鄧 沁，吳 忠，彭 維，王永剛，蘇薇薇

(中山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院∥廣東省中藥上市后質(zhì)量與藥效再評(píng)價(jià)工程技術(shù)研究中心，廣東 廣州510275)

尖吻蝮蛇凝血酶分離純化新工藝研究*

鄧 沁，吳 忠，彭 維，王永剛，蘇薇薇

(中山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院∥廣東省中藥上市后質(zhì)量與藥效再評(píng)價(jià)工程技術(shù)研究中心，廣東 廣州510275)

尖吻蝮蛇凝血酶是從尖吻蝮蛇蛇毒中分離純化得到的一種類凝血酶，屬于止血一類新藥。建立了尖吻蝮蛇凝血酶分離純化新工藝，采用切向流過濾技術(shù)，用兩步離子交換層析分離得到高純度的尖吻蝮蛇凝血酶，再采用兩步凝膠排阻層析去除熱原和脫鹽。該工藝具有簡(jiǎn)便高效的特點(diǎn)，適合大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。

尖吻蝮蛇凝血酶；分離；純化；工藝

尖吻蝮蛇凝血酶(Haemocoagulase Acutus，簡(jiǎn)寫為Halase)是從尖吻蝮蛇蛇毒中分離純化的一種類凝血酶，它通過水解纖維蛋白的Aα鏈，使纖維蛋白原原降解為纖維蛋白單體，從而發(fā)揮凝血作用。研究表明尖吻蝮蛇凝血酶具有較強(qiáng)的止血作用，且無毒[1-4]。本團(tuán)隊(duì)建立了一種尖吻蝮蛇凝血酶分離純化新工藝，采用切向流過濾技術(shù)，用兩步離子交換層析分離得到高純度的尖吻蝮蛇凝血酶，再采用兩步凝膠排阻層析去除熱原和脫鹽；具有簡(jiǎn)便高效的特點(diǎn)，適合大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材 料

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器

蛋白分離純化儀：GE Healthcare Life Sciences公司(GE Healthcare)，型號(hào)：AKTA prime plus；層析柱：GE Healthcare，型號(hào)：XK 50/30、XK 50/60；膜過濾分離系統(tǒng)：GE Healthcare，型號(hào)：QuixStandand Benchtop System；微濾柱：GE Healthcare，型號(hào)：CFP-4-E-4MA(420 cm2，0.45 μm)；超濾柱：GE Healthcare，型號(hào)：UFP-10-E-4MA(420 cm2，10 NMWC)；層析柜：上海青浦滬西儀器廠，CXG-1；便攜式pH計(jì)：OHAUS公司，型號(hào)：STARER 3000；高效液相色譜儀: Dionex公司，型號(hào)：UltiMate 3000；色譜柱：廣州菲羅門科學(xué)儀器有限公司，型號(hào)：BioSep-SEC-S 2000(7.8 mm ×300 mm，5 μm)；飛行時(shí)間質(zhì)譜：Bruker Daltonics公司，型號(hào)：Ultraflex TOF/TOF III；電泳儀：Bio Rad公司，型號(hào)：Mini-protenⅢ；凝膠掃描儀：BioRad公司，型號(hào)：GS-800；搖床：海門其林貝爾公司，型號(hào)：BETS-M1脫色微型圓周搖床；超凈工作臺(tái)：上海錦屏儀表有限公司，型號(hào)：SW-G6；電子天平：美國(guó)G&G公司，G&G ELECTRONIC SCALE (500 g，d =0.1 g)；磁力攪拌器：德國(guó)IKA公司, 型號(hào)：RCT basic；超聲儀：昆山市超聲儀器有限公司，型號(hào)：KQ-500DE；水浴鍋：上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠，型號(hào)：HH·B11·420。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

尖吻蝮蛇蛇毒：江西五步蛇生物科技有限公司，批號(hào)：201306；陰離子交換層析填料：DEAE SepharoseTMFast Flow，批號(hào)：10143954；分子篩凝膠層析填料：SuperdexTM75 prep grade，批號(hào)：10152155；分子篩凝膠層析填料：SephadexTMG-25，批號(hào)：10034116；磷酸氫二鈉，廣州化學(xué)試劑廠，批號(hào)：20140407-1；磷酸二氫鈉，天津市福晨化學(xué)試劑廠，批號(hào)：20140107；氯化鈉，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：20140818；氫氧化鈉，廣州化學(xué)試劑廠，批號(hào)：20130805-1；水為超純水。磷酸氫二鉀，廣東光華化學(xué)試劑廠，批號(hào)：20131120；磷酸二氫鉀，廣東光華化學(xué)試劑廠，批號(hào)：20131110；甲醇(色譜純)，Honeywell，批號(hào)：09ZG1H。Lowry法蛋白定量試劑盒，上海貝博生物科技有限公司，批號(hào)：201012。Pierce非預(yù)染蛋白Marker，Thermo Scientific，批號(hào)：00132053；w=12% SDS-PAGE預(yù)制膠，文淵閣生物科技(上海)有限公司；5×SDS-PAGE上樣緩沖液，GenStar，批號(hào)：E153-0；5×電泳液，碧云天生物技術(shù)研究所，批號(hào)：P0014B；w=0.1%考馬斯亮藍(lán)R250，Amresco，批號(hào)：0472；乙醇，廣州化學(xué)試劑廠，批號(hào)：20140105-1；冰醋酸(分析純)，廣州化學(xué)試劑廠，批號(hào)：20121105-2。病毒滅活冰凍血漿，肇慶市中心血站；尿素，廣州化學(xué)試劑廠，批號(hào)：20020103-2。

2 方 法

2.1 分離純化

取尖吻蝮蛇蛇毒粉末7.5 g，至于4 ℃層析柜中，用0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液(pH 6.8)約75 mL攪拌溶解2 h，待蛇毒完全溶解后，用上述磷酸鹽緩沖液稀釋至200 mL；用孔徑為0.45 μm的微濾柱微濾，收集濾液并加入上述磷酸鹽緩沖液稀釋至300 mL；再用孔徑為10 NMWC的超濾柱超濾，收集濾液(I)，備用。

用0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液(pH 6.8)先平衡DEAE SepharoseTMFast Flow層析柱，取濾液(I)上層析柱(10 mL/min)；待濾液全部倒入后，即用上述磷酸鹽緩沖液沖洗層析柱(35 mL/min)，直至紫外檢測(cè)器無峰信號(hào)檢出(280 nm)；然后用含0.05 mol/L NaCl的0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液(pH 6.8)沖洗層析柱(10 mL/min)，監(jiān)測(cè)紫外吸收峰信號(hào)，收集紫外吸收峰處濾液；用HPLC、SDS-PAGE電泳和促人血漿凝固活性檢測(cè)方法監(jiān)測(cè)其是否為目標(biāo)組分；對(duì)目標(biāo)組分用孔徑為10 NMWC的超濾柱進(jìn)行超濾濃縮，收集濾液(II)，備用。

用0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液(pH 7.5)先平衡DEAE SepharoseTMFast Flow層析柱，取濾液(II)上層析柱(10 mL/min)；待濾液全部倒入后，即用磷酸鹽緩沖液沖洗層析柱(35 mL/min)，直至紫外檢測(cè)器無峰信號(hào)檢出(280 nm)；然后分別用含0.03 mol/L NaCl和0.1 mol/L NaCl的0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液(pH 7.5)沖洗層析柱(20 mL/min)，監(jiān)測(cè)紫外吸收峰信號(hào)，收集紫外吸收峰處濾液；用HPLC、SDS-PAGE電泳和促人血漿凝固活性檢測(cè)方法監(jiān)測(cè)其是否為目標(biāo)組分；對(duì)目標(biāo)組分用孔徑為10 NMWC的超濾柱進(jìn)行超濾濃縮，收集濾液(III)，備用。

用0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液(pH 7.5)先平衡SuperdexTM75 prep grade層析柱，取濾液(III)上層析柱(20 mL/min)；待濾液全部倒入后，用磷酸鹽緩沖液沖洗層析柱(20 mL/min)，監(jiān)測(cè)紫外吸收峰信號(hào)(280 nm)，收集紫外吸收峰處濾液(IV)，備用；用HPLC、SDS-PAGE電泳和促人血漿凝固活性檢測(cè)方法監(jiān)測(cè)其是否為目標(biāo)組分。

用超純水先平衡SephadexTMG25層析柱，取濾液(IV)上層析柱(20 mL/min)；待濾液全部倒入后，即用注射用水洗脫目標(biāo)物沖洗層析柱(20 mL/min)，監(jiān)測(cè)紫外吸收峰信號(hào)(280 nm)，收集紫外吸收峰處濾液(V)；用HPLC、SDS-PAGE電泳和促人血漿凝固活性檢測(cè)方法監(jiān)測(cè)其是否為目標(biāo)組分。

2.2 HPLC純度檢測(cè)

取分離純化所得的尖吻蝮蛇凝血酶溶液,按照高效液相色譜法(《中國(guó)藥典》2015年版(四部)通則0512)測(cè)定[5]。色譜條件與系統(tǒng)適應(yīng)性：BioSep-SEC-S 2000色譜柱；以pH 6.8的0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液為流動(dòng)相，檢測(cè)波長(zhǎng)為280 nm，流速為1 mL/min，理論塔板數(shù)不得少于2 000；按面積歸一化法計(jì)算尖吻蝮蛇凝血酶相對(duì)百分含量。

2.3 SDS-PAGE電泳檢測(cè)

取分離純化所得的尖吻蝮蛇凝血酶溶液，參考Amersham Pharmacia公司的蛋白電泳技術(shù)手冊(cè)[6]，采用聚丙烯酰胺凝膠電泳法(SDS-PAGE)對(duì)尖吻蝮蛇凝血酶進(jìn)行電泳分析。

2.4 精確相對(duì)分子質(zhì)量測(cè)定

取分離純化所得的尖吻蝮蛇凝血酶溶液，采用基質(zhì)輔助激光解析串聯(lián)飛行時(shí)間質(zhì)譜法(MALDI-TOF-MS)測(cè)定精確相對(duì)分子質(zhì)量[7]。

2.5 酶比活性測(cè)定

人血漿凝固時(shí)間法：量取人血漿0.2 mL至于試管中，在37 ℃水浴中保溫約2 min；加入分離純化所得的尖吻蝮蛇凝血酶溶液0.2 mL后，立即搖勻計(jì)時(shí)，人血漿溶液應(yīng)在(60±20) s內(nèi)振搖后出現(xiàn)凝結(jié)；再加入1 mL 5 mol/L尿素溶液后振搖，凝塊溶解，溶液變清。采用Lowry法[8]測(cè)定分離純化所得的尖吻蝮蛇凝血酶的蛋白質(zhì)含量，計(jì)算在37 ℃條件下，使標(biāo)準(zhǔn)人血漿在(60±20) s內(nèi)振搖后出現(xiàn)絮狀物的尖吻蝮蛇凝血酶量。

3 結(jié)果與討論

3.1 分離純化

本研究建立了一種尖吻蝮蛇凝血酶分離純化新工藝，分離純化過程見圖1。

結(jié)果顯示，經(jīng)過微濾和超濾后，尖吻蝮蛇蛇毒中的大量雜質(zhì)即被除去；初步除雜后的蛇毒溶液隨后通過兩次DEAE SepharoseTMFast Flow陰離子交換層析，可分離得到純度較高的尖吻蝮蛇凝血酶；再通過SuperdexTM75 prep grade和SephadexTMG-25兩步凝膠排阻層析，制備出高純度的尖吻蝮蛇凝血酶。

3.2 純度測(cè)定

分離純化所得的尖吻蝮蛇凝血酶的高效液相色譜呈單一對(duì)稱峰，記錄色譜圖見圖2，按面積歸一化法計(jì)算其純度達(dá)99.69%，如表1所示。

圖1 尖吻蝮蛇凝血酶純化過程中收集的組分紫外峰信號(hào)Fig.1 UV Signals during Separation and Purification of Halase

圖2 尖吻蝮蛇凝血酶的HPLC圖譜Fig.2 HPLC chromatogram of Halase

3.3 SDS-PAGE電泳檢測(cè)

純化所得的尖吻蝮蛇凝血酶經(jīng)SDS-PAGE電泳檢測(cè)，結(jié)果如圖3，呈現(xiàn)兩條清晰條帶。

表1 尖吻蝮蛇凝血酶的HPLC譜圖相對(duì)峰面積

圖3 尖吻蝮蛇凝血酶SDS-PAGE電泳圖Fig.3 SDS-PAGE analysis of Halase

3.4 精確相對(duì)分子質(zhì)量測(cè)定

MALDI-TOF-MS相對(duì)分子質(zhì)量測(cè)定結(jié)果如圖4所示，m/z=29 245.020質(zhì)譜峰為尖吻蝮蛇凝血酶的質(zhì)子化分子離子峰[M+H]+；m/z=58 506.131是尖吻蝮蛇凝血酶的二聚體離子峰[2M+H]+。尖吻蝮蛇凝血酶的精確相對(duì)分子質(zhì)量為29 245.020。

圖4 尖吻蝮蛇凝血酶MALDI-TOF-MS圖譜Fig.4 MALDI-TOF-MS analysis of Halase

3.5 比活性測(cè)定

最終分離純化所得的尖吻蝮蛇凝血酶的比活為185.19 U/mg。

3.6 討論

本文探討的一種尖吻蝮蛇凝血酶分離純化新工藝，以微濾與超濾代替?zhèn)鹘y(tǒng)的離心與透析實(shí)現(xiàn)蛇毒粗蛋白的快速除雜，隨后兩步陰離子交換層析的洗脫步驟簡(jiǎn)單，可穩(wěn)定重復(fù)，最后通過兩步凝膠過濾分子篩層析先除熱源后脫鹽，有效分離出具有較強(qiáng)凝血活性的尖吻蝮蛇凝血酶。分離純化過程以HPLC、SDS-PAGE電泳和促人血漿凝固活性檢測(cè)作為制備工藝的監(jiān)測(cè)手段。該工藝操作簡(jiǎn)單高效，適合大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。

[1] 吳忠. 尖吻蝮蛇凝血酶用作出血性疾病的藥物:中國(guó), CN1218747[P]. 2003-08-14.

[2] 吳忠.止血一類新藥Halase的藥效學(xué)研究[J]. 中藥材, 2005,28(2): 125-128.

[3] 蘇薇薇.止血一類新藥Halase的長(zhǎng)期毒性試驗(yàn)[J]. 中藥材, 2005,28(3): 211-212.

[4] 吳忠.止血一類新藥Halase的一般藥理學(xué)研究[J]. 中藥材, 2005,28(4): 326-327.

[5] 中華人民共和國(guó)藥典委員會(huì). 中華人民共和國(guó)藥典四部[M] . 北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社, 2015:59-61.

[6] Amersham Pharmacia Biotech. Protein electrophoresis technical manual[M]. New York: Amersham Pharmacia Biotech, 1999:13-19.

[7] 張珍英,鄧慧敏,鄧芹英.香豆素類新基質(zhì)在基質(zhì)輔助激光解吸/電離飛行時(shí)間質(zhì)譜測(cè)定多糖和糖蛋白中的應(yīng)用[J]. 分析化學(xué), 2008,36(10): 1419-1422.

[8] 張龍翔,張庭芳,李令媛.生化實(shí)驗(yàn)方法和技術(shù) [M]. 2版.北京：高等教育出版社, 1997: 32-34.

New process for separation and purification of Haemocoagulase Acutus

DENGQin，WUZhong,PENGWei,WANGYonggang,SUWeiwei

(Guangdong Engineering & Technology Research Center for Quality and Efficacy Re-Evaluation of Post-Market TCM ∥ School of Life Sciences, Sun Yat-sen University, Guangzhou 510275，China)

Haemocoagulase Acutus (Halase), a new hemostatic in development, is a high-performance thrombin-like enzyme (TLE) derived from snake venom ofAgkistrodonacutus. Here we reported a new process established for separation and purification of Halase from snake venom. Combined with tangential flow filtration, ion exchange chromatography was conducted twice to effectively separate Halase, and two gel exclusion columns were used to remove pyrogen and salt. This new method is simple and efficient, and generates a high purity of Halase, making it a promising process in industrial scale application.

Haemocoagulase Acutus; separation; purification；process

10.13471/j.cnki.acta.snus.2016.06.025

2016-03-30

國(guó)家“重大新藥創(chuàng)制”科技重大專項(xiàng)(2011ZX09101-002-02)；廣東省重大科技專項(xiàng)(2011A080501004)

鄧沁(1988年生)，女；研究方向：現(xiàn)代生物醫(yī)藥工程；通訊作者：蘇薇薇;E-mail:lsssww@126.com

R973+.1

A

0529-6579(2016)06-0161-04