陜西省第四人民醫(yī)院(西安710043)

張亞斌　姚永鋒　龐仲輝

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兔Perthes病模型建立及股骨頭p53、Bcl-2表達(dá)研究*

陜西省第四人民醫(yī)院(西安710043)

張亞斌姚永鋒龐仲輝

摘要目的：建立Perthes病動(dòng)物模型，觀察股骨頭相關(guān)凋亡基因的變化，探討其在股骨頭壞死中的作用。方法：將32只新西蘭幼兔隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，透視下經(jīng)股骨頸給予實(shí)驗(yàn)組(A組)右側(cè)股骨頭(實(shí)驗(yàn)側(cè))內(nèi)注射醫(yī)用TH膠(含顯影劑的d-氰基丙烯酸正辛酯)0.5ml，相同方法給予對(duì)照組(B組)注射生理鹽水0.5ml，于建模后6、8、10、12 周分別取實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組兩組右側(cè)股骨頭進(jìn)行病理觀察，觀察兩組股骨頭p53 和Bcl-2凋亡基因表達(dá)變化。結(jié)果：建模后6周A組髖關(guān)節(jié)開始出現(xiàn)關(guān)節(jié)間隙增寬，出現(xiàn)點(diǎn)狀出血，隨著實(shí)驗(yàn)期的延長變性區(qū)并逐步擴(kuò)大，股骨頭骺板p53 基因表達(dá)與細(xì)胞凋亡率呈正相關(guān)性，Bcl-2 基因表達(dá)陽性率與細(xì)胞凋亡呈負(fù)相關(guān)性。B組股骨頭未見明顯異常。結(jié)論：經(jīng)股骨頸注射醫(yī)用TH膠建立Perthes 病動(dòng)物模型穩(wěn)定，無反復(fù)，且操作簡(jiǎn)單；證實(shí)p53和Bcl-2與Perthes 病發(fā)生相關(guān)性。

主題詞股骨頭壞死基因，p53基因,Bcl-2模型,動(dòng)物細(xì)胞凋亡兔

Perthes病特指幼兒的股骨頭壞死，早期如不能得到有效治療，常并發(fā)髖關(guān)節(jié)畸形及功能障礙，且早期易引起關(guān)節(jié)炎，嚴(yán)重危及兒童的身心健康及參加社會(huì)勞動(dòng)，目前病因還不明確，多數(shù)學(xué)者認(rèn)為與各種原因引起的股骨頭血液供應(yīng)障礙有關(guān)[1]。目前國內(nèi)外學(xué)者主要針對(duì)成人股骨頭壞死的研究，且主要集中在外在病因的探尋，對(duì)于基因和分子水平研究較少。兒童的股骨頭壞死發(fā)病較少，其研究也為之更少。因此，為從基因水平了解Perthes病的病因及發(fā)病機(jī)制，為該疾病的診斷和治療提供理論依據(jù)，本實(shí)驗(yàn)通過建立給予股骨頭內(nèi)注射TH醫(yī)用膠建立Perthes病的動(dòng)物模型，在特定時(shí)間點(diǎn)觀察實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組股骨頭宏觀和微觀變化的變化，分析和研究p53和Bcl-2基因在在該疾病發(fā)病中的作用。

材料和方法

1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組本次實(shí)驗(yàn)動(dòng)物兔均來自西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，32只，雌雄各半，拍片證實(shí)股骨頭骺板未閉合骨化。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)在西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院骨科動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室，時(shí)間為2011年12月至2012年05月，并嚴(yán)格按照《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)性意見》實(shí)施。

2建模將兔仰臥位固定于專用木制固定架上，給予硫噴妥鈉靜脈注射麻醉滿意后，消毒應(yīng)用骨穿刺套針經(jīng)股骨頸穿刺，在透視下見穿刺針到達(dá)實(shí)驗(yàn)組右側(cè)股骨頭骺板遠(yuǎn)側(cè)，向股骨頭內(nèi)注入醫(yī)用TH0.5ml[2]。參照同上方法吸取0.5ml 生理鹽水注射入對(duì)照組右側(cè)股骨頭內(nèi)。所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物單獨(dú)放置于專用高籠內(nèi)飼養(yǎng)，使其處于站立位，模擬人類站立位雙側(cè)髖關(guān)節(jié)負(fù)重的生理狀態(tài)。

3實(shí)驗(yàn)取材將所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物放置于相同環(huán)境下隨機(jī)分籠飼養(yǎng)，于建模術(shù)后第6、8、10、12周分別取實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組動(dòng)物各4只，按10 mg/kg人用氯胺酮臀大肌注射，在麻醉下給予動(dòng)脈耳緣靜脈內(nèi)注射氣體5ml致氣體栓塞，動(dòng)物死亡后保護(hù)下解剖實(shí)驗(yàn)側(cè)股骨頭，注意防止關(guān)節(jié)面損傷及人為骨折，并給予 10%甲醛溶液固定。

4實(shí)驗(yàn)觀察

4.1大體變化:觀察并記錄實(shí)驗(yàn)動(dòng)物精神狀態(tài)、活動(dòng)及體重變化,股骨頭軟骨面的顏色、形狀和硬度。

4.2組織病理學(xué)觀察：標(biāo)本進(jìn)行切片處理固定后，顯微鏡下將每張玻片隨機(jī)分區(qū)標(biāo)記，共10個(gè)區(qū)域，并在每個(gè)區(qū)域內(nèi)計(jì)數(shù)及記錄100個(gè)骨細(xì)胞及其內(nèi)凋亡細(xì)胞數(shù)，每個(gè)區(qū)域內(nèi)凋亡細(xì)胞總數(shù)進(jìn)行合計(jì)，并對(duì)p53和Bcl-2進(jìn)行指標(biāo)測(cè)定。

4.3細(xì)胞凋亡檢測(cè)：凋亡細(xì)胞檢測(cè)按照TUNEL試劑盒說明書進(jìn)行，可發(fā)現(xiàn)凋亡細(xì)胞內(nèi)胞核為黃色顆粒(即陽性對(duì)照)。實(shí)驗(yàn)陽性對(duì)照與陰性對(duì)照染色對(duì)比，將10個(gè)區(qū)域內(nèi)凋亡細(xì)胞總數(shù)進(jìn)行標(biāo)記和計(jì)算占總數(shù)百分比，凋亡率=(同一類型細(xì)胞的凋亡陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)/細(xì)胞總數(shù))×100%。

5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件，兩組樣本采用t檢驗(yàn)組間比較，采用Pearson相關(guān)分析法分析股骨頭骺板細(xì)胞凋亡率與p53和Bcl-2基因表達(dá)陽性率的相關(guān)性，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物數(shù)量分析本次實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有5只在此實(shí)驗(yàn)期間曾出現(xiàn)腹瀉，給予口服土霉素后癥狀消失，32只動(dòng)物在實(shí)驗(yàn)期間全部存活進(jìn)入了結(jié)果分析。

2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物大體觀察實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物右下肢于術(shù)后第6周出現(xiàn)輕微跛行，并逐漸加重至實(shí)驗(yàn)結(jié)束。對(duì)照組動(dòng)物右下肢正常，無異常表現(xiàn)。實(shí)驗(yàn)觀察兩組動(dòng)物體重及毛發(fā)光澤等方面無明顯異常，呈正常生長。

3股骨頭外觀變化對(duì)照組右側(cè)股骨頭外觀未見異常，與正常股骨頭基本一致。實(shí)驗(yàn)組第6周時(shí)右側(cè)髖關(guān)節(jié)周圍組織開始腫脹，出現(xiàn)關(guān)節(jié)積液及關(guān)節(jié)間隙的增寬，隨著試驗(yàn)時(shí)間延長部分股骨頭軟骨面可出現(xiàn)點(diǎn)狀充血，并逐漸擴(kuò)大；到達(dá)第12周時(shí)，實(shí)驗(yàn)組股骨頭雖形態(tài)正常，未見塌陷，但股骨頭軟骨面失去鮮亮色澤，可見骨質(zhì)疏松明顯，骨質(zhì)硬度差，易碎。

4實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組右側(cè)股骨頭病理變化實(shí)驗(yàn)組可見部分中斷，且數(shù)量減少，骨細(xì)胞內(nèi)可見脂肪變性且數(shù)量減少，部分骨細(xì)胞出現(xiàn)凋亡現(xiàn)象。骺板細(xì)胞排列發(fā)生變化且厚度變薄，可見有TH膠存留于骺板小靜脈內(nèi)將其栓塞(圖1)。對(duì)照組右側(cè)股骨頭內(nèi)骨小梁數(shù)量，組織結(jié)構(gòu)未見明顯變化，骨骺厚度及細(xì)胞形態(tài)和結(jié)構(gòu)正常(圖2)。

5凋亡細(xì)胞形態(tài)根據(jù)TUNEL試劑標(biāo)記可見凋亡細(xì)胞染色其胞質(zhì)呈淡黃色或棕黃色，陽性信號(hào)在核內(nèi)分布，周圍無炎性反應(yīng)細(xì)胞，形態(tài)大小不一，核邊界清楚(圖2-c、d)。

6實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組細(xì)胞凋亡率變化見表1。

表1　各組動(dòng)物細(xì)胞凋亡率比較±s, %)

注：與對(duì)照組同期比較，*P< 0.01

7凋亡基因指標(biāo)變化實(shí)驗(yàn)組右側(cè)股骨頭p53和bcl-2基因的表達(dá)在第8、10、12周與對(duì)照組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P< 0.01)，見表2。

表2　兩組凋亡誘導(dǎo)及抑制基因率比較±s, 100%)

注：與對(duì)照組同期比較，*P< 0.01

8相關(guān)性分析結(jié)果過Pearson相關(guān)分析表明Perthes病動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)側(cè)股骨頭骺板細(xì)胞凋亡率與p53基因表達(dá)陽性率呈正相關(guān)性(P< 0.05)，與Bcl-2基因表達(dá)陽性率之間呈負(fù)相關(guān)性(P< 0.01)。

討論

當(dāng)前研究已經(jīng)證實(shí)Perthes病患側(cè)股骨頭的骨內(nèi)壓明顯高于健側(cè)，而且患側(cè)股骨頭內(nèi)一氧化氮合成酶含量也明顯高于正常側(cè)[3]，通過進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)發(fā)生Perthes病時(shí)，其股骨頭內(nèi)的p53基因升高，而Bcl-2基因出現(xiàn)降低，隨著病程的發(fā)展，股骨頭關(guān)節(jié)軟骨及骺軟骨細(xì)胞也開始出現(xiàn)了凋亡現(xiàn)象[4]，Perthes病發(fā)生。研究證明，Perthes病的發(fā)生從外因上與各種原因引起的兒童股骨頭血流動(dòng)力學(xué)障礙有著密不可分的關(guān)系，當(dāng)某種因素造成股骨頭局部血供障礙，組織細(xì)胞出現(xiàn)水腫，骨內(nèi)壓隨之增高，當(dāng)壓力上升到足以阻擋動(dòng)脈血液供入時(shí)，血液循環(huán)減少，組織進(jìn)一步水腫，形成惡性循環(huán)，最終造成股骨頭骨骺毛細(xì)血管內(nèi)出現(xiàn)淤血，局部組織缺血缺氧 、引起無氧代謝增加，組織水腫滲出增加造成骨內(nèi)壓進(jìn)一步升高，持續(xù)的缺血缺氧及血液回流緩慢，誘發(fā)血液的高凝狀態(tài)[5]，持續(xù)的缺氧，出現(xiàn)了一氧化氮含量的減少，而氧自由基增加[6]。局部微環(huán)境的變化造成了骨細(xì)胞持續(xù)缺氧，如不能及時(shí)解除，在這種病理狀態(tài)下凋亡基因p53被異常表達(dá)而凋亡抑制基因Bcl-2被抑制，表達(dá)減少，造成了局部骨細(xì)胞的壞死。在正常情況下p53能夠誘導(dǎo)細(xì)胞的正常凋亡，當(dāng)p53基因異常表達(dá)增加而Bcl-2凋亡抑制基因減少時(shí)會(huì)引起骨細(xì)胞出現(xiàn)的大量的凋亡及壞死[7]。通過給股骨頭內(nèi)注射醫(yī)用TH膠建立Perthes病動(dòng)物模型，造成局部靜脈內(nèi)栓塞，淤血，靜脈回流不暢，造成局部壓力升高，并且出現(xiàn)動(dòng)脈血不能正常進(jìn)入股骨頭內(nèi)，造成局部骨細(xì)胞出現(xiàn)缺血缺氧，不能維持正常代謝，導(dǎo)致了p53凋亡基因的異常表達(dá)和Bcl-2凋亡抑制基因表達(dá)的減少，引起了骨細(xì)胞的凋亡及壞死，因此可以證實(shí)當(dāng)股骨頭內(nèi)血流動(dòng)力學(xué)發(fā)生障礙時(shí)可以引起p53凋亡基因和Bcl-2凋亡抑制基因異常表達(dá)，該基因后期加速Perthes病的發(fā)生。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：當(dāng)各種原因造成股骨頭血流動(dòng)力學(xué)發(fā)生障礙時(shí)，局部的缺血缺氧狀態(tài)誘導(dǎo)了p53和Bcl-2凋亡相關(guān)基因的異常表達(dá)，引起骨細(xì)胞出現(xiàn)程序性死亡，Perthes病發(fā)生，進(jìn)一步加重了局部的缺血缺氧，進(jìn)一步誘導(dǎo)p53和Bcl-2凋亡相關(guān)基因的異常表達(dá)造成骨細(xì)胞的進(jìn)一步凋亡和壞死。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)經(jīng)股骨頸注射建立Perthes病模型引起股骨頭局部缺血改變，局部骨內(nèi)壓升高，與各種原因引起的股骨頭缺血，組織水腫基本一致，股骨頭內(nèi)局部血液循環(huán)障礙引起內(nèi)壓增高，反過來加重了組織缺血。持續(xù)的缺血，造成骨細(xì)胞正常代謝障礙，誘導(dǎo)了凋亡基因及凋亡抑制基因的異常表達(dá)，造成骨細(xì)胞持續(xù)性凋亡。如不能得到及時(shí)處理，隨著組織缺血缺氧進(jìn)一步加重，組織水腫，骨內(nèi)壓持續(xù)性升高，進(jìn)一步造成血液循環(huán)障礙，誘導(dǎo)Bcl-2凋亡抑制基因表達(dá)進(jìn)一步減少， p53凋亡誘導(dǎo)基因異常增加，股骨頭關(guān)節(jié)軟骨，骺軟骨細(xì)胞持續(xù)性的凋亡及壞死，引起Perthes病發(fā)生。

因此，通過應(yīng)用TH膠注射建立兒童股骨頭壞死動(dòng)物模型，造成股骨頭微血栓形成，細(xì)胞缺血，組織水腫，骨內(nèi)壓增加，兒童股骨頭壞死模型建立，異常的骨內(nèi)微環(huán)境又誘導(dǎo)了p53 、Bcl-2等凋亡相關(guān)基因表達(dá)的變化，加速了骨細(xì)胞的凋亡，他們是Perthes病發(fā)生的并發(fā)因素并加速Perthes病的發(fā)生。本實(shí)驗(yàn)的研究對(duì)于Perthes病的發(fā)病機(jī)理進(jìn)一步闡述，對(duì)該疾病的深入研究提供了理論支持。如何降低Perthes病股骨頭內(nèi)壓力及抑制凋亡基因發(fā)生變化，降低股骨頭壞死率仍需進(jìn)一步研究。

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(收稿：2015-07-17)

Establishment of rabbit Perthes disease model and expression of p53 and Bcl-2 of the caput femoris

Fourth People’s Hospital of Shaanxi Province(Xi’an 710043)

Zhang Yabin Yao Yongfeng Pang Zhonghui

ABSTRACTObjective:To establish Perthes disease animal model to observe the changes of apoptosis gene that related to the caput femoris. Methods:32 New Zealand rabbit were randomly divided into experimental group and control group, and in the experimental group (group A), 0.5 ml medical TH glue was injected into the right side of the caput femoris under perspective through the collum femoris, 0.5 ml normal saline was injected to the control group with the same method. After the establishment of the model, the right side of the caput femoris in both groups were observed to see the apoptosis gene expression changes of p53 and BCL-2 of caput femoris in the 6th,8th,10th and 12th week. Results: After six weeks modeling, group A's hip joint gap widened, petechial hemorrhage could be seen. As the extension of the experimental phase degeneration area expanded gradually, the p53 gene expression of femoral epiphyseal plate had positive correlation with apoptosis rate, and the positive rate of BCL-2 gene expression was negative related to apoptosis. There was no obvious abnormality in the caput femoris of group B. Conclusion: It is stabile and has no reversal to establish the Perthes disease animal model via the injection of medical TH glue perthes through femoral neck, and the operation is simple. The correlation between p53 and BCL-2 and Perthes disease is confirmed.

KEY WORDSFemur head necrosisGenes,p53Genes,Bcl-2Models,animalApoprosisRabbits

【中圖分類號(hào)】R392.3

【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A

doi：10.3969/j.issn.1000-7377.2016.03.003

*陜西省科學(xué)技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(S2012SF2889)