曹慧琴，韋　瑋

(延安大學(xué)附屬醫(yī)院 血液科，陜西 延安716000)

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淋巴瘤患者血漿中miR-21、miR-155、miR-210的表達(dá)及臨床意義

曹慧琴，韋瑋

(延安大學(xué)附屬醫(yī)院 血液科，陜西 延安716000)

摘要：目的探討miR-21、miR-155、miR-210的臨床表達(dá)意義及其與淋巴瘤病理特征的相關(guān)性。方法采用RT-PCR技術(shù)及免疫組化法測(cè)定60例行淋巴瘤患者血清中miR-21、miR-155、miR-210表達(dá)量及BCL-6蛋白水平，并對(duì)其與淋巴瘤病理特征相關(guān)性進(jìn)行分析。結(jié)果與正常對(duì)照組相比，淋巴瘤患者miR-21、miR-155、miR-210表達(dá)量顯著提高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。經(jīng)相關(guān)分析可知，miR-21、miR-155表達(dá)量與免疫分型、MYC基因、BCL-6蛋白有關(guān)，而miR-210表達(dá)量則與免疫分型、MYC基因有關(guān)。結(jié)論miR-21、miR-155、miR-210可能與淋巴瘤發(fā)生及進(jìn)展相關(guān)。通過測(cè)定miR-21、miR-155、miR-210表達(dá)情況可有效預(yù)測(cè)淋巴瘤病情的進(jìn)展，對(duì)臨床淋巴瘤診治具有重要的指導(dǎo)意義。

關(guān)鍵詞：miR-21；miR-155；miR-210；淋巴瘤；病理特征

(ChinJLabDiagn,2016,20:0764)

淋巴瘤是臨床常見的血液惡性腫瘤，患者臨床表現(xiàn)為淋巴組織形態(tài)學(xué)、免疫表型、細(xì)胞及分子遺傳學(xué)等方面的異質(zhì)性[1]。微小RNA(miRNA)是近年新發(fā)現(xiàn)的內(nèi)源性RNA，它不參與內(nèi)源蛋白編碼，但能在轉(zhuǎn)錄后提高調(diào)節(jié)基因的表達(dá)水平[2]。miRNA是由19-24個(gè)核苷酸組成的非編碼蛋白質(zhì)短小單鏈RNA家族，其可通過通過抑制靶mRNA翻譯或解除靶mRNA轉(zhuǎn)錄從而調(diào)控相關(guān)基因表達(dá)[3]。研究指出[4]，miRNA在生物生長(zhǎng)發(fā)育、細(xì)胞凋亡、分化及腫瘤生成過程中起到重要的作用。與其中惡性腫瘤相比，淋巴瘤患者明顯存在miRNA表達(dá)失調(diào)的情況。目前已知的若干種miRNA參與淋巴瘤的發(fā)生及進(jìn)展，其miRNA臨床表達(dá)與淋巴瘤分子亞型有密切的關(guān)系。本研究將應(yīng)用熒光定量PCR技術(shù)測(cè)定淋巴瘤患者miR-21、miR-155、miR-210水平，并探討其于淋巴腫瘤病理特征的關(guān)系及其在臨床診斷及預(yù)后中的預(yù)測(cè)價(jià)值。

1資料與方法

1.1臨床資料

收集2011年6月至2013年6月本院行淋巴瘤手術(shù)60例患者的臨床資料，患者入組前均沒接受過放化療治療，其中男性35例，女性25例，年齡為48-74歲，平均年齡為(56.8±3.4)歲。TNM分期：Ⅰ期 28例，Ⅱ期22例，Ⅲ期 10例。病理組織分期均符合2008年WHO對(duì)臨床造血組織腫瘤分類標(biāo)準(zhǔn)，均經(jīng)符合中國(guó)濾泡性淋巴瘤診斷與治療指南(2013年版)?；颊呔袉慰寺】贵w(單抗)聯(lián)合CHOP(環(huán)磷酰胺、阿霉素、長(zhǎng)春新堿、潑尼松)方案免疫化療，由兩位資深病理專家對(duì)患者免疫表型進(jìn)行分析及確診。另選取60例正常體檢者為對(duì)照組，男 32例，女28例，年齡45-75歲，平均年齡(54.8±3.6)歲，兩組性別、年齡無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，具有可比性。

1.2方法

1.2.1免疫組織化學(xué)法測(cè)定淋巴瘤患者免疫分型

采用MYC基因雙色分離探針測(cè)定淋巴瘤患者M(jìn)YC基因分型。采用Envision法標(biāo)記患MUM-1、CD3、CD10、CD20、BCL-6，參照文獻(xiàn)對(duì)患者陽(yáng)性表達(dá)結(jié)果進(jìn)行評(píng)價(jià)。根據(jù)Hans分類法，依據(jù)MUM-1、CD10、BCL-6表達(dá)結(jié)果劃分GCB型及non-GCB型。若MUM-1、CD3、CD10、CD20、BCL-6均為陽(yáng)性或當(dāng)中有一項(xiàng)為陽(yáng)性則為GCB型，MUM-1、CD3、CD10、CD20、BCL-6均為陰性則歸為non-GCB型。

1.2.2總RNA的提取(1)樣本獲取及處理：對(duì)入院擬診為淋巴瘤的患者留取血液標(biāo)本，1小時(shí)內(nèi)離心沉淀血細(xì)胞，取上層血清保存于-80℃冰箱待檢測(cè)。(2)血清樣品miRNA 表達(dá)譜分析的多重莖環(huán)RT-PCR技術(shù)建立：根據(jù)miRBase數(shù)據(jù)庫(kù)(http://microrna.sanger.ac.uk/sequences)中miRNA序列，參照Tang F等提供的miRNA 表達(dá)譜分析方法(Tang F,Hajkova P,Barton SC,O'Carroll D,Lee C,Lao K,Surani MA.220-plex microRNA expression profile of a single cell.Nat Protoc.2006;1(3):1154-9.)，建立了血清miRNA 表達(dá)譜分析的多重莖環(huán)RT-PCR技術(shù)。(3)血清RNA抽提及逆轉(zhuǎn)錄：在血清標(biāo)本中加入人工合成的已知濃度的miRNA作為實(shí)時(shí)定量RT-PCR標(biāo)準(zhǔn)品。按RNA抽提步驟用TRIzo LSl試劑(Invitrogen)抽提組織總RNA。

1.2.3miR-21、miR-155、miR-210表達(dá)分析根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道的miRNA檢測(cè)莖環(huán)RT-q PCR方法，以1et-7a miRNA作為內(nèi)參基因，分析miR-21、miR-155、miR-210表達(dá)情況。選取淋巴瘤及配對(duì)組織進(jìn)行miR-21、miR-155、miR-210表達(dá)水平檢測(cè)，設(shè)計(jì)反應(yīng)引物。分別以miR-21、miR-155、miR-210及l(fā)et-7a頸環(huán)RT引物進(jìn)行RNA逆轉(zhuǎn)錄，反應(yīng)條件為：先在42℃中反向轉(zhuǎn)錄30 min,隨后將溫度變?yōu)?5℃將mRNA變性2 min，然后于55℃中15 s、72℃中30 s以及95℃中30 s反復(fù)循環(huán)擴(kuò)增，并在退火階段收集熒光信號(hào)，并記錄每個(gè)反應(yīng)管中熒光信號(hào)到達(dá)預(yù)設(shè)閾值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)，并計(jì)算miR-21、miR-155、miR-210相對(duì)表達(dá)量?；蛳鄬?duì)表達(dá)量=目的基因/內(nèi)參基因。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2結(jié)果

2.1淋巴瘤患者免疫組織化學(xué)法結(jié)果

60例淋巴瘤患者BCL-6陽(yáng)性38例(63.33%)，陰性22例(36.67%)，見圖1，2。

圖1淋巴瘤細(xì)胞BCL-6呈陰性表達(dá)圖2淋巴瘤細(xì)胞BCL-6呈陽(yáng)性表達(dá)

2.2淋巴瘤組織中miR-21、miR-155、miR-210表達(dá)情況分析

與正常胃粘膜組織相比，淋巴瘤組織中miR-21、miR-155、miR-210表達(dá)量顯著提高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

2.3miR-21、miR-155、miR-210表達(dá)與淋巴瘤臨床病理分析

經(jīng)相關(guān)分析可知，miR-21、miR-155表達(dá)量與免疫分型、MYC基因、BCL-6蛋白有關(guān)，而miR-210表達(dá)量則與免疫分型、MYC基因有關(guān)，見表2。

表1　　　淋巴瘤組織中miR-21、miR-155、miR-210

表2　miR-21、miR-155、miR-210表達(dá)與淋巴瘤臨床病理分析

3討論

腫瘤發(fā)生發(fā)展機(jī)制異常復(fù)雜，涉及多種抑癌基因、癌基因及相應(yīng)的信號(hào)傳導(dǎo)通路的改變。miRNA在細(xì)胞生成、分化、凋亡及腫瘤發(fā)生等多種生理及病理性過程中起到重要的作用。在腫瘤發(fā)生過程中miRNA表達(dá)對(duì)腫瘤病情診斷具有重要的意義。近年有研究指出[5]，某些特定miRNA測(cè)定對(duì)預(yù)測(cè)腫瘤患者病情進(jìn)展及預(yù)后有重要的作用，可為臨床上治療方案制定提供強(qiáng)而有力的依據(jù)。

Lan等[6]指出與正常B細(xì)胞系相比，在原發(fā)性淋巴瘤系、濾泡中心淋巴瘤中miR-155呈高表達(dá)。與細(xì)胞系結(jié)果一致，在淋巴瘤患者中miR-155在患者表達(dá)水平較高。XX等[7]對(duì)176例淋巴瘤患者臨床資料進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，非GCB型淋巴瘤患者miR-155表達(dá)水平顯著升高。本研究通過應(yīng)用RT-PCR測(cè)定60例淋巴瘤患者miR-155的表達(dá)情況，結(jié)果顯示，miR-155在淋巴瘤表達(dá)水平顯著高于正常淋巴組織B細(xì)胞，進(jìn)一步經(jīng)免疫分型發(fā)現(xiàn)，miR-155在non-GCB型中表達(dá)水平顯著高于GCB型，結(jié)果與既往研究相同。

MYC基因位于8q24編碼區(qū)，能編碼短半衰期的核磷蛋白，其位點(diǎn)多態(tài)性與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展有密切的關(guān)系[8]。宋國(guó)齊等[9]研究指出，在5%-10%淋巴瘤患者中可檢測(cè)MYC基因重排，且MYC基因重排與淋巴瘤遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移有關(guān)。此外，MYC基因重排患者遠(yuǎn)期預(yù)后較差，且中樞神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥高于未重排患者。朱明霞等[10]研究發(fā)現(xiàn)，miR-21及miR-155可促使MYC重排，從而影響淋巴腫瘤患者預(yù)后。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)MYC基因重排的淋巴瘤患miR-21、miR-155、miR-210表達(dá)量顯著下降，研究證實(shí)了miR-21、miR-155高表達(dá)量可影響MYC基因重排，從而影響淋巴瘤患者的預(yù)后。

BCL-6基因編碼的蛋白是由706個(gè)氨基酸組成的，具有鋅指樣結(jié)構(gòu)的核內(nèi)轉(zhuǎn)錄抑制因子，可調(diào)節(jié)細(xì)胞分化、增殖及器官發(fā)育。BCL-6蛋白在正常情況僅在中心B細(xì)胞中表達(dá)，是調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育中的重要調(diào)控因子。BCL-6蛋白異常表達(dá)與惡性腫瘤的發(fā)生及病情進(jìn)展有密切的關(guān)系[11]。Wan等[12]研究指出，BCL-6可抑制MYC基因重排，從而影響漿細(xì)胞分化、細(xì)胞周期凋亡、調(diào)控及DNA修復(fù)，當(dāng)BCL-6正常下調(diào)被阻斷，則會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞分化受阻、增殖受限、凋亡機(jī)制異常，從而引起細(xì)胞惡質(zhì)變。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，BCL-6蛋白陰性組患者miR-21、miR-155表達(dá)量高于陽(yáng)性組，從而提示淋巴瘤機(jī)體可通過調(diào)控miR-21、miR-155的表達(dá)而直接調(diào)節(jié)BCL-6蛋白，進(jìn)而影響患者預(yù)后。

綜上所述，miR-21、miR-155、miR-210可能與淋巴瘤發(fā)生及進(jìn)展相關(guān)。通過測(cè)定miR-21、miR-155、miR-210表達(dá)情況可有效預(yù)測(cè)淋巴瘤病情的進(jìn)展，對(duì)臨床淋巴瘤診治具有重要的指導(dǎo)意義。

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The expression and clinical significance of miR-21,miR-155,miR-210 of plasma lymphoma patients

CAOHui-Qin,WEIWei.

(YanAnUniversityAffiliatedHospital,YanAn716000,China)

Abstract:ObjectiveTo investigate the expression and clinical significance of miR-21,miR-155,miR-210 of plasma lymphoma patients.MethodsThe expression levels of miR-21,miR-155,miR-210 and BCL-6 protein of 60 cases of plasma lymphoma patients were measured with RT-PCR and immunohistochemical staining,the features associated with lymphoma were analyzed.ResultsThe levels of miR-21,miR-155,miR-210 of plasma lymphoma patients were higher than control group(P<0.05).The expression of miR-21,miR-155 were relationship with immune typing,MYC gene,BCL-6 protein,whereas the expression of miR-210 were relationship with immune typing,MYC genes.ConclusionmiR-21,miR-155,miR-210 may occur and progress associated with lymphoma.By measuring miR-21,miR-155,miR-210 expression can predict disease progression of lymphoma,has important significance for clinical diagnosis and treatment of lymphoma.

Key words:miR-21;miR-155;miR-210;lymphoma;pathological features

文章編號(hào)：1007-4287(2016)05-0764-04

中圖分類號(hào)：R733.4

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

作者簡(jiǎn)介：曹慧琴(1982-)，女，主治醫(yī)師，研究方向：淋巴瘤的臨床診斷治療。

(收稿日期：2015-05-14)