張穎穎 李瑩瑩

摘 要：建立同時(shí)測(cè)定豬肉中萘啶酸、惡喹酸、依諾沙星、氟甲喹、諾氟沙星、環(huán)丙沙星、洛美沙星、丹諾沙星、恩諾沙星、氧氟沙星、沙拉沙星、二氟沙星、麻保沙星、培氟沙星、司帕沙星、奧比沙星16 種喹諾酮類藥物殘留的超高效液相-串聯(lián)質(zhì)譜（ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrophy，UPLC-MS/MS）的檢測(cè)方法。樣品采用乙酸-乙腈（1∶99，V/V）一次性振蕩提取，用弱陰離子固相萃取柱凈化，內(nèi)標(biāo)法定量。結(jié)果表明：16 種喹諾酮藥物的檢出限為0.2 ?g/kg，定量限為0.8 ?g/kg，空白豬肉中添加2.0、5.0、10.0 ?g/kg水平，16 種喹諾酮的回收率在70%～120%。該方法分析速度快、樣品前處理干凈、雜質(zhì)污染少，可用于豬肉樣品中喹諾酮類的殘留檢測(cè)。

關(guān)鍵詞：喹諾酮；超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜；豬肉；殘留

Determination of Sixteen Quinolones Residues in Pork by Ultra Performance Liquid

Chromatography-Tandem Mass Spectrometry

ZHANG Yingying， LI Yingying

（China Meet Research Center， Beijing Academy of Food Sciences， Beijing 100068）

Abstract： An efficient ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry （UPLC-MS/MS） method was established for the analysis of residues of 16 quinolones （danofloxacin， difloxacin， lomefloxacin， pefloxacin， enoxacin， orbifloxacin， marbofloxacin， sparfloxacin， oxolinic acid， nalidixic acid， ofloxacin， norfloxacin， flumequine， enrofloxacin， sarafloxacin， and ciprofloxacin） in pork. Samples were extracted with 1% acetic acid-acetonitrile， and the extract was subjected to chromatographic separation on a weak anion solid-phase extraction column. Quantification of 16 quinolones was achieved by UPLC-MS/MS using internal standard method. The detection limit and quantification limit of the method were 0.2 ?g/kg and 0.8 ?g/kg respectively for all 16 quinolones. The average recoveries of 16 quinolones in blank pork at three spiked levels of 2.0， 5.0 and 10.0 ?g/kg ranged from 70% to 120%， with relative standard deviation （RSD） less than 6%. The method had the advantages of fast analysis， clean sample pretreatment and less pollution. Therefore， it can be used for the detection of quinolone residues in pork.

Key words： quinolones； ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry （UPLC-MS/MS）； pork； residue

DOI：10.15922/j.cnki.rlyj.2016.05.008

中圖分類號(hào)：TS207.3 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1001-8123（2016）05-0036-06

引文格式：

張穎穎， 李瑩瑩. 超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定豬肉中16 種喹諾酮藥物殘留量[J]. 肉類研究， 2016， 30（5）： 36-41. DOI：10.15922/j.cnki.rlyj.2016.05.008. http：//rlyj.cbpt.cnki.net

ZHANG Yingying， LI Yingying. Determination of sixteen quinolones residues in pork by ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry[J]. Meat Research， 2016， 30（5）： 36-41. （in Chinese with English abstract） DOI：10.15922/j.cnki.rlyj.2016.05.008. http：//rlyj.cbpt.cnki.net

喹諾酮類是一類含4-喹諾酮基本結(jié)構(gòu)的抗菌藥，以細(xì)菌的脫氧核糖核酸（DNA）為靶，妨礙DNA回旋酶，進(jìn)一步造成細(xì)菌DNA的不可逆損害，達(dá)到抗菌效果。主要作用于革蘭陰性菌的抗菌藥物，對(duì)革蘭陽(yáng)性菌的作用較弱。由于該藥物抗菌廣，與其他藥物無(wú)交叉耐藥性、不良反應(yīng)少，所以被廣泛用于畜類、禽類、水產(chǎn)品及蜜蜂等養(yǎng)殖業(yè)。若長(zhǎng)期食用喹諾酮藥物殘留的食物，會(huì)造成胃腸道及中樞反應(yīng)，并誘導(dǎo)耐藥性的傳遞，不利于臨床治療[1]。聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織/世界衛(wèi)生組織食品添加劑專家聯(lián)席委員會(huì)、歐盟都已制定了多種喹諾酮類藥物在動(dòng)物組織中的最高殘留限量。美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局于2005年宣布禁止用于治療家禽細(xì)菌感染的抗菌藥物恩諾沙星的銷售和使用[2]。我國(guó)也于2002年規(guī)定了環(huán)丙沙星、單諾沙星、恩諾沙星、沙拉沙星、二氟沙星、惡喹酸和氟甲喹等7 種喹諾酮類藥物在動(dòng)物肌肉組織中的最高殘留限量。

目前，有關(guān)喹諾酮類藥物殘留的檢測(cè)方法的報(bào)道較多，有微生物法[3-5]、液相色譜法[6-13]、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[14-26]、酶聯(lián)免疫法[27-31]等。由于液質(zhì)分辨率高、選擇性強(qiáng)、無(wú)需強(qiáng)調(diào)分離、一次性檢測(cè)多種化合物、準(zhǔn)確性高等優(yōu)點(diǎn)，是檢測(cè)喹諾酮藥物殘留的主要方法。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)及相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行總結(jié)分析，優(yōu)化了一種快速分析、樣品處理干凈、雜質(zhì)污染少的用于測(cè)定豬肉中16 種喹諾酮?dú)埩舻囊嘿|(zhì)聯(lián)用方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

萘啶酸、惡喹酸、依諾沙星、氟甲喹、諾氟沙星、環(huán)丙沙星、洛美沙星、丹諾沙星、恩諾沙星、氧氟沙星、沙拉沙星、二氟沙星、麻保沙星、培氟沙星、司帕沙星、奧比沙星、環(huán)丙沙星-D8、恩諾沙星-D5 德國(guó)Dr. Ehrenstorfer公司；乙腈（色譜純） 德國(guó)Merck公司；乙腈、乙酸、甲醇、氨水（分析純） 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑（上海）有限公司。HLB、MCX固相萃取柱 美國(guó)Waters公司；WAX固相萃取柱 天津博納艾杰爾科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

TSQ超高效液相色譜串聯(lián)四級(jí)桿質(zhì)譜儀（配有電噴霧（electrospray ionization，ESI）離子源及Xcalibur 2.2數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)） 美國(guó)Thermo公司；固相萃取裝置

美國(guó)Agilent公司；20PR-520離心機(jī) 日本Hitachi公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠；氮吹儀 天津市恒奧科技發(fā)展有限公司。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

分別準(zhǔn)確稱取萘啶酸、惡喹酸、依諾沙星、氟甲喹、諾氟沙星、環(huán)丙沙星、洛美沙星、丹諾沙星、恩諾沙星、氧氟沙星、沙拉沙星、二氟沙星、麻保沙星、培氟沙星、司帕沙星、奧比沙星16 種標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醇配制成100 ?g/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液（根據(jù)溶解度可適當(dāng)加水溶解），于4 ℃的冰箱中冷藏保存。使用時(shí)依次用水稀釋至相應(yīng)質(zhì)量濃度。

分別準(zhǔn)確稱取環(huán)丙沙星-D8及恩諾沙星-D5標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醇配制為100 ?g/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，于4 ℃的冰箱中冷藏保存。使用時(shí)用水稀釋至100 ?g/L。

1.3.2 樣品制備

準(zhǔn)確稱取10 g樣品，加入100 ?L 100 ?g/L的內(nèi)標(biāo)溶液，加入10 mL乙腈-乙酸（99∶1，V/V）提取溶液，用玻璃棒攪拌后，繼續(xù)加入10 mL的乙腈-乙酸溶液，振蕩1 h，取出，12 000 r/min離心5 min，取上清液于梨形瓶中，加入10 mL異丙醇，混勻，于50 ℃條件下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，殘?jiān)? mL氨水-水（5∶95，V/V）溶解。若脂肪含量較大，則加入5 mL正己烷，混勻，待分層后，棄去上層。依次用5 mL甲醇、5 mL氨水-水（5∶95，V/V）淋洗WAX固相萃取柱，上樣，再用5 mL水淋洗萃取柱，而后用甲酸-甲醇（2∶98，V/V）洗脫，洗脫溶液在50 ℃條件下氮?dú)獯蹈?，? mL流動(dòng)相溶解殘?jiān)?/p>

1.3.3 儀器條件

1.3.3.1 液相色譜條件

色譜柱：Thermo Hypersil Gold C18（100 mm×

2.1 mm，1.9 ?m）；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣體積：10 ?L；流動(dòng)相A：甲酸-水溶液（1∶99，V/V）；流動(dòng)相B：乙腈；二元梯度程序見(jiàn)表1。

表 1 二元梯度洗脫程序

Table 1 Binary gradient elution program

時(shí)間/min 體積分?jǐn)?shù)/%

流動(dòng)相A 流動(dòng)相B

0～1 95 5

1～5 95～5 5～95

5.0～6.9 5 95

7～8 95 5

1.3.3.2 質(zhì)譜條件

ESI離子源；正離子模式；毛細(xì)管電壓：3 000 V；毛細(xì)管溫度：350 ℃；霧化溫度：350 ℃；輔助氣壓力：30 Arb；鞘氣壓力：10 Arb；質(zhì)譜多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（multiple reaction monitoring，MRM）采集參數(shù)見(jiàn)表2。

2 結(jié)果與分析

2.1 優(yōu)化前處理?xiàng)l件

2.1.1 固相萃取柱的選擇

喹諾酮類藥物的基本結(jié)構(gòu)中既含有羧基官能團(tuán)又含有叔胺基，是兩性化合物，可以在反相柱、陽(yáng)離子柱和陰離子柱中保留；在按SN/T 1751.2—2007《進(jìn)出口動(dòng)物源食品中喹諾酮類藥物殘留量檢測(cè)方法》[14]操作的整個(gè)過(guò)程中，僅用正己烷萃取凈化，效果不好，易損失且溶液渾濁。因此，樣品凈化過(guò)程中，考察了HLB反相柱、MCX陽(yáng)離子交換柱和WAX弱陰離子交換柱3 類固相萃取柱對(duì)喹諾酮類藥物的凈化作用。每種固相萃取柱的操作條件及沙拉沙星回收率見(jiàn)表3。

由表3可知，HLB回收率均較低，說(shuō)明離子相互作用強(qiáng)于疏水作用。WAX-3柱和MCX-3柱的回收率均較低，說(shuō)明在淋洗過(guò)程中，甲醇在洗脫雜質(zhì)時(shí)也洗脫了待測(cè)物。雖然MCX-2和WAX-2的回收率均較高，但是在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，MCX柱最后洗脫下的溶液較渾，說(shuō)明洗脫效果不及WAX柱，最終使用WAX柱，過(guò)程即WAX-2。

2.1.2 樣品提取過(guò)程優(yōu)化

本實(shí)驗(yàn)的提取溶液為乙酸-乙腈（1∶99，V/V），既能夠較好地沉淀蛋白，又能夠破壞細(xì)胞組織，使之完全釋放出來(lái)。相比于GB/T 21312—2007《動(dòng)物源性食品中14 種喹諾酮藥物殘留檢測(cè)方法 液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法》[15]的提取溶劑EDTA-Mellvaine，提取效率高，回收率好，并且提取溶劑的配制過(guò)程簡(jiǎn)便。此外考察了超聲和振蕩的提取方式，超聲的回收率稍高一些，但是雜質(zhì)多，影響最低檢出限，所以選擇振蕩的方式。最終的樣品前處理過(guò)程即用20 mL乙酸-乙腈（1∶99，V/V）提取待測(cè)物，振蕩1 h，移取上清液于梨形瓶中，旋蒸，過(guò)WAX固相萃取柱。

2.2 儀器條件優(yōu)化

由于喹諾酮類藥物是兩性化合物，在優(yōu)化質(zhì)譜條件時(shí)，比較了正負(fù)離子掃描模式，發(fā)現(xiàn)正模式下離子響應(yīng)強(qiáng)度更高，所以采用正離子掃描模式。在優(yōu)化色譜條件時(shí)，流動(dòng)相中加入適量甲酸會(huì)增強(qiáng)離子的響應(yīng)信號(hào)。本實(shí)驗(yàn)采用甲酸-水溶液（1∶99，V/V）與乙腈為流動(dòng)相對(duì)16 種化合物進(jìn)行優(yōu)化，由于分析的化合物較多，并且氟甲喹與萘啶酸的母離子與定量子離子相同，故選擇梯度洗脫來(lái)進(jìn)行分離，以保證良好的分離度和峰形。

2.3 線性范圍及檢出限

16 種喹諾酮類藥物質(zhì)量濃度在1～50 ?g/L，采用內(nèi)標(biāo)法，以待測(cè)物的定量離子峰面積與內(nèi)標(biāo)定量離子峰面積之比作為縱坐標(biāo)，以待測(cè)物的質(zhì)量濃度作為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，16 種化合物的線性方程及相關(guān)系數(shù)見(jiàn)表4。

在空白豬肉樣品中加入16 種喹諾酮類藥物的標(biāo)準(zhǔn)溶液，經(jīng)過(guò)提取和凈化后，上機(jī)，以3 倍信噪比為檢出限，以10 倍信噪比為定量限，分別為0.2、0.8 ?g/kg。圖1為空白豬肉樣品中添加5.0 ?g/kg標(biāo)準(zhǔn)溶液的質(zhì)譜圖。

2.4 回收率和精密度

空白豬肉中分別添加2.0、5.0、10.0 ?g/kg的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，每個(gè)添加水平分別做6 個(gè)平行，按照1.3.2節(jié)的樣品制備方法進(jìn)行回收率實(shí)驗(yàn)。由表5可知，16 種喹諾酮的回收率在70%～120%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）1%～6%，其精密度和回收率均符合殘留分析方法的要求。

3 結(jié) 論

本方法建立了豬肉中16 種喹諾酮類藥物殘留的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜的檢測(cè)方法。該方法采用乙酸-乙腈（1∶99，V/V）一次性振蕩提取，用弱陰離子固相萃取柱凈化，整個(gè)樣品運(yùn)行時(shí)間為8 min，簡(jiǎn)便快速。該方法采用內(nèi)標(biāo)法定量，空白豬肉中添加2.0、5.0、10.0 ?g/kg的水平，16 種喹諾酮的平均回收率為70%～120%，總體相對(duì)偏差小于6%。該方法操作簡(jiǎn)便，前處理干凈，雜質(zhì)污染少，重現(xiàn)性好，回收率高，并且滿足國(guó)內(nèi)外相關(guān)法規(guī)的要求，適合大批量樣品的監(jiān)測(cè)分析。

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