陜西省人民醫(yī)院消化內(nèi)一科(西安710068)

金　燕　呂頤菲　邱　婷　王　雪　高淑娟　閆春英　劉貴生

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乙肝病毒在早期胚胎中復制情況實驗研究

陜西省人民醫(yī)院消化內(nèi)一科(西安710068)

金燕呂頤菲邱婷王雪高淑娟閆春英劉貴生

摘要目的：觀察HBV會在早期卵裂胚胎中復制情況，探討HBV在早期胚胎內(nèi)的生物學活性。方法：選取行輔助生育技術治療女方或男方有一方或雙方患有慢性乙肝夫婦的廢棄胚胎為實驗組，同期HBV陰性的廢棄單細胞卵裂胚胎作為陰性對照組。采用單細胞RT-PCR方法檢測早期卵裂胚胎中的HBV mRNA。結(jié)果：實驗組62個卵裂胚胎中有6個檢測到特異性HBV mRNA片段，陽性檢出率 9.7%(6/62)。女方HBV標志物陽性、男方HBV標志物陽性和夫妻雙方HBV標志物陽性的卵裂胚胎陽性檢出率分別為13.2%(5/38)、5.6%(1/18)和0%(0/6)。結(jié)論：在早期卵裂胚胎內(nèi)存在的HBV具有復制活性使胚胎感染HBV，發(fā)生真正意義上的經(jīng)卵細胞途徑的HBV母嬰垂直傳播。

主題詞 乙型肝炎病毒胚胎發(fā)育病毒復制多重聚合酶鏈式反應

目前研究證實乙型肝炎病毒的母嬰傳播是造成HBV感染慢性化的主要原因。多項研究結(jié)果[1-3]證實，HBV可以穿過透明膜和細胞膜進入卵母細胞并在卵細胞內(nèi)進行復制和增殖，但是這些并不足以證明HBV會經(jīng)卵細胞將感染傳遞到下一代，要得出這個結(jié)論尚需要解決幾個關鍵問題，即：①在自然受精時，存在HBV DNA的人卵母細胞是被選擇性剔除還是能順利地完成受精過程而將HBV帶入受精卵;②在早期胚胎中存在的HBV是以片段整合于宿主細胞還是具有復制活性？本研究借助進行體外受精人群，利用單細胞RT-PCR技術了解HBV mRNA在單細胞卵裂胚胎中的情況，分析HBV在早期胚胎內(nèi)的復制活性。

材料和方法

1材料選取2010年6月至2011年12月在陜西省婦幼保健院生殖中心行輔助生育技術治療女方或男方或夫妻雙方均患者乙肝的62個廢棄胚胎作為實驗組；同期進行體外受精的50例夫婦雙方HBV兩對半檢測均為陰性的76個廢棄胚胎作為陰性對照組。所有乙肝患者符合以2000年全國病毒性肝炎學術會議(西安)修訂的慢性病毒性肝炎的診斷標準。所有患者在手術前于肘靜脈處抽取10ml靜脈血，分別用于血清HBV DNA定量檢測，和HBVM檢測(送生化實驗室完成)。同時檢測患者血清中HAVM、HAV、HCV、HDV和HIV抗體，排除有上述病毒的感染。

2實驗方法

2.1細胞裂解：將廢棄單細胞卵裂胚胎置于分裝的裂解液，按照Invitrogen的Superscript III First-Strand Synthesis 反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進行逆轉(zhuǎn)錄反應，整個反應在冰上進行。用Oligo6.0生物軟件設計管家基因β-actin的引物[4]。根據(jù)HBV的S區(qū) mRNA基因序列[5]。PCR反應擴增條件：預變性：95℃ 3min，變性：94℃ 50s，56℃ 50s，延伸：72℃ 50s,30個循環(huán)→72℃延伸10min后，進行第二輪PCR。條件和步驟同第一輪。

2.2對照選擇：陰性對照：選擇夫妻雙方HBV兩對半檢測均為陰性的廢棄胚胎，轉(zhuǎn)錄過程中不加模板，轉(zhuǎn)錄中不加逆轉(zhuǎn)錄酶，不加模板的PCR反應體系，空白對照代替模板。PCR擴增時不加Taq酶。陽性對照為HBV患者陽性血清DNA。

結(jié)果

1RT-PCR結(jié)果

1.1所有單細胞卵裂胚胎置于裂解液后在同一EP 管中進行逆轉(zhuǎn)錄生成cDNA后，行PCR擴增管家基因β-actin，擴增片段長度為179bp。除了陰性對照，每管都擴增出目的片段(圖1)。

圖1　β-actin擴增電泳圖

擴增產(chǎn)物為管家基因β-actin，擴增片段長度為179bp。除了陰性對照，每管都擴增出目的片段。

1.2 用巢式PCR擴增出目的片段，第一輪均無目的片段擴增，第二輪產(chǎn)物為206bp。62個卵裂胚胎中有6個檢測到特異性HBV mRNA片段，陽性檢出率為 9.7%(6/62)。女方HBV標志物陽性、男方HBV標志物陽性和夫妻雙方HBV標志物陽性的卵裂胚胎陽性檢出率分別為13.2%(5/38)、5.6%(1/18)和0%(0/6)，用Fisher確切概率法分析，各組間陽性率差異無明顯統(tǒng)計學意義(P=0.468)，見附表。

附表　各組受精卵中HBV陽性率比較

用Fisher確切概率法分析，各組間受精卵中檢出HBV陽性率的比較差異χ2= 1.519，P>0.05，無明顯統(tǒng)計學意義。

14例女方HBV標志物陽性卵裂胚胎中，2例卵裂胚胎中HBV mRNA陽性,陽性率為14.3%(2/14)；其中1例的5個胚胎中有3個陽性信號，另1例3個卵裂胚胎中檢出2個陽性信號。9例男方HBV標志物陽性的卵裂胚胎中的陽性率為11.1%(1/9)，此例的4個胚胎中檢出1個陽性信號。陰性對照的胚胎中未檢出特異性HBV mRNA信號(圖2)。

圖2　單個卵裂胚胎HBV mRNA擴增產(chǎn)物電泳圖

用巢式PCR擴增出目的片段，第一輪均無目的片段擴增，第二輪產(chǎn)物為206bp。上圖為女方乙肝陽性組，其中一例的5個胚胎中有3個陽性信號，另1例3個卵裂胚胎中檢出2個陽性信號。下圖顯示1例男方HBV標志物陽性的4個胚胎中檢出1個陽性信號。

討論

我們在卵巢組織及卵母細胞內(nèi)檢測到HBV復制的指標，包括HBcAg、HBV DNA和HBV mRNA，這些都為HBV隨著受精進入胚胎并具有活躍復制提供基礎。有學者將HBV基因轉(zhuǎn)入小鼠卵細胞后與正常精子受精或直接轉(zhuǎn)染入受精卵內(nèi)，在子代小鼠中不僅觀察到了整合的HBV DNA片段[6]，還發(fā)現(xiàn)了HBV復制和表達的證據(jù)，更有甚者還發(fā)現(xiàn)了3.5 kb mRNA和少量包裝在Dane顆粒中的部分雙鏈DNA[7]。這些研究說明HBV可進入動物卵母細胞，而這些含有HBV的卵母細胞并不被選擇性淘汰而成功受精，并在母體內(nèi)發(fā)育成熟產(chǎn)生新的子代個體。HBV不僅能在新子代個體基因內(nèi)整合，更有甚者，在HBV會在其內(nèi)復制和表達，最終造成轉(zhuǎn)基因動物的HBV母嬰垂直傳播。但是由于HBV具有嚴格的種屬特異性，且轉(zhuǎn)基因過程與自然感染有很大差距，因此以上研究與自然過程發(fā)生的人類經(jīng)卵細胞HBV母嬰傳播有著很大的差距。由于人類的卵母細胞不易獲得，研究人類的HBV經(jīng)卵細胞傳播途徑進展緩慢。有報道指出HBV DNA在人類卵母細胞基因組內(nèi)存在整合；人類生殖細胞攜帶的HBV DNA能夠通過受精的方式垂直傳遞給早期胚胎。但是僅僅是以整合狀態(tài)存在的遺傳傳遞并不意味著胚胎必定會感染HBV，只有發(fā)現(xiàn)具有完整復制活性的病毒才是真正意義的母嬰傳播。

我們通過單細胞RT-PCR技術，檢測到了在早期卵裂細胞中存在HBV mRNA且結(jié)果顯示女方HBV標志物陽性組、男方HBV標志物陽性組和夫妻雙方HBV標志物陽性組的早期卵裂胚胎中HBV mRNA的陽性檢出率分別為13.2%(5/38)、5.6%(1/18)和0%(0/6)，且各組間的差異無統(tǒng)計學意義。本研究在人類早期胚胎中檢測出了HBV mRNA，說明胚胎中感染的HBV不僅僅是以整合狀態(tài)存在，還具有一定的復制活性，在一定的條件下可以進行轉(zhuǎn)錄和翻譯。由于所有受試人員來自體外受精人群，在取卵過程中盡量避免了血液污染并進行了充分的清洗，胚胎中所含HBV應該來自于生殖細胞本身，同時我們之前通過原位雜交在卵母細胞中也檢出的HBV mRNA，因此，有理由相信卵母細胞中活躍復制的HBV可以隨著受精過程進入受精卵并在胚胎內(nèi)也可以復制，發(fā)生真正意義上的HBV經(jīng)卵細胞母嬰垂直傳播。遺憾的是，我們并沒有檢測受精前的生殖細胞中的HBV，不能證實在早期胚胎中的檢出的HBV直接來自這些生殖細胞。這是由于所有患者要求的將取出的生殖細胞(精子和卵子)進行體外受精以確保受精成功率。

我們對所有逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物都進行了管家基因β-actin的擴增，結(jié)果顯示均擴增出了目的片段，其意義在于表明所有標本的mRNA均被成功逆轉(zhuǎn)錄成CDNA，以排除因?qū)嶒瀱栴}導致的假陰性的可能性。同時設置了逆轉(zhuǎn)錄和PCR時的陰性對照以排除實驗本身引起的假陽性。

總之，通過選擇患有慢性乙肝并進行體外受精的這一特殊人群，我們證實了在早期卵裂胚胎內(nèi)存在的HBV具有復制活性使胚胎感染HBV，發(fā)生真正意義上的經(jīng)卵細胞途徑的HBV母嬰垂直傳播。

參考文獻

[1]Feng Y, Ya-Fei Yue, Shu-Hong Li,etal. Presence of HBsAg, HBcAg and HBVDNA in Ovary and ovum of the Patients with Chronic Hepatitis B Virus Infection [J]. Am J Obstet Gynecol, 2006, 193(2): 387-392.

[2]Wang AH, Wang AQ, Xu DZ,etal. The mechanism of HBV infection of human trophoblast cell[J]. Zhonghua Shi Yan He Lin Chuang Za Zhi, 2008, 22: 51-53.

[3]金燕，邱婷，呂頤菲，等. HBV在卵巢組織及卵細胞中的復制情況的研究.[J]．陜西醫(yī)學雜志，2015，44(7)：17--20．

[4]Barone M, Spano D, D'Apolito M,etal. Gene expression analysis in HBV transgenic mouse liver: A model to study early events related to hepatocarcinogenesis [J]. Mol Med, 2006, 12(4-6): 115-123.

[5]Cabrerizo M, Bartolomé J, Caramelo C,etal. Molecular analysis of hepatitis B virus DNA in serum and peripheral blood mononuclear cells from hepatitis B surface antigen-negative cases [J]. Hepatology, 2000, 32(1): 116-123.

[6]Chen LZ, Fan XG, Gao JM. Detection of HBsAg, HBcAg, and HBV DNA in ovarian tissues from patients with HBV infection [J]. World J Gastroenterol，2005, 11: 5565-5567.

[7]Bagis H, Arat S, Merean HO,etal. Stable transmission and expression of the Hepatitis B virus total genome in hybridtransgenie miee until F10 generation [J]. J Exp Zoolog A Comp Exp Biol, 2006, 305(5): 420-427.

(收稿：2015-06-09)

【中圖分類號】R392.3

【文獻標識碼】A

doi：10.3969/j.issn.1000-7377.2016.03.005