分支減少，成熟細(xì)胞率為（14.6±3.51）%，OGD對(duì)照組與正常對(duì)照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。氙氣組成熟細(xì)胞率（43.6±3.51）%比OGD對(duì)照組高，低于亞低溫組（53.3±3.21）%，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。聯(lián)合治療組成熟細(xì)胞率為（64.6±4.16）%，顯著高于單用氙氣或亞低溫組（P＜0.05）。見圖1。

圖1 各組細(xì)胞分化培養(yǎng)5 d后成熟細(xì)胞率（%）

3 討論

亞低溫療法是目前唯一被循證醫(yī)學(xué)證實(shí)的能改善新生兒缺氧缺血性腦病神經(jīng)系統(tǒng)預(yù)后的治療方法，即通過人工誘導(dǎo)方法將體溫下降3℃～5℃，在生后6 h內(nèi)實(shí)施亞低溫療法并持續(xù)72 h，維持體溫在32℃～34℃。亞低溫可抑制缺氧缺血所致生化級(jí)聯(lián)反應(yīng)中的眾多環(huán)節(jié)，多途徑和多靶點(diǎn)對(duì)腦組織的保護(hù)。但是對(duì)重癥HIE的療效仍很差。

氙氣是最穩(wěn)定的惰性氣體，在體內(nèi)不進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化，無毒性和致癌性，吸入后仍以原形式經(jīng)肺呼出。其不僅是理想的吸入麻醉劑，同時(shí)具有良好的器官保護(hù)作用，對(duì)腦的保護(hù)作用尤其突出。在新生動(dòng)物中，低于麻醉濃度的氙氣具有顯著的神經(jīng)保護(hù)特性并可以與治療性亞低溫起協(xié)同作用。氙氣能預(yù)防缺血、神經(jīng)興奮性毒素及心肺轉(zhuǎn)流所導(dǎo)致的急性神經(jīng)損傷的形態(tài)與功能學(xué)變化。體內(nèi)外動(dòng)物實(shí)驗(yàn)亦發(fā)現(xiàn)氙氣聯(lián)合亞低溫比單用二者的任何一種，具有更好的神經(jīng)保護(hù)作用，顯著地改善了神經(jīng)系統(tǒng)的長期預(yù)后，其保護(hù)機(jī)制可能與抗凋亡有關(guān)［9-10］。

本研究發(fā)現(xiàn)，在體外培養(yǎng)的少突膠質(zhì)前體細(xì)胞糖氧剝奪損傷的模型中，氙氣或/和亞低溫并不影響OPCs的增殖，但是單用氙氣或亞低溫處理都能減少損傷后OPCs的凋亡，并促進(jìn)OPCs分化過程中突起的發(fā)育和成熟，氙氣與亞低溫聯(lián)合使用能增強(qiáng)這種保護(hù)作用。OPCs的存活率及是否能正常分化是決定髓鞘能否正常發(fā)育的重要因素。本研究結(jié)果提示，氙氣聯(lián)合亞低溫治療可能在新生兒缺血缺氧性腦損傷時(shí)不僅保護(hù)神經(jīng)元，也可保護(hù)OPCs，抑制其凋亡，促進(jìn)其分化成熟，從而改善髓鞘化障礙，改善患兒的神經(jīng)系統(tǒng)預(yù)后。進(jìn)一步的研究將來可在體內(nèi)的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中繼續(xù)證實(shí)。

[1] Jacobs SE,Berg M,Hunt R,et al.Cooling for newborns with hypoxic ischaemic encephalopathy[J].Cochrane Database Syst Rev,2013,1 (4):CD 003311.

[2] 楊傳忠,朱小瑜.亞低溫治療與腦保護(hù)[J].中華實(shí)用兒科臨床雜志,2014,29(2):86-89.

[3] 吉玲,朱長連,程秀永,等.全身亞低溫治療新生兒缺氧缺血性腦病的療效分析[J].中國實(shí)用兒科雜志,2007,22(8):609-611.

[4] Sabir H,Walloe L,Dingley J,et al.Combined treatment of xenon and hypothermia in newborn rats--additive or synergistic effect?[J].PLoS One,2014,9(10):e 109845.

[5] 呂黃偉，王俊科.氙氣介導(dǎo)心臟和神經(jīng)預(yù)處理的機(jī)制[J].中國新藥與臨床雜志,2007,26(2):147-150.

[6] Volpe JJ.Brain injury in premature infants:a complex amalgam of destructive and developmental disturbances[J].Lancet Neurology, 2009,8(1):110-124.

[7] Back SA,Rosenberg PA.Pathophysiology of glia in perinatal white matter injury[J].Glia,2014,62(11):1790-1815.

[8] Chen Y,Balasubramaniyan V,Peng J,et al.Isolation and culture of rat and mouse oligodendrocyte precursor cells[J].Nat Protoc,2007, 2(5):1044-1051.

[9] 陳盛,郭松雪,洪遠(yuǎn),等.惰性氣體神經(jīng)保護(hù)作用的研究進(jìn)展[J].浙江大學(xué)學(xué)報(bào)（醫(yī)學(xué)版）,2011,40(1):101-106.

[10] Chankkarapani E,Dingley J,Liu X,et al.Xenon enhances hypothermic neuropretection in asphyxiated newborn pigs[J].Ann Neurol,2010,68(3):330-341.

10.3969/j.issn.1009-4393.2016.1.012

廣州醫(yī)科大學(xué)留學(xué)歸國人員基金項(xiàng)目（2010 C 31）

廣東 510260 廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院新生兒科（孫軼 袁艷冰 劉放云 劉海燕）