朱倩，徐文丹，張蓓，許波群，高超，高莉，劉嘉茵，崔毓桂*

(1. 南京醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院生殖醫(yī)學科，南京　210029；2. 南京醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院婦科，南京　210036)

·實驗研究·

SET蛋白對精原細胞株GC-1 spg增殖和凋亡的影響

朱倩1，徐文丹1，張蓓1，許波群2，高超1，高莉1，劉嘉茵1，崔毓桂1*

(1. 南京醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院生殖醫(yī)學科，南京210029；2. 南京醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院婦科，南京210036)

【摘要】目的探討SET蛋白對精原細胞株GC-1 spg增殖和凋亡的影響。方法使用含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基在37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)GC-1 spg細胞，分對照組(轉染無關序列腺病毒)和實驗組[轉染SET干涉腺病毒(AdH1-siRNA/SET)]；GC-1 spg接種于96孔板或者6孔板，轉染腺病毒48 h、72 h后收集細胞，免疫熒光和共聚焦激光掃描顯微鏡檢測SET蛋白在GC-1 spg細胞中的表達與定位；提取細胞總蛋白，Western Blot檢測轉染前后SET蛋白的表達；細胞計數(shù)試劑盒-8(CCK8)和5-溴脫氧尿嘧啶核苷(BrdU)標記法檢測細胞的數(shù)目和增殖情況；流式細胞儀檢測細胞凋亡的變化。結果SET蛋白表達于GC-1 spg細胞的胞核和胞漿中，且胞漿分布多于胞核；轉染SET干涉腺病毒后，干涉組GC-1 spg細胞中的SET蛋白相對表達量為(0.217±0.044)顯著低于對照組的(0.629±0.170)(P<0.05)，同時GC-1 spg細胞的數(shù)目減少，增殖減慢，且細胞凋亡率顯著增加[干涉組(21.663±1.287)%，對照組(8.813±0.671)%](P均<0.01)。結論SET蛋白在精原細胞GC-1 spg胞核和胞漿中均有表達，且胞漿分布多于胞核；GC-1 spg細胞中SET蛋白表達降低，能夠抑制細胞增殖、促進細胞凋亡，提示SET蛋白可能參與調節(jié)精子發(fā)生的過程。

【關鍵詞】SET蛋白；精子發(fā)生；精原細胞；細胞增殖；細胞凋亡

Objective： To investigate the effects of SET protein on the proliferation and apoptosis of spermatogonia cell line GC-1 spg.

Methods： GC-1 spg cells were cultured in DMEM/HIGH GLUCOSE with 10% fetal bovine serum in 5% CO2at 37℃. The cells in control group were transfected with AdH1-siRNA/NS，and the cells in experimental group were transfected with AdH1-siRNA/SET. The cells were seeded in 96-well plate or 6-well plate and treated with adenovirus for 48 or 72 hours，and then the cells were collected. The expression and cellular location of SET protein were assessed by immunofluorescence and confocal laser scanning microscopy. The total proteins were extracted，and the expressions of SET protein before and after transfection were detected by Western blotting. Cell number and proliferation were tested by CCK8 assay and BrdU incorporation assay，while cell apoptosis was measured by flow cytometry.

Results： It was found that SET protein was expressed both in cytoplasm and nucleus of GC-1 spg cells，and it was mainly expressed in cytoplasm. The expression of SET protein in the GC-1 spg cells transfected with AdH1-siRNA/SET [(0.217±0.044)vs.(0.629±0.170)] was significantly lowered than that in control group(P<0.05)；while the apoptosis index was significantly increased [(21.663±1.287)vs.(8.813±0.671)%] (P<0.01)，and the cell number and the proliferation rate were decreased (P<0.01).

Conclusions： SET protein was expressed both in cytoplasm and nucleus of GC-1 spg cells，and it was mainly expressed in cytoplasm. Knockdown of SET protein inhibits proliferation，and promotes apoptosis of GC-1 spg cells，which suggests that SET protein may participate in the regulation of spermatogenesis.

Key words：SET protein；Spermatogenesis；Spermatogonia cells；Cell proliferation；Cell apoptosis

(J Reprod Med 2016，25(5)：449-454)

不育癥已成為影響人類健康與社會發(fā)展的一個全球性醫(yī)學和社會問題，全球約15%的育齡夫婦存在不育問題，在引起不育癥的因素中男性因素占50%左右[1]。引起男性不育的原因有很多，其中精子發(fā)生障礙是男性不育常見的原因之一，占所有男性不育原因的20%～25%[1]，臨床表現(xiàn)為少、弱、畸形精子癥。諸多激素、細胞因子調控精子發(fā)生過程，其中可能也包括SET蛋白[2]。SET基因是原癌基因，定位于染色體9q34著絲粒的c-abl。SET蛋白是細胞內(nèi)多任務因子，參與調控包括細胞周期、細胞增殖凋亡、DNA修復、基因轉錄以及表觀遺傳等多個生物過程[3-4]。目前關于SET蛋白在生殖系統(tǒng)中的作用研究相對較少。本實驗室前期研究發(fā)現(xiàn)，SET蛋白表達于卵巢中的卵泡膜細胞、卵母細胞以及睪丸中的間質細胞、精原細胞和精母細胞[2，5]。已有研究證實SET參與調節(jié)卵母細胞的發(fā)育[6-7]，但是SET蛋白在精子發(fā)生中的作用及其機制鮮有報道。本研究采用SET干涉腺病毒轉染體外培養(yǎng)的精原細胞株GC-1 spg，觀察SET蛋白對GC-1 spg細胞增殖和凋亡的影響。

材料和方法

一、材料與試劑

小鼠精原細胞株GC-1 spg(南京醫(yī)科大學生殖醫(yī)學國家重點實驗室惠贈)，DMEM高糖培養(yǎng)基(HyClone，美國)，胎牛血清(Gibco，美國)，兔SET抗體(Santa Cruze，美國)，兔beta-actin抗體(abcam，美國)，二喹啉甲酸(BCA)蛋白濃度測定試劑盒和細胞組織快速裂解液RIPA(上海碧云天)，辣根過氧化酶(HRP)標記山羊抗兔IgG和二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色液(北京中杉金橋)，細胞計數(shù)試劑盒-8(CCK-8)檢測試劑盒(北方生物研究所)，5-溴脫氧尿嘧啶核苷(BrdU)ELISA試劑盒(Roche，美國)，四甲基異硫氰酸羅丹明(TRITC)標記的羊抗兔二抗(IgG-TRITC)(invitrogen，美國)，酶標儀(Thermo，美國)，共聚焦激光掃描顯微鏡(Nikon，日本)，APC Annexin V/7-AAD流式凋亡試劑盒和流式細胞儀(BD Biosciences，美國)。SET干涉腺病毒載體由本課題組構建[8]，應用于前期多項研究中[9-10]。

二、研究方法

1. 細胞分組與轉染：使用含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)GC-1 spg細胞。實驗分為兩組：對照組：轉染無關序列腺病毒；干涉組(實驗組)：轉染SET干涉腺病毒(AdH1-siRNA/SET)。GC-1 spg以5×104個/孔的密度接種于6孔板中，37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)24 h，每孔轉染2 μl的空載腺病毒或者干涉腺病毒載體，轉染后48 h和72 h收集細胞進行后續(xù)試驗。各實驗重復3～5批次。

2. 蛋白質印跡(Western Blot)檢測目標分子蛋白表達：轉染腺病毒72 h后收集細胞提取總蛋白，BCA法測定蛋白濃度，12%的十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)分離蛋白，濕轉法轉膜250 mA 2 h，5%脫脂牛奶37℃搖床封閉1～2 h，一抗(抗SET蛋白多克隆抗體1∶500，β-actin 1∶10 000作為內(nèi)參)4℃過夜，用TBST洗膜3次，每次10 min，HRP標記的二抗(抗IgG 1∶1 000)37℃搖床孵育1 h，再用TBST洗膜3次，每次10 min，洗膜后使用增強化學發(fā)光(ECL)檢測試劑盒(Millipore，美國)顯影特異蛋白條帶。采用天能Gel Image System分析軟件進行灰度值分析，以目的蛋白與內(nèi)參蛋白條帶灰度值的比值均數(shù)作為各蛋白的相對表達量。

3. 熒光免疫和激光共聚焦檢測SET蛋白在細胞中的定位：消過毒的小圓片置于24孔板中，GC-1 spg以2.5×104個/孔的密度接種于24孔板中，37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)，細胞密度達到60%～70%時，PBS洗2次，每次5 min，4%多聚甲醛固定60 min，PBS洗4次，每次5 min，0.4%的triton-100細胞打孔5 min，PBS洗3次，室溫下5%BSA濕盒內(nèi)封閉1～2 h，1∶50稀釋SET一抗，4℃濕盒內(nèi)過夜，PBS洗膜，1∶500稀釋TRITC熒光二抗，37℃濕盒內(nèi)1 h，PBS洗膜3次，4，6-聯(lián)脒-2-苯基吲哚(DAPI)染核1 min，PBS洗膜3次，Debico封片，在共聚焦顯微鏡下進行拍攝。陰性對照，是用無抗體活性的IgG替代SET一抗，其余操作與實驗組一致。

4.CCK8檢測細胞活率：GC-1 spg以1 250個/孔的密度接種于96孔板中，37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)24 h，轉染干涉腺病毒72 h后，96孔板每孔加10 μl的CCK8溶液，孵育2 h，用酶標儀測定450 nm處的吸光度值。

5.BrdU ELISA試劑盒檢測細胞增殖：GC-1 spg以1 250個/孔的密度接種于96孔板中，37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)24 h，轉染干涉腺病毒24 h后，每孔加入10 μl的BrdU標記液，再37℃孵育24 h，去掉標記液，60℃放置1 h，每孔加入200 μl的FixDenat，室溫孵育30 min，去掉FixDenat，拍板，每孔加入100 μl抗BrdU-POD工作液(1∶25稀釋)，室溫孵育2 h，倒掉抗體工作液，用每孔200 μl洗液洗板3次，倒掉洗液，拍板使孔內(nèi)沒有殘余，每孔加入100 μl的底物溶液，室溫孵育30 min，讀取370 nm處的光密度(OD)值，OD值越高，說明細胞增殖能力越強。

6. 流式細胞儀檢測細胞凋亡：GC-1 spg以5×104個/孔的密度接種于6孔板中，37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)24 h，轉染干涉腺病毒72 h后消化、收集各組細胞，PBS洗滌后離心，PBS重懸后轉移至流式管中1 500 rpm/min，離心5 min，倒掉PBS，加入400 μl的1×結合緩沖液及5 μl的APC Annexin V和5 μl的7-AAD，震蕩混勻后，避光室溫孵育15 min，流式細胞儀檢測細胞凋亡。

三、統(tǒng)計學分析

結果

一、SET蛋白在GC-1 spg細胞中的表達及定位

激光共聚焦結果顯示，SET蛋白在GC-1 spg細胞核和胞漿中都有表達，且胞漿表達高于胞核(圖1)。

A：陰性對照組DAPI染細胞核；B：陰性對照組TRITC標記的二抗熒光染色；C：陰性對照組細胞核和SET的合并熒光染色圖；D：實驗組DAPI染細胞核；E：實驗組TRITC標記的SET一抗熒光染色；F：實驗組細胞核和SET的合并熒光染色圖。圖1　共聚焦激光掃描顯微鏡檢測SET蛋白在GC-1 spg細胞中的表達與定位(×600)

二、GC-1 spg轉染SET干涉腺病毒后SET蛋白水平的變化

GC-1 spg轉染SET干涉腺病毒72 h后，SET蛋白表達水平(0.217±0.044)較對照組(0.629±0.170)顯著降低，干涉率為65%，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)(圖2)。

三、SET蛋白干涉后GC-1 spg細胞數(shù)目和細胞增殖的變化

GC-1 spg轉染SET干涉腺病毒72 h后，CCK8檢測細胞數(shù)目結果表明，SET蛋白干涉組OD值為(0.281±0.068)較對照組的(1.193±0.005)明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)(圖3A)。

為了研究細胞數(shù)目減少是由于增殖減少還是凋亡增加引起的，GC-1 spg轉染SET干涉腺病毒48 h后，采用BrdU ELISA法檢測細胞增殖情況。結果表明，SET蛋白干涉組的OD值(0.080±0.004)較對照組(0.098±0.005)明顯下降(P<0.01)(圖3B)。

四、SET蛋白干涉后GC-1 spg細胞凋亡結果

GC-1spg轉染SET干涉腺病毒72 h，流式細胞儀檢測細胞凋亡。結果表明，干涉組細胞凋亡率[(21.663±1.287)%]較對照組[(8.813±0.671)%]顯著升高(P<0.01)(圖4)。

討論

本文初步研究SET蛋白在精子發(fā)生中的作用及其作用機制，采用SET干涉腺病毒轉染精原細胞株GC-1 spg，免疫熒光及共聚焦實驗發(fā)現(xiàn)SET蛋白在GC-1 spg胞核和胞漿中都有表達，且胞漿多于胞核；利用Western Blot檢查發(fā)現(xiàn)GC-1 spg轉染SET干涉腺病毒后，SET蛋白的干涉效率為65%。免疫熒光可以進行細胞亞定位觀察，并由此推導其潛在的生物學功能；結合Western Blot結果，探討了SET蛋白在細胞增殖和細胞凋亡中的作用。諸多研究提示，隨細胞狀態(tài)改變，SET蛋白可分別定位于細胞核、細胞膜、細胞質及內(nèi)質網(wǎng)。如在HeLa和HOS細胞、HeLa細胞的分裂間期，SET蛋白主要定位于細胞核內(nèi)，亞細胞定位可能與其分子伴侶功能相關[11-12]。在大腦皮質神經(jīng)元細胞，SET蛋白也主要定位于細胞核內(nèi)，而當毒性誘導神經(jīng)元凋亡時，SET蛋白在細胞核內(nèi)減少而在細胞質內(nèi)增多[13]。我們的實驗未能顯示RNAi后GC-1 spg細胞內(nèi)SET蛋白免疫熒光亞定位的改變，可能與干涉效率65%不足以形成熒光強度、顯微鏡圖像處理、所用熒光抗體與AdH1-siRNA/SET攜帶綠色熒光蛋白(GFP)相互干擾等原因有關。

本研究結果發(fā)現(xiàn)，降低GC-1 spg細胞的SET蛋白表達水平，能抑制GC-1 spg細胞的增殖，同時促進細胞凋亡。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)SET蛋白表達于精原細胞和精母細胞，以及睪丸間質細胞，提示SET蛋白一方面可能調節(jié)睪丸間質細胞雄激素合成，另一方面可能作用于生精細胞調節(jié)精子發(fā)生。研究發(fā)現(xiàn)SET過表達可以降低細胞的解毒作用，使細胞毒性物質和致癌物質積聚于細胞內(nèi)，導致細胞死亡或腫瘤發(fā)生[14]。SET蛋白積聚在神經(jīng)元胞漿中會使細胞對DNA損傷更加敏感，容易誘發(fā)細胞死亡[13]。不存在氧化應激時，聚集的SET蛋白在人源胚胎腎細胞HEK293T細胞的胞核和胞漿中均等分布，抑制細胞凋亡；而當細胞處于輕度氧化應激狀態(tài)時，SET蛋白則主要聚集在胞漿中，促進細胞凋亡[15]。在氧化應激狀態(tài)下，SET蛋白通過改變叉頭框蛋白O1(FoxO1)的乙?；癄顟B(tài)正向調節(jié)細胞凋亡[16]。

SET蛋白通過多條通路調節(jié)細胞增殖，其中磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(PI3K/AKT)和細胞外調節(jié)蛋白激酶(ERK)信號通路是SET調節(jié)細胞增殖的重要通路。在非小細胞肺癌中，敲除SET蛋白，上調蛋白磷酸酶2A (PP2A)的活性，從而抑制AKT和ERK信號通路，抑制細胞增殖[17]。在前列腺癌中也發(fā)現(xiàn)SET蛋白通過PI3K/AKT信號通路調節(jié)細胞增殖[18]。在頭頸部鱗狀細胞癌細胞系HN12和Cal27中，SET蛋白通過ERK信號通路調節(jié)細胞增殖和存活[19]。有研究發(fā)現(xiàn)，SET蛋白通過不依賴caspase途徑和依賴caspase途徑來調節(jié)細胞凋亡[20-21]。劉雁峰等[22]研究發(fā)現(xiàn)，干涉SET蛋白能夠通過激活外源性細胞凋亡通路引起人早幼粒細胞白血病維甲酸耐藥細胞株NB4-R1凋亡。在HEK293T細胞中超表達的SET蛋白能夠抑制caspase 9和caspase 3的活性，抑制內(nèi)源性凋亡通路[15]。Cristobal等[23]也發(fā)現(xiàn)SET蛋白能夠抑制PP2A激活的caspase凋亡途徑。SET蛋白調節(jié)GC-1 spg細胞增殖和凋亡的機制，尚有待于進一步研究。

綜上所述，SET蛋白表達于精原細胞GC-1 spg胞核和胞漿中，且胞漿多于胞核。降低SET蛋白表達水平，可以抑制GC-1 spg細胞增殖、促進細胞凋亡，表明SET蛋白可能在精子發(fā)生中發(fā)揮著重要的作用。深入研究SET蛋白在精子發(fā)生中的作用機制，有利于我們進一步了解男性少、弱、畸形精子癥的發(fā)生，可能為男性不育癥的治療提供新線索。

注：與對照組比較，*P<0.05圖2　Western Blot檢測轉染SET干涉腺病毒后GC-1 spg細胞中SET蛋白的表達情況

A：干涉SET蛋白表達后，GC-1 spg細胞數(shù)目變化；B：干涉SET蛋白表達后，GC-1 spg細胞增殖情況。注:與對照組比較，**P<0.01圖3　干涉SET蛋白表達對GC-1 spg細胞數(shù)目和細胞增殖的影響

【參考文獻】

[1]Wang Z，Jin B，Zhang X，et al. Yangjing capsule extract promotes proliferation of GC-1 Spg cells[J]. Evid Based Complement Alternat Med，2014，2014：640857.

[2]Dai XN，Liu S，Shao L，et al. Expression of the SET protein in testes of mice at different developmental stages[J]. Asian J Androl，2014，16：689-693.

[3]朱倩，崔毓桂. SET蛋白及其對雄激素合成的調節(jié)作用[J]. 國際生殖健康/計劃生育雜志，2014，33：423-427.

[4]許波群，劉嘉茵，崔毓桂. SET/TAF-1β的研究進展[J]. 癌變畸變突變，2009，21：482-485.

[5]Boqun X，Xiaonan D，Yugui C，et al. Expression of SET protein in the ovaries of patients with polycystic ovary syndrome[J]. Int J Endocrinol，2013，2013：367956.

[6]Qi ST，Wang ZB，Ouyang YC，et al. Overexpression of SETbeta，a protein localizing to centromeres，causes precocious separation of chromatids during the first meiosis of mouse oocytes[J]. J Cell Sci，2013，126：1595-1603.

[7]Chambon JP，Touati SA，Berneau S，et al. The PP2A inhibitor I2PP2A is essential for sister chromatid segregation in oocyte meiosis II[J]. Curr Biol，2013，23：485-490.

[8]許波群，李瑛，薛凱，等. 人SET基因小分子干擾RNA重組腺病毒載體的構建與鑒定[J]. 醫(yī)學研究生學報，2010，23：117-122.

[9]Xu B，Gao L，Cui Y，et al. SET protein up-regulated testosterone production in the cultured preantral follicles[J]. Reprod Biol Endocrinol，2013，11：9.

[10]Gao LL，Liu XQ，Xu BQ，et al. SET/PP2A system regulates androgen production in ovarian follicles in vitro[J]. Mol Cell Endocrinol，2013，374：108-116.

[11]Adachi Y，Pavlakis GN，Copeland TD. Identification and characterization of SET，a nuclear phosphoprotein encoded by the translocation break point in acute undifferentiated leukemia[J]. J Biol Chem，1994，269：2258-2262.

[12]Karetsou Z，Martic G，Sflomos G，et al. The histone chaperone SET/TAF-Ibeta interacts functionally with the CREB-binding protein[J]. Biochem Biophys Res Commun，2005，335：322-327.

[13]Qu D，Zhang Y，Ma J，et al. The nuclear localization of SET mediated by impalpha3/impbeta attenuates its cytosolic toxicity in neurons[J]. J Neurochem，2007，103：408-422.

[14]Almeida LO，Goto RN，Pestana CR，et al. SET overexpression decreases cell detoxification efficiency：ALDH2 and GSTP1 are downregulated，DDR is impaired and DNA damage accumulates[J]. FEBS J，2012，279：4615-4628.

[15]Leopoldino AM，Squarize CH，Garcia CB，et al. Accumulation of the SET protein in HEK293T cells and mild oxidative stress：cell survival or death signaling[J]. Mol Cell Biochem，2012，363：65-74.

[16]Chae YC，Kim KB，Kang JY，et al. Inhibition of FoxO1 acetylation by INHAT subunit SET/TAF-Ibeta induces p21 transcription[J]. FEBS Lett，2014，588：2867-2873.

[17]Liu H，Gu Y，Wang H，et al. Overexpression of PP2A inhibitor SET oncoprotein is associated with tumor progression and poor prognosis in human non-small cell lung cancer[J]. Oncotarget，2015，6：14913-14925.

[18]Farrell AS，Allen-Petersen B，Daniel CJ，et al. Targeting inhibitors of the tumor suppressor PP2A for the treatment of pancreatic cancer[J]. Mol Cancer Res，2014，12：924-939.

[19]Sobral LM，Sousa LO，Coletta RD，et al. Stable SET knockdown in head and neck squamous cell carcinoma promotes cell invasion and the mesenchymal-like phenotype in vitro，as well as necrosis，cisplatin sensitivity and lymph node metastasis in xenograft tumor models[J]. Mol Cancer，2014，13：32.

[20]Fan Z，Beresford PJ，Oh DY，et al. Tumor suppressor NM23-H1 is a granzyme A-activated DNase during CTL-mediated apoptosis，and the nucleosome assembly protein SET is its inhibitor[J]. Cell，2003，112：659-672.

[21]Chakravarti D，Hong R. SET-ting the stage for life and death[J]. Cell，2003，112：589-591.

[22]劉雁峰，賀鵬程，劉鋒，等. RNA干擾I2PP2A基因表達對NB4-R1細胞增殖及凋亡的影響[J]. 中華血液學雜志，2014，35：732-736.

[23]Cristobal I，Rincon R，Manso R，et al. Deregulation of the PP2A inhibitor SET shows promising therapeutic implications and determines poor clinical outcome in patients with metastatic colorectal cancer[J]. Clin Cancer Res，2015，21：347-356.

[編輯：辛玲]

Effects of SET protein on proliferation and apoptosis of spermatogonia cell line GC-1 spg

ZHU Qian1，XU Wen-dan1，ZHANG Bei1，XU Bo-qun2，GAO Chao1，GAO Li1，LIU Jia-yin1，CUI Yu-gui1*

1.Clinical Center of Reproductive Medicine，the First Affiliated Hospital of Nanjing Medical University，Nanjing210029

2.The Second Affiliated Hospital of Nanjing Medical University，Nanjing210036

【Abstract】

DOI：10.3969/j.issn.1004-3845.2016.05.012

【收稿日期】2015-11-13；【修回日期】2016-01-14

【基金項目】國家自然科學基金(81370754，81170559，31301182)；江蘇省衛(wèi)生廳項目(ZX201110，F(xiàn)XK201221)

【作者簡介】朱倩，女，江蘇鎮(zhèn)江人，碩士研究生，生殖醫(yī)學專業(yè).(*通訊作者，Email：cuiygnj@njmu.edu.cn)