饒桂榮　張換敬　石燕飛　黃　彬　王洪敏　楊富強　陳光明

(解放軍第四五八醫(yī)院全軍肝病中心，廣州510600)

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抗結(jié)核分枝桿菌DNA疫苗的構(gòu)建及免疫原性研究①

饒桂榮張換敬石燕飛黃彬王洪敏楊富強陳光明

(解放軍第四五八醫(yī)院全軍肝病中心，廣州510600)

[摘要]目的：構(gòu)建抗結(jié)核分枝桿菌(TB)DNA疫苗并進行體內(nèi)外的鑒定。方法：采用PCR技術(shù)分別擴增TB (H37Rv) 抗原單基因Ag85a、Ag85b以及融合基因 Ag85a-Esat6和Ag85b-Esat6融合基因，其5′端均含人粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)信號肽，將目的基因分別亞克隆于pVAX1真核表達載體，得到Ag85a/pVAX1、Ag85b/pVAX1、Ag85a-Esat6/pVAX1和Ag85b-Esat6/pVAX1四種質(zhì)粒；經(jīng)酶切和測序鑒定正確后，質(zhì)粒轉(zhuǎn)染COS-7細胞48 h，取上清液檢測目的蛋白表達情況；利用在體電脈沖技術(shù)(EP)將質(zhì)粒注射BALB/c小鼠雙側(cè)脛前肌，檢測特異性的體液和細胞免疫應(yīng)答。結(jié)果：四種質(zhì)?；蚱畏较颉⑿蛄姓_；Western blot檢測COS-7細胞轉(zhuǎn)染48 h后的上清，均有清晰特異性的目的蛋白條帶，并定量檢測到Esat6蛋白的表達水平可達10 ng/ml；小鼠免疫實驗結(jié)果表明，僅質(zhì)粒Ag85b/pVAX1和Ag85a-Esat6/pVAX1可誘導(dǎo)針對結(jié)核抗原分泌高水平IFN-γ的Th1型免疫應(yīng)答和特異性殺傷應(yīng)答，其中通過ELISA檢測小鼠血清的lgG和ELISPOT檢測脾細胞分泌IFN-γ的實驗結(jié)果陽性率均為100%，且Ag85a-Esat6/pVAX1的效果較好些，與卡介苗具有顯著性差異。結(jié)論：成功構(gòu)建了抗TB的DNA疫苗，其中Ag85a-Esat6/pVAX1質(zhì)粒DNA疫苗的免疫效果較好，為進一步研發(fā)治療性的TB DNA疫苗奠定基礎(chǔ)。

[關(guān)鍵詞]結(jié)核分枝桿菌； DNA疫苗；構(gòu)建；轉(zhuǎn)染；免疫

結(jié)核病是一種由結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis,TB)引起的嚴重危害人類健康的傳染性疾病?？ń槊?Bacille calmette guerin,BCG)自1921年發(fā)現(xiàn)以來一直受到人們的關(guān)注，是目前唯一上市用于兒童期結(jié)核病的預(yù)防，但是，卡介苗的保護效率隨時間的推移而逐漸降低，而且對于不同地區(qū)，不同人群，其保護率從0到80%不等。目前正在使用的卡介苗菌株都缺乏在致病結(jié)核桿菌和牛型結(jié)核分枝桿菌中存在的編碼某些有保護性免疫效應(yīng)的DNA片段，WHO已于1995年宣布BCG不是預(yù)防結(jié)核病的有效疫苗。20世紀40年代后相繼出現(xiàn)多種抗結(jié)核藥物(異煙肼、利福平等)，但這些藥物具有較多副作用，長期服用會導(dǎo)致TB菌株耐藥突變，使藥物治療效果大大降低。據(jù)世界衛(wèi)生組織(World Health Organization,WHO)2014年TB報告，全球每年大約有900萬新增結(jié)核病患者，150萬人死于結(jié)核病，其中36萬人同時感染HIV；我國是僅次于印度的結(jié)核病第二大流行國家，年發(fā)病人數(shù)達120萬[1]。

鑒于當前結(jié)核病流行的嚴重程度，以及不能有效預(yù)防和治療結(jié)核病，國內(nèi)外學者已經(jīng)開始了結(jié)核分枝桿菌多種新一代疫苗的研究，主要為三種新型疫苗：重組rBCG、DNA疫苗及亞單位疫苗、滅活的分枝桿菌M.vaccae和RUT1。其中DNA疫苗由于制備簡單，并且能誘導(dǎo)強烈的體液免疫和細胞免疫反應(yīng)，尤其是它可誘導(dǎo)特異性CTL反應(yīng)，使其在抗細胞內(nèi)感染中獨具優(yōu)勢，在治療結(jié)核病方面應(yīng)該更具有優(yōu)勢[2]。本文根據(jù)中國研究最多的三種抗原Ag85a、Ag85b和Esat6[3]，構(gòu)建了四種抗TB DNA疫苗Ag85a/pVAX1、Ag85b/pVAX1、Ag85a-Esat6/pVAX1和Ag85b-Esat6/pVAX1，分別進行體液免疫和細胞免疫檢測實驗，以期篩選出一種高效且特異性強的抗TB的DNA疫苗。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1主要試劑限制性內(nèi)切酶、pfu聚合酶和T4 DNA連接酶均購自大連寶生物公司；COS-7細胞株為本實驗保存；pVAX1載體、Lipofecta mineTM2000 轉(zhuǎn)染試劑購自Invitrogen公司； Mouse IFN-γ ELISPOT Kit購自BD公司；植物凝血素(PHA)、淋巴細胞分離液和牛血清蛋白(BSA)均購自Sigma公司；Ag85a和Ag85b抗原購自Prospec公司；二抗Goat polyclonal secondary antibody to mouse lgG(HRP), Goat Anti-Mouse IgG1 heavy chain(HRP),Goat Anti-Mouse IgG2a heavy chain(HRP)購自abcam公司；細菌基因組提取試劑盒購自天根公司；質(zhì)粒中提試劑盒購自Qiagen公司；人結(jié)核分枝桿菌特異性蛋白ESAT6(MTB ESAT6)ELISA檢測試劑盒購自上?？ㄅ荆黄?nèi)注射用卡介苗(上海生物制品責任有限公司)由廣州市疾病預(yù)防控制中心提供。

1.1.2菌株和實驗動物結(jié)核分枝桿菌株H37Rv標準株由廣州市胸科醫(yī)院譚守勇教授惠贈，使用前已于121℃，5分鐘高溫滅活；大腸桿菌DH5ɑ由本室保存；BALB/c小鼠購自中山大學實驗動物中心，雌性，6～8周齡，18～20 g，SPFⅢ級。

1.2方法

1.2.1質(zhì)粒構(gòu)建

1.2.1.1Ag85a/pVAX1和Ag85b/pVAX1單基因質(zhì)粒構(gòu)建為了增強目的基因的表達，在上游引物添加KOZAK系列(即ANNATGG，-3為A，+4為G)，設(shè)計了Ag85a上游引物Ag85a-F1：5′-CGGGATCCAGGATGGGGCTGCAGAGCCTGCTGCTCTTG-GGCACTGTGGCCTGCAGCATCTCTCAGCTTGTTGAC-AGGG-TT-3′，下游引物Ag85a-R1：5′-GGTCTAGACTAGGCGCCCTGGGGCGC-3′； Ag85b上游引物Ag85b-F1：5′-CGGGATCCAGGATGGGGCTGCAGA-GCCTGCTGCTCTTGGGCACTGTGGCCTGCAGCATCT-CTACAGACGTGAGCCGAAAG-3′，下游引物Ag85b-R1：5′- GGTCTAGACTAGCCGGCGCCTAACGA-3′。上、下游引物5′端分別引入BamHⅠ和XbaⅠ酶切位點。上游引物還引入人粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(Ganulocyte-macrophage colony stimulating factor,GM-CSF)信號肽，以增強蛋白的分泌表達。引物由上海生工生物公司合成。以H37Rv菌株基因組為模板， PCR條件按95℃ 5 min，95℃ 50 s，55℃ 50 s，72℃ 60 s，30個循環(huán)，72℃ 5 min進行。凝膠電泳并回收PCR產(chǎn)物片段，以BamHⅠ和XbaⅠ進行雙酶切，并和同樣雙酶切的pVAX1載體4℃過夜連接。按常規(guī)方法將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞DH5ɑ，挑取單菌落液體PCR擴增、酶切和測序鑒定。

1.2.1.2Ag85a-Esat6/pVAX1和Ag85b-Esat6/pVAX1融合基因質(zhì)粒的構(gòu)建設(shè)計PCR引物， Ag85a-F2：5′-CGGGATCCAGGATGGGGCTGCAGAG-3′， Ag85a-R2：5′-ACACGAACCCCCGCCTCCTGACCCGGCGCCCTGGGGCGC-3′；Ag85b-F2：5′-CGGG-ATCCAGGATGGGGGCTGCAG-3′，Ag85b-R2：5′-AC-ACGAACCCCCGCCTCCTGACCCGCCGGCGCCTAAC-GA-3′；Esat6-F1:5′-CGGGATCCAGGATGGCAGAGCAGCAGTGGAATTTC-3′，Esat6-R1：5′-GGTCTA-GACTACTGCAGCGCGTTGTTCAGC-3′。Esat6-F2：5′-GGGTCAGGAGGCGGGGGTTCGTGTATGACAGA-GCA-GCAGTGGAATTTC-3′，Esat6-R2：5′-GGTCTAGACTACTGCAGCGCGTTGTTCAGC-3′。其中斜體為Linker序列(G5S2C1)，下劃線為BamHⅠ和XbaⅠ酶切位點。首先使用Esat6-F1和Esat6-R1把Esat6單基因擴增出來，然后使用重疊引物PCR、酶切、連接等(方法同1.2.1.1)將單基因質(zhì)粒Ag85a和Ag85b分別與Esat6連接，克隆到pVAX1載體，Ag85a-Esat6/pVAX1和Ag85b-Esat6/pVAX1融合基因質(zhì)粒。

1.2.24種重組質(zhì)粒的細胞轉(zhuǎn)染和Western blot檢測參照Invitrogen 公司脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑Lipofecta mineTM2000操作說明進行。COS-7細胞株按常規(guī)方法培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基中，轉(zhuǎn)染前24 h用胰酶消化貼壁細胞，重懸于含血清RPMI1640培養(yǎng)基，按3×105細胞/孔轉(zhuǎn)種于6孔培養(yǎng)板中，待細胞生長至90%～95%融合度時，分別取4 μg純化質(zhì)粒Ag85a/pVAX1、Ag85b/pVAX1、Ag85a-Esat6/pVAX1和Ag85b-Esat6/pVAX1和10 μl轉(zhuǎn)染試劑進行轉(zhuǎn)染，同時設(shè)未轉(zhuǎn)染細胞為空白對照。轉(zhuǎn)染48 h后收集上清，對目的蛋白Ag85a或Ag85b進行Western blot檢測，對目的蛋白Esat6進行ELISA檢測。

1.2.3在體電脈沖(invivoelectroporation,EP)輔助質(zhì)粒免疫健康BALB/c小鼠60只BALB/c小鼠隨機分為6組，每組10只。第1組為生理鹽水對照組，第2組為卡介苗(1×105CFU)陽性對照組，第3組為Ag85a組，第4組為Ag85b組，第5組為Ag85a-Esat6組,第6組為Ag85b-Esat6組，劑量均為20 μg/只。采用EP技術(shù)注射小鼠雙側(cè)脛前肌。初次免疫后第14天，以同樣方法及劑量增強免疫各組小鼠1次，并于初次免疫后第28天，采用眼球后靜脈叢穿刺法采血，ELISA測血清中抗-Ag85a或抗-Ag85b水平，再處死小鼠取脾臟淋巴細胞作ELISPOT檢測。ELISPOT檢測嚴格按BD公司試劑盒使用說明書方法操作。陽性判斷標準：同一淋巴細胞密度(3×105個/孔)條件下，ELISPOT檢測板中同一樣品的抗原刺激與非抗原刺激的各3個復(fù)孔斑點均數(shù)(SFC)的差值應(yīng)不小于5或比值應(yīng)不小于2；TB DNA疫苗免疫組的細胞免疫應(yīng)答陽性率應(yīng)不低于60%。

1.3統(tǒng)計學結(jié)果處理用SPSS12.0軟件進行統(tǒng)計分析，組間率比較用Fisher確切概率檢驗，P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2結(jié)果

2.1TB DNA疫苗的構(gòu)建PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后可見明顯目的條帶，其中Ag85a、Ag85b、Esat6、Ag85a-Esat6和Ag85b-Esat6大小分別約為1 100、1 100、200、1 300和1 300 bp，結(jié)果見圖1。與載體pVAX1連接所建的重組質(zhì)粒經(jīng)酶切和測序鑒定正確，結(jié)果見圖2。

2.2重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細胞與蛋白表達鑒定用Western blot方法檢測目的蛋白Ag85(Ag85a或Ag85b)在COS-7細胞轉(zhuǎn)染48 h后表達情況，結(jié)果表明，實驗組均有清晰特異性的目的蛋白條帶，無質(zhì)粒轉(zhuǎn)染空白組未檢測到目的條帶，說明質(zhì)粒在細胞內(nèi)成功表達并分泌到細胞外。見圖3。用ELISA檢測目的蛋白Esat6的定量表達，Ag85a-Esat6質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組中轉(zhuǎn)染上清的Esat6蛋白檢測含量為(14.2±2.1)ng/ml，Ag85b-Esat6質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組為(4.7±1.0)ng/ml，空白質(zhì)粒組未檢測出Esat6。結(jié)果見圖4。

圖1　PCR產(chǎn)物電泳圖譜Fig.1　Electrophoretogram of PCR productionsNote: To each figure:Lane1.DL2000;Lane2.PCR product-ion.A.Ag85a;B.Ag85b;C.Esat6;D.Ag85a-Esat6;E.Ag85b-Esat6.To each figure:Lane 1.DL2000;Lane 2.PCR production.

圖2　重組質(zhì)粒酶切圖譜Fig.2　Restriction digestion maps of recombination plasmids Note: A.Ag85a;B.Ag85b;C.Ag85a-Esat6;D.Ag85b-Esat6.To each figure:Lane 1.DL2000;Lane 2.products digested by BamHⅠ and XbaⅠ including vector pVAX1 and target gene.

圖3　轉(zhuǎn)染COS-7細胞后上清的Western blot圖譜Fig.3　Western blot map of supernatants of transfected COS-7Note: 1.Normal group;2.Ag85a;3.Ag85b;4.Ag85a-Esat6;5.Ag85b-Esat6.

圖4　質(zhì)粒Ag85a-Esat6和Ag85b-Esat6轉(zhuǎn)染上清中Esat6的含量Fig.4　Concentration of Esat6 in supernatants of COS-7 transfected with Ag85a-Esat6 and Ag85b-Esat6

表1ELISA測定IgG抗體平均滴度GMT結(jié)果

Tab.1GMT of ELISA detecting antigen specific IgG

GroupsPositiveratioofserumantibodyGeometricMeanTiters(GMT)ofAg85aspecificIgGBCG(105CFU)8/10 900±702Ag85a8/10 802±55Ag85b10/101007±325Ag85a-Esat610/101600±8761)Ag85b-Esat66/10 722±112

Note：GMT of Saline group was less than 100；1)P<0.05.

圖5　各組ELISPOT斑點計數(shù)結(jié)果Fig.5　SFC results of each group

圖6　各組ELISPOT斑點直觀圖Fig.6　ELISPOT images of each groupNote: A.Negative;B.PHA;C.Saline;D.BCG;E.Ag85a;F.Ag85b;G.Ag85a-Esat6；H.Ag85b-Esat6.

表2Ag85a-Esat6/pVAX1產(chǎn)生的特異性抗體亞型分析

Tab.2Subtype analysis of Ag85a specific IgG induced by Ag85a-Esat6/pVAX1

TBDNAVaccineGeometicMeanTiters(GMT)ofdifferentsubtypesofAg85aspecificIgGIgGIgG1IgG2aG2a/G1Ag85a-Esat6Prime800±01270±13851345±11311.06Boost1393±9802786±26294222±22631.52

表3ELISPOT檢測結(jié)果

Tab.3Results of ELISOPT

GroupsSpotsofstimulatedholesminusnon-stimulatedholesPositiveratioBCG(105CFU)95.1±12.86/10Ag85a80.2±29.68/10Ag85b218.9±14.210/10Ag85a-Esat6302.9±19.51)10/10Ag85b-Esat618.8±6.72/10

Note：Saline groups spots of stimulated holes minus non-stimulated holes 0,positive ratio was 0，1)P<0.05.

2.3ELISA法測定小鼠血清特異性抗-Ag85a或抗-Ag85b的抗體水平加強免疫小鼠2周后用ELISA方法檢測動物血清抗-Ag85蛋白含量，由表1可知Ag85a、Ag85b、Ag85a-Esat6和Ag85b-Esat6組產(chǎn)生的抗體陽性率分別為80%、100%、100%、60%，BCG組陽性率80%；動物血清特異性抗Ag85a的IgG抗體平均滴度GMT分別為802±55、1 007±325、1 600±876、722±112，與卡介苗組(900±702)比較具有顯著性差異(P<0.05)。進一步分析Ag85a-Esat6組產(chǎn)生的特異性抗體亞型，其IgG2a/IgG1>1,并于加強免疫后，IgG2a/IgG1值升高，表明主要誘導(dǎo)Th1型免疫應(yīng)答并得到加強，結(jié)果見表2。

2.4ELISPOT法測定小鼠脾淋巴細胞分泌IFN-γ的活性Ag85a/pVAX1、Ag85b/pVAX1、Ag85a-Esat6/pVAX1和Ag85b-Esat6/pVAX1這4組質(zhì)粒DNA免疫注射小鼠后，脾細胞中特異性分泌IFN-γ的陽性細胞數(shù)見表3，分別為80%、100%、100%和20%，斑點計數(shù)和直觀圖分別見圖5、6；可以看出，Ag85b/pVAX1和Ag85a-Esat6/pVAX1兩組的免疫效果較好，表明這兩種質(zhì)粒誘導(dǎo)出的特異性的細胞免疫應(yīng)答反應(yīng)效果較佳，其中以Ag85a-Esat6/pVAX1組的斑點數(shù)較多，免疫效果最好，且與卡介苗組比較具有顯著性差異(P<0.05)，

3討論

當前結(jié)核病流行程度較為嚴重，再加上與HIV共感染以及未有一種有效的預(yù)防和治療措施，使結(jié)核病的防治工作迫在眉睫。英國Lowrie等[4,5]首次將DNA疫苗用于結(jié)核病的治療，開拓了TB DNA疫苗的研究工作，其實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)IL-12和HSP65 DNA疫苗可有效增加小鼠對結(jié)核桿菌的清除率，說明HSP65 DNA疫苗通過激活Th1 型的細胞免疫反應(yīng)發(fā)揮作用，隨后該研究小組還對TB感染的小鼠進行藥物治療后建立了潛伏感染模型，發(fā)現(xiàn)HSP65 DNA疫苗和藥物聯(lián)合使用，對感染小鼠具有很好治療效果；Huygen等[6]報道了用結(jié)核分支桿菌Ag85編碼基因的質(zhì)粒DNA免疫小鼠，可誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生很強的細胞和體液免疫反應(yīng)，抵御活結(jié)核分支桿菌和BCG的攻擊。Lozes等[7]證明了Ag85a質(zhì)粒DNA免疫的BALB/c和C57BL/6小鼠的脾細胞培養(yǎng)上清液中，IL-2、IFN-γ和TNF-α水平顯著高于BCG免疫鼠，Ag85b DNA能產(chǎn)生與Ag85a類似的效果，而Ag85c DNA質(zhì)粒對小鼠無保護作用；韓國科學家Ha等[8]將Ag85a和IL-12N220L DNA疫苗結(jié)合藥物異煙肼和吡嗪酰胺治療C57BL/6J小鼠結(jié)核病模型，Ag85a DNA疫苗和藥物聯(lián)合治療組優(yōu)于單純藥物組。我國科學家對抗結(jié)核病DNA疫苗也做了較多深入研究。北京309醫(yī)院吳雪瓊等[9,10]首先進行Ag85a DNA疫苗的研究。隨后與李忠明等聯(lián)合研究一種嵌合型DNA疫苗，即將兩種結(jié)核桿菌的抗原蛋白基因嵌合在同一個載體上，該實驗室的梁艷等先后驗證了Ag85a、Ag85a/ Esat、Ag85a/B嵌合質(zhì)粒DNA疫苗對耐藥結(jié)核桿菌的治療作用，實驗結(jié)果表明，DNA疫苗和藥物聯(lián)合使用能夠顯著提高藥物對耐藥結(jié)核桿菌的治療效果[11,12]。綜上所述，目前研究已有多種結(jié)核DNA疫苗可誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生有效的免疫保護，但仍沒有一種治療性DNA疫苗在臨床的驗證。

與上述國內(nèi)外TB疫苗研究不同，本研究構(gòu)建的TB DNA疫苗特點包括：①根據(jù)2012年Lowrie[3]統(tǒng)計中國TB疫苗研究最多的抗原數(shù)據(jù)，優(yōu)選Ag85a、Ag85b、Esat6為目的抗原基因。Ag85a和Ag85b是結(jié)核分枝桿菌和BCG的主要分泌性蛋白，也是結(jié)核桿菌重要的保護性抗原，能刺激細胞免疫反應(yīng)，又能誘導(dǎo)體液免疫反應(yīng)，二者均有特異性T細胞識別位點，可刺激記憶T細胞的產(chǎn)生，可誘導(dǎo)細胞因子分泌水平提高和產(chǎn)生CTL活性[13]。Esat6，又稱Rv3875，在減毒株中沒有這種抗原成分，它是重要的T細胞抗原，含有多個T細胞表位，在抗Mtb的保護性免疫應(yīng)答中起重要作用，是免疫記憶應(yīng)答中的主要靶抗原之一[14]；②本文構(gòu)建4種質(zhì)粒中，Ag85a-Esat6/pVAX1誘導(dǎo)的細胞和體液免疫最強。該質(zhì)粒為一種融合型 TB DNA疫苗，并在基因的5′端引入GM-CSF信號肽，可以提高蛋白的分泌，增強免疫效果；③載體采用美國FDA批準的唯一用于臨床試驗的DNA疫苗載體pVAX1作為DNA疫苗載體，不含SV40病毒復(fù)制基因，不含AMP抗性基因，僅有Kana抗性基因，較其他含有多個細菌基因組元件的載體如pcDNA3.1、pJW4303、pCI-neo等較安全；④采用肌注聯(lián)合EP電轉(zhuǎn)染技術(shù)導(dǎo)入質(zhì)粒，其作用機制是使細胞膜雙層磷脂結(jié)構(gòu)在電場的作用下發(fā)生改變，形成瞬間可逆的微孔，使得外源大分子得以進入細胞，較大提高質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染率，并且具有簡單實用，易于推廣等優(yōu)點，有可能成為基因?qū)敕椒ㄖ械囊豁椫鲗?dǎo)性技術(shù)。

本文實驗結(jié)果提示，Ag85a和Esat6蛋白具有協(xié)同促進的作用，Ag85a-Esat6/pVAX1質(zhì)粒體液和細胞免疫反應(yīng)最強，為臨床治療結(jié)核病DNA疫苗的研究提供重要參考。但本研究也發(fā)現(xiàn)Ag85b-Esat6/pVAX1效果并不如卡介苗和Ag85b/pVAX1，可能是因為Ag85b和Esat6兩種蛋白融合后空間構(gòu)象有所改變而沒有協(xié)同促進作用。關(guān)于Ag85a-Esat6/pVAX1對TB感染動物模型治療和預(yù)防作用的實驗研究目前正在進行中。

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[收稿2015-09-20修回2015-12-25]

(編輯許四平)

Construction and immunogenicity research on a therapeutic DNA vaccine of Mycobacterium Tuberculosis

RAOGui-Rong,ZHANGHuan-Jing,SHIYan-Fei,HUANGBin,YANGFu-Qiang,WANGHong-Min，CHENGuang-Ming.

InfectiousDiseaseCenter,the458thHospitalofPLA,Guangzhou510600,China

[Abstract]Objective:To develop effective therapeutic Mycobacterium Tuberculosis(TB) DNA vaccines and research their immune activity in vitro and in vivo.Methods: TB (H37Rv) antigen genes Ag85a,Ag85b,Ag85a-Esat6 and Ag85b-Esat6 fusion gene,whose 5′ terminal have gene encoding human granulocyte colony stimulating factor(GM-CSF),were amplified by PCR.Then these genes were subcloned into eukaryotic vector pVAX1,which were respectively named Ag85a/pVAX1,Ag85b/pVAX1,Ag85a-Esat6/pVAX1 and Ag85b-Esat6/pVAX1.The new plasmids were analyzed by restriction digestion and DNA sequencing.The plasmids were transfected into COS-7 cells in vitro with Lipofecta mineTM2000.At 48 h after trasfection,the supernatants were analysised by Western Blot and Elisa.The plasmids were injected into BALB/c mice by electroporation in situ and specific humoral and cellular immune responses were exa mined.Results: The four plasmids were constructed correctly by genetic analysis.At 48 h after transfection,Ag85a,Ag85b,Ag85a-Esat6 and Ag85b-Esat6 genes expressed respectively,and objestive proteins were detected by Western blot clearly specially.It was up to 10 ng/ml in supernatants detected by ELISA of Esat6.Experiment performed in BALB/c mice injected with only plasmids Ag85a-Esat6/pVAX1 or Ag85b/pVAX1 showed,protective antibodies of Ag85a or Ag85b were produced,and Ag85a or Ag85b specific killing response and Th1-type immune response with high level of IFN-γ were also induced.Positive ratios were both 100% in ELISA detecting anti-Ag85a or anti-Ag85b IgG and ELISPOT detecting specific spleenocytes secreting IFN-γ.The plasmid Ag85a-Esat6/pVAX1 had better immune efficacy than Ag85b/pVAX1 and significant deference from BCG.Conclusion: The TB DNA vaccines were constructed successfully,and Ag85a-Esat6/pVAX1 induced the most strong specific immune activity in vitro and in vivo.

[Key words]Mycobacterium Tuberculosis;DNA vaccine;Construction;Transfection;Immunity

doi:10.3969/j.issn.1000-484X.2016.05.018

作者簡介：饒桂榮(1974年-),女,碩士，副主任藥師，主要從事免疫治療機理研究和及生物新藥研發(fā)工作，E-mail:raogr@126.com。指導(dǎo)教師：楊富強(1965年-),男,博士，主任醫(yī)師，主要從事免疫治療機理研究和腫瘤生物治療研究，E-mail:yangfq23@163.com。

中圖分類號R392.33

文獻標志碼A

文章編號1000-484X(2016)05-0682-06

①本文為廣東省科技計劃項目(No.2015A010107011)。