魏立民，章冬梅，何學(xué)峰，呂秀芹，劉　娜

(河北省人民醫(yī)院內(nèi)分泌科，石家莊 050051)

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論著·基礎(chǔ)研究

八肽膽囊收縮素對(duì)游離脂肪酸損傷胰島β細(xì)胞氧化應(yīng)激的影響*

魏立民，章冬梅，何學(xué)峰，呂秀芹，劉娜

(河北省人民醫(yī)院內(nèi)分泌科，石家莊 050051)

[摘要]目的觀察八肽膽囊收縮素(CCK-8)對(duì)游離脂肪酸(FFAs)損傷的小鼠胰島β細(xì)胞(本文為NIT-1細(xì)胞株)氧化應(yīng)激及細(xì)胞增殖的影響，探討CCK-8對(duì)胰島β細(xì)胞保護(hù)作用的機(jī)制。方法將培養(yǎng)良好的NIT-1細(xì)胞分為對(duì)照組、FFAs組(加入0.25 mmol/L油酸+0.25 mmol/L軟脂酸)、CCK-8組(FFAs組基礎(chǔ)上同時(shí)加入1×10-8mmol/L CCK-8)，分別培養(yǎng)48 h 和72 h，觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)，MTT比色法檢測(cè)細(xì)胞增殖能力，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率，檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清液總抗氧化能力(T-AOC)，谷胱甘肽還原酶(GSH-Px)、過(guò)氧化氫酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)及丙二醛(MDA)活性。結(jié)果FFAs組顯微鏡下可見(jiàn)較多細(xì)胞碎片，CCK-8組細(xì)胞碎片明顯減少；與FFAs組比較，48 h和72 h CCK-8組的光密度(OD)570值顯著增高(均P<0.01)，與CCK-8處理48 h比較，72 h組OD570值明顯增高(P<0.01)；與FFAs組比較， CCK-8組細(xì)胞上清液CAT、T-AOC、SOD及GSH-Px活性均明顯增高，MDA含量降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；72 h CCK-8組較48 h組CAT、SOD活性增加，MDA含量降低。結(jié)論CCK-8對(duì)FFAs損傷的胰島β細(xì)胞具有一定的抗氧化應(yīng)激作用，同時(shí)CCK-8能夠顯著刺激NIT-1細(xì)胞的增殖。

[關(guān)鍵詞]膽囊收縮素；胰島素分泌細(xì)胞；氧化性應(yīng)激；細(xì)胞增殖；脂肪酸類(lèi),非酯化

糖尿病是嚴(yán)重影響人類(lèi)健康的一種內(nèi)分泌紊亂，其發(fā)病率在發(fā)展中國(guó)家增長(zhǎng)迅速，并且在未來(lái)的20年仍將持續(xù)增加。以往的研究表明，血糖代謝紊亂時(shí)通常伴隨著活性氧(reactive oxygen species，ROS)產(chǎn)生過(guò)量導(dǎo)致的氧化應(yīng)激，這種應(yīng)激表現(xiàn)為機(jī)體氧化和抗氧化系統(tǒng)間的失衡，在胰島β細(xì)胞功能的衰退中起著重要的作用[1]。因此，通過(guò)抗氧化機(jī)制保護(hù)胰島β細(xì)胞功能也是糖尿病治療的策略之一。膽囊收縮素(cholecystokinin，CCK)是由小腸黏膜Ⅰ細(xì)胞釋放的一種肽類(lèi)激素，8肽膽囊收縮素(CCK-8)為其主要形式。以往的研究表明，CCK具有刺激胰島素分泌、抑制胰島β細(xì)胞凋亡等作用，具有對(duì)損傷后胰島β細(xì)胞的保護(hù)作用，但還沒(méi)有研究表明這種作用是否存在抗氧化應(yīng)激機(jī)制。本研究旨在觀察CCK-8對(duì)游離脂肪酸(FFAs)損傷的小鼠胰島β細(xì)胞(本文為NIT-1細(xì)胞株)氧化應(yīng)激及細(xì)胞增殖能力的影響。

1材料與方法

1.1材料NIT-1細(xì)胞為本實(shí)驗(yàn)室保存。油酸、軟脂酸、CCK-8均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司?？偪寡趸芰?T-AOC)、谷胱甘肽還原酶(GSH-Px)、過(guò)氧化氫酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)及丙二醛(MDA)活性檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程公司。其余試劑均為分析純。

1.2方法

1.2.1NIT-1細(xì)胞培養(yǎng)采用含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基，將培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的NIT-1細(xì)胞用胰酶消化成單細(xì)胞懸液，以2×104的密度接種于96孔培養(yǎng)板中，換用含有5%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基，于95%空氣、5% CO2、37 ℃、飽和濕度條件下培養(yǎng)。

1.2.2分組將培養(yǎng)至貼壁良好的NIT-1細(xì)胞分為對(duì)照組、FFAs組(加入0.25 mmol/L油酸+0.25 mmol/L軟脂酸)、CCK-8組(FFAs組基礎(chǔ)上同時(shí)加入1×10-8mmol/L CCK-8)。37 ℃、5% CO2條件下分別培養(yǎng)48 h 和72 h，觀察各組細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)，并留取上清液待測(cè)。

1.2.3MTT比色法檢測(cè)細(xì)胞增殖能力處理好的細(xì)胞，每孔加5 mmol/L的MTT液20 μL稍搖勻后繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄培養(yǎng)液，各孔加150 μL 二甲基亞砜，振蕩器上振蕩10 min，然后置于酶標(biāo)儀中測(cè)570 nm波長(zhǎng)的光密度(OD)值，結(jié)果以O(shè)D值表示。

1.2.4細(xì)胞凋亡率的測(cè)定消化貼壁細(xì)胞，離心、回收細(xì)胞，用Hank′s液洗1～2次，將細(xì)胞以70%乙醇4 ℃固定12 h以上。再用Hank′s液洗2次后，懸浮于0.5 mL Hank′s液中。加Rnase A(終濃度100 mg/L)，37 ℃溫育30 min。加入PI(終濃度50 mg/L)，4 ℃避光染色45 min后，300目尼龍網(wǎng)過(guò)濾。上流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞凋亡率。

1.2.5氧化應(yīng)激指標(biāo)的測(cè)定T-AOC、GSH-Px、CAT、SOD及MDA活性，均應(yīng)用上清液標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)，測(cè)定方法：T-AOC采用還原法；GSH-Px采用二硫代二硝基苯甲酸法；CAT采用分光光度法；SOD采用WST法；MDA采用硫代巴比妥酸比色法(TBA法)。試劑盒由專(zhuān)人按說(shuō)明要求進(jìn)行檢測(cè)，T-AOC、GSH-Px、CAT、SOD酶活性及MDA測(cè)定試劑批內(nèi)及批間變異系數(shù)分別為5.7%和7.0%、3.7%和9.3%、4.1%和7.9%、3.2%和3.7%。

2結(jié)果

2.1NIT-1細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)觀察 對(duì)照組細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好，F(xiàn)FAs組細(xì)胞培養(yǎng)基內(nèi)渾濁，顯微鏡下觀察可見(jiàn)較多細(xì)胞碎片，CCK-8組培養(yǎng)基內(nèi)細(xì)胞碎片明顯減少。

2.2CCK-8對(duì)NIT-1胰島β細(xì)胞增殖的影響MTT檢測(cè)結(jié)果顯示，與FFAs相比，48 h和72 h CCK-8組的OD570值顯著增高(均P<0.01)；CCK-8組處理48 h與72 h比較，OD570值明顯增高(P<0.01)。見(jiàn)表1。

表1CCK-8對(duì)胰島素β細(xì)胞增殖的影響

組別48hOD570值72hOD570值對(duì)照組0.42±0.050.52±0.06FFAs組0.21±0.030.25±0.04CCK-8組0.33±0.04a0.44±0.06ab

a:P<0.01，與對(duì)照組和FFAs組比較；b:P<0.01，與48 h比較。

2.3CCK-8對(duì)NIT-1胰島β細(xì)胞凋亡的影響遺傳物質(zhì)DNA變化發(fā)現(xiàn)，在正常2倍體 DNA峰前均出現(xiàn)DNA 碎片峰，即凋亡峰。FFAs處理組的細(xì)胞凋亡率明顯增加(均P<0.01)；加入CCK-8的NIT-1細(xì)胞凋亡率較FFAs組明顯降低 (P<0.01)。見(jiàn)表2。

2.4氧化應(yīng)激及抗氧化應(yīng)激指標(biāo)與FFAs組比較，經(jīng)CCK-8處理48 h及72 h后細(xì)胞上清液CAT、T-AOC、SOD及GSH-Px活性均明顯增高，MDA含量降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；72 h CCK-8組較48 h CAT、SOD活性增加，MDA含量明顯降低，其余指標(biāo)變化不明顯。見(jiàn)表3。

表2　　CCK-8對(duì)NLT-1胰島素β細(xì)胞凋亡的影響

a:P<0.01，與對(duì)照組比較；b:P<0.01，與FFAs組比較。

表3　　CCK-8對(duì)氧化應(yīng)激指標(biāo)的影響

續(xù)表2　　CCK-8對(duì)氧化應(yīng)激指標(biāo)的影響

aP<0.01,c:P<0.05,與FFAs組比較；b:P<0.01,d:P<0.05,與48 h比較。

3討論

糖尿病是一種嚴(yán)重的內(nèi)分泌代謝紊亂性疾病，其特點(diǎn)是慢性高血糖和糖脂代謝、蛋白質(zhì)代謝異常，糖尿病發(fā)病的主要病理生理機(jī)制為胰島素分泌不足和胰島素抵抗。研究表明，氧化應(yīng)激是引起2型糖尿病發(fā)生、發(fā)展的重要因素，而高血糖是產(chǎn)生氧化應(yīng)激的主要原因[2]。氧化應(yīng)激會(huì)造成機(jī)體組織細(xì)胞及蛋白和核酸等生物大分子損傷[1,3]。氧化應(yīng)激的產(chǎn)生可直接損傷β細(xì)胞，特別是破壞細(xì)胞線粒體結(jié)構(gòu)，促進(jìn)β細(xì)胞凋亡；同時(shí)還可通過(guò)影響胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路間接抑制β細(xì)胞功能，如激活核轉(zhuǎn)錄因子κB(NF-κB) 信號(hào)通路，引起β細(xì)胞炎性反應(yīng)；抑制胰十二指腸同源盒因子1 (PDX-1)的核質(zhì)易位，抑制線粒體能量代謝，減少胰島素合成與分泌[4]。SOD為機(jī)體主要的自由基清除酶之一，糖代謝異常導(dǎo)致內(nèi)源性氧自由基清除劑SOD下降，同時(shí)SOD合成減少，氧自由基清除不足，反過(guò)來(lái)又進(jìn)一步抑制SOD的活性。SOD活性下降引發(fā)脂質(zhì)過(guò)氧化物在金屬離子存在下催化裂解產(chǎn)生MDA，MDA對(duì)細(xì)胞有毒性作用，可與蛋白質(zhì)分子內(nèi)和分子間交聯(lián)，誘發(fā)細(xì)胞凋亡[5]。氧化及抗氧化系統(tǒng)之間的失衡最終會(huì)導(dǎo)致胰島β細(xì)胞的損傷及凋亡。此外，β細(xì)胞抗氧化防御酶如SOD、CAT等水平較低，對(duì)自由基導(dǎo)致的損傷非常敏感也是其容易受損的原因之一。因此，避免胰島β細(xì)胞的氧化應(yīng)激損傷記憶，增加胰島素分泌可能是糖尿病治療中一個(gè)重要的方面。FFAs在糖尿病及其并發(fā)癥的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中起著重要的作用，其可導(dǎo)致糖代謝異常及胰島素抵抗，F(xiàn)FAs還可以通過(guò)炎癥、氧化應(yīng)激等機(jī)制導(dǎo)致胰島β細(xì)胞的損傷[6]。

本研究結(jié)果顯示，CCK-8與胰島β細(xì)胞共同孵育后可顯著降低FFAs誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激因子MDA的水平，提高抗氧化應(yīng)激防御酶SOD、CAT、T-AOC及GSH-Px的水平。本研究也第1次證實(shí)CCK-8對(duì)游離脂肪酸損傷的胰島β細(xì)胞有一定的抗氧化應(yīng)激作用。以往有研究報(bào)道，給予內(nèi)毒素休克大鼠模型CCK-8干預(yù)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)SOD水平在大鼠血中增加[7]；另一項(xiàng)研究表明CCK-8 可呈劑量依賴性抑制過(guò)氧亞硝基陰離子誘導(dǎo)的色素上皮細(xì)胞的氧化應(yīng)激，同時(shí)也顯著減少了色素上皮細(xì)胞的凋亡[8]。郝麗娜等[9]應(yīng)用腹腔注射鏈尿佐菌素制作大鼠糖尿病模型，并給予CCK-8治療，結(jié)果顯示CCK-8可明顯減輕晶狀體損傷，其機(jī)制可能與抑制iNOS基因表達(dá)、減少NO生成有關(guān)。這些研究均表明CCK-8具有一定的抗氧化作用。

CCK-8是一種典型的腦腸肽，為CCK的主要形式，具備天然 CCK 的全部生物學(xué)活性，通過(guò)細(xì)胞表面CCK受體在中樞、外周神經(jīng)系統(tǒng)及消化系統(tǒng)發(fā)揮著多方面調(diào)節(jié)作用。有研究表明CCK-8具有刺激胰島β細(xì)胞增殖，抑制胰島細(xì)胞凋亡及增加胰島素的作用[10-11]。與此結(jié)果類(lèi)似，本研究也提示CCK-8能夠刺激胰島細(xì)胞的增殖，同時(shí)具有減少由FFAs誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的作用。CCK-8是否通過(guò)抗氧化應(yīng)激途徑或其他機(jī)制刺激了胰島細(xì)胞的增殖尚無(wú)結(jié)論。

總之，本研究結(jié)果表明，CCK-8對(duì)FFAs損傷的胰島β細(xì)胞具有一定的抗氧化應(yīng)激作用，同時(shí)CCK-8能夠顯著刺激NIT-1細(xì)胞的增殖，抑制由FFAs誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的作用，本文結(jié)果對(duì)胰島β細(xì)胞損傷的保護(hù)研究具有一定的幫助。

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The influence of cholecystokinin-octopeptide on oxidative stess in islet beta cells injured by free fat acids*

WeiLimin,ZhangDongmei,HeXuefeng,LvXiuqin,LiuNa

(DepartmentofEndocrinology,GeneralHospitalofHebeiProvince,Shijiazhuang,Hebei050051,China)

[Abstract]ObjectiveTo observe the effect of cholecystokinin-octopeptide(CCK-8) on oxidative stress and cell proliferation in mice islet β cells (NIT-1 cells) injured by high concentration free fat acids.MethodsIn vitro cultured NIT-1 cells were divided into 3 groups,they were control group,FFAs group (add 0.25 mmol/mL of oleinic acid+0.25 mmol/mL of palmic acid) and CCK-8 group (add FFAs and 1×10-8mmol/L of CCK-8 simultaneously).Cell morphologies were observed;NIT-1 cells proliferations were detected by MTT method,and apoptosis rates were measured by flow cytometry;The levels of T-AOC,GSH-Px,CAT,SOD and MDA in supernatant were also measured.ResultsThere were less cell debris in CCK-8 group than FFAs group(all P<0.01);the OD570value of CCK-8 group was significant higher than FFAs group(P<0.01),and the 72 h CCK-8 group was higher than 48 h CCK-8 group(P<0.01).Compared with FFAs group,the levels of CAT,T-AOC,SOD and GSH-Px in CCK-8 group were increased and the concentration of MDA was decreased obviously(P<0.05),the levels of CAT,SOD in 72 h CCK-8 group were higher than 48 h CCK-8 group,MDA was lower than 48 h CCK-8 group(P<0.05).ConclusionCCK-8 could protect islet β cells injury from FFAs through anti-oxidative stress mechanism and promote NIT-1 cells proliferation.

[Key words]cholecystokinin;insulin-secreting cells;oxidative ctress;cell proliferation;fatty Acids,nonesterified

doi:10.3969/j.issn.1671-8348.2016.01.011

基金項(xiàng)目：河北省科技廳科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(12276104D-86)。

作者簡(jiǎn)介：魏立民(1967-)，主任醫(yī)師，博士，主要從事胰島細(xì)胞的損傷與保護(hù)研究。

[中圖分類(lèi)號(hào)]R589.1

[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A

[文章編號(hào)]1671-8348(2016)01-0030-03

(收稿日期：2015-06-12修回日期：2015-09-18)