張金麗 ，曹文娟 ，熊喜峰 ，戴麗冰 ，劉志河

(廣州市紅十字會(huì)醫(yī)院∥暨南大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬廣州紅十字會(huì)醫(yī)院創(chuàng)傷外科研究所，廣東 廣州510220)

穗花杉雙黃酮抑制人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞血管形成的實(shí)驗(yàn)研究*

張金麗 ，曹文娟 ，熊喜峰 ，戴麗冰 ，劉志河

(廣州市紅十字會(huì)醫(yī)院∥暨南大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬廣州紅十字會(huì)醫(yī)院創(chuàng)傷外科研究所，廣東 廣州510220)

為探討穗花杉雙黃酮(Amentoflame, AF)對人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞ECV304血管形成及機(jī)制的影響，從而為穗花杉雙黃酮治療腫瘤及其他血管增生性疾病提供理論基礎(chǔ)，采用 MTS檢測AF對ECV304血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖的作用，細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)觀察AF對ECV304細(xì)胞遷移的影響，體外血管形成實(shí)驗(yàn)觀察AF對ECV304血管形成的影響，Western blot 檢測AF對ECV304細(xì)胞血管形成相關(guān)信號通路及蛋白如磷酸化AKT(p-AKT)、金屬基質(zhì)蛋白酶9(Matrix metalloproteinase-9, MMP-9)、促血管生成素2 ( angiopoietin 2，Ang 2 )表達(dá)影響。結(jié)果表明AF能夠抑制ECV304細(xì)胞的增殖作用，并呈梯度依賴性；AF具有抑制ECV304細(xì)胞遷移的作用，并且能夠抑制ECV304體外血管樣結(jié)構(gòu)的形成；Western blot結(jié)果顯示100 μmol/L 的AF能夠降低ECV304細(xì)胞p-AKT、MMP-9、Ang-2的蛋白表達(dá)。

血管生成； 內(nèi)皮細(xì)胞 ；穗花杉雙黃酮

血管生成(Angiogenesis)是指源于已存在的毛細(xì)血管和毛細(xì)血管后微靜脈的新的毛細(xì)血管性血管的生長。腫瘤血管生成是一個(gè)極其復(fù)雜的過程，一般包括包括血管內(nèi)皮基質(zhì)降解、內(nèi)皮細(xì)胞移行、內(nèi)皮細(xì)胞增殖、內(nèi)皮細(xì)胞管道化分支形成血管環(huán)和形成新的基底膜等步驟[1]。在這個(gè)復(fù)雜而有序的過程中，多種生物分子發(fā)揮關(guān)鍵作用。例如: 血管生成素( angiopoietin，Ang) ，包括Ang-1和Ang-2，血管內(nèi)皮生長因子( vascular endothelial growth factor，VEGF) 、血管內(nèi)皮生長因子受體(vascular endothelial growth factor receptors，VEGFR)，此外還有基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs) 和缺氧誘導(dǎo)因子( hypoxia inducible factor，HIF) 等。血管生成在腫瘤的發(fā)展轉(zhuǎn)移過程中起到重要作用，抑制這一過程將能明顯阻止腫瘤組織的發(fā)展和擴(kuò)散轉(zhuǎn)移。中藥文化是我們國家的珍貴資源寶庫，特別是經(jīng)過提純加工的中藥單體，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了它們在許多疾病治療中的藥理機(jī)制[2-4]。在治療腫瘤血管形成方面，目前研究較多的有人參皂苷、姜黃素等。潘子民等[3]建立小鼠卵巢癌模型，通過免疫組織化學(xué)檢測CD34和VEGF的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)人參皂苷Rg3 可抑制卵巢癌組織微血管密度的表達(dá)，并降低VEGF 的表達(dá)水平。王力強(qiáng)等[5]采用藻酸鹽實(shí)驗(yàn)檢測脂質(zhì)體姜黃素的抗血管生成作用，證實(shí)姜黃素能抑制血管生成。穗花杉雙黃酮是來源于卷柏科植物卷柏的一種雙黃酮類物質(zhì)，在傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中卷柏曾用來治療多種疾病，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究證明穗花杉雙黃酮還具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤等多種作用[6]。但關(guān)于穗花杉雙黃酮對血管內(nèi)皮細(xì)胞及血管生成方面的研究還不是很多，因此，本文將穗花杉雙黃酮作用于人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞，以觀察其對血管生成的影響及機(jī)制，從而為穗花杉雙黃酮防治腫瘤或其他血管增生疾病提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與儀器

人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞ECV304細(xì)胞株由本實(shí)驗(yàn)室保存。高糖DMEM、胎牛血清、胰酶及青鏈霉素均購于Gibco公司，穗花杉雙黃酮購自于上海融禾醫(yī)藥科技發(fā)展有限公司，二甲基亞砜(DMSO)及絲裂霉素C購自Sigma公司，MTS購于美國Promega公司，兔單克隆抗體Angiopoietin-2、兔多克隆抗體MMP-9購自于Abcam公司，兔單克隆抗體p-AKT購自于CST公司，兔GAPDH多克隆抗體購自上海依科賽生物制品有限公司， Matrigel 購自美國Coring，Bio-Rad化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)，OLYMPUS倒置相差顯微鏡，ZEISS熒光顯微鏡，Thermo 二氧化碳培養(yǎng)箱。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 在37 ℃，φ=5%CO2培養(yǎng)箱中，用含φ=l0%胎牛血清的高糖DMEM完全培養(yǎng)基(含2 mmol /L谷氨酰胺、100 U/mL青霉素和100 μg /mL鏈霉素)培養(yǎng)ECV304，每3天更換培養(yǎng)基，至細(xì)胞融合70%～80%對細(xì)胞進(jìn)行消化、傳代。

1.2.2 MTS檢測穗花杉雙黃酮對ECV304細(xì)胞活力的影響 取ECV304細(xì)胞以3 × 103/孔接種于96孔板中，貼壁過夜后分別加入含0、25、50、75 、100、150 μmol/L穗花杉雙黃酮的高糖DMEM完全培養(yǎng)基，每個(gè)濃度組設(shè)6個(gè)復(fù)孔，作用48 h后MTS法檢測比較不同濃度穗花杉雙黃酮對細(xì)胞生長的影響。

1.2.3 細(xì)胞劃痕檢測穗花杉雙黃酮對ECV304細(xì)胞遷移的影響 將細(xì)胞接種于六孔板中，待細(xì)胞完全融合，加入10 μg/mL絲裂霉素C處理4 h使細(xì)胞滅活，采用200 μL槍頭分別在六孔板孔中劃一“十”字劃痕，然后PBS洗3次，一孔加入φ=4%多聚甲醛固定作為0 h對照，其余分別加入不含或含有50、100 μmol/L穗花杉雙黃酮DMEM完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)16 h后，將細(xì)胞用φ=4%多聚甲醛固定，并于顯微鏡下測量計(jì)算細(xì)胞遷移距離，細(xì)胞遷移距離= 0 h劃痕寬度-16 h劃痕寬度。

1.2.4 血管形成實(shí)驗(yàn) 將融化的matrigel鋪于冰上預(yù)冷的24孔板中，每孔加入100 μL，然后放入37 ℃培養(yǎng)箱30 min，待matrigel完全凝固后，加入不含或含50、100 μmol/L穗花杉雙黃酮DMEM完全培養(yǎng)基的細(xì)胞懸液，每孔細(xì)胞數(shù)約1 × 104個(gè)，培養(yǎng)16 h后，采用φ=4%多聚甲醛固定，并置顯微鏡下拍照觀察血管狀結(jié)構(gòu)形成情況。

1.2.5 Western blot檢測穗花杉雙黃酮對ECV304細(xì)胞血管形成相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 細(xì)胞接種于培養(yǎng)皿中，加入不含或含50、100 μmol/L穗花杉雙黃酮的DMEM完全培養(yǎng)基作用48 h后，棄上清，PBS洗3次，加入RIPA細(xì)胞蛋白裂解液冰上裂解30 min，離心后收集上清測定蛋白濃度，SDS-PAGE電泳分離蛋白，半干轉(zhuǎn)膜儀轉(zhuǎn)膜，w=3%BSA封閉2 h，分別加入一抗p-AKT(1∶1 000)、Angiopoietin -2(1∶1 000)、MMP-9(1∶1 000),4 ℃冰箱搖床孵育過夜，次日TBST洗3次，分別加入相應(yīng)二抗，室溫孵育1 h，TBST洗3次后加入ECL發(fā)光液，放入化學(xué)發(fā)光凝膠成像儀顯影拍照。

1.2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用(x±s表示，采用SPSS 16.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析，組間兩兩比較采用t檢驗(yàn)，以P< 0.05 表示統(tǒng)計(jì)學(xué)上有顯著差異。

2 結(jié) 果

2.1 穗花杉雙黃酮對ECV304細(xì)胞活力的影響

從圖1我們可以看出，當(dāng)穗花杉雙黃酮濃度為50 μmol/L時(shí)，與對照組(0 μmol/L)相比，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P< 0.05)，隨著濃度的升高，其抑制細(xì)胞活力的作用增強(qiáng)，當(dāng)濃度超過100 μmol/L時(shí)，提高穗花杉雙黃酮的濃度，對ECV304細(xì)胞活力的抑制作用也不再增加。

圖1 不同濃度穗花杉雙黃酮對ECV304細(xì)胞增殖的影響Fig.1 The effects of different concentration amentoflame(AF) on ECV304 cell proliferation

2.2 細(xì)胞劃痕顯示穗花杉雙黃酮抑制ECV304 細(xì)胞遷移

如圖2所示， 經(jīng)顯微鏡下測量， 0 h細(xì)胞劃痕寬度約(112.00±6.17) μm(圖2Aa)，經(jīng)過16 h的細(xì)胞遷移，對照組劃痕寬度縮短到(29.00±3.28) μm(圖2Ab)，而50 μmol/L和100 μmol/L穗花杉雙黃酮組劃痕寬度分別為(80.44±2.00) μm (圖2Ac)和(110.77±4.00) μm (圖2Ad)，由此可推算出對照組及50 μmol/L和100 μmol/L穗花杉雙黃酮組遷移距離分別為(83.00+3.28)、(31.56+2.00)、(1.67+3.38) μm，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，各組間有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P< 0.05)。

2.3 穗花杉雙黃酮抑制ECV304細(xì)胞體外血管形成

在Matirgel 體外管樣結(jié)構(gòu)形成模型中，對照組可以觀察到完整的血管樣結(jié)構(gòu)，50 μmol/L AF組僅見個(gè)別細(xì)胞突觸連接，而100 μmol/L AF基本上無細(xì)胞連接。由此可表明穗花杉雙黃酮對ECV304成管樣結(jié)構(gòu)形成的抑制作用，且此抑制作用具有濃度依賴性，即穗花杉雙黃酮濃度越高，其對ECV304成管樣結(jié)構(gòu)形成的抑制作用就越強(qiáng)如(圖3所示)。

圖2 AF對ECV304細(xì)胞遷移的影響Fig.2 The effect of AF on ECV304 cell migration

圖3 AF對ECV304細(xì)胞體外血管樣結(jié)構(gòu)形成的影響Fig.3 The effects of AF on ECV304 cell tube formation

2.4 穗花杉雙黃酮對ECV304細(xì)胞血管形成相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

通過Western blotw我們對ECV304細(xì)胞血管形成相關(guān)蛋白的表達(dá)進(jìn)行了檢測，發(fā)現(xiàn)在100 μmol/L穗花杉雙黃酮的作用下，一些對血管形成有利的蛋白如促血管生成素2(Angiopoietin-2)、MMP-9表達(dá)下降，而且能夠抑制與細(xì)胞生長、分化、遷移密切相關(guān)的PI3K/AKT通路中關(guān)鍵蛋白AKT的磷酸化，但50 μmol/L濃度組作用不明顯(如圖4所示)。

圖4 Western blot 檢測AF對ECV304細(xì)胞p-AKT, Ang-2,MMP-9蛋白表達(dá)情況Fig.4 Western blot assay the expression of AF on ECV304 p-AKT, Ang-2 and MMP-9 protein

3 討 論

腫瘤血管是腫瘤賴以生長和轉(zhuǎn)移的基礎(chǔ)，當(dāng)既存血管提供的營養(yǎng)和氧不能滿足腫瘤的迅速生長和侵襲時(shí), 腫瘤會(huì)產(chǎn)生血管生成相關(guān)因子, 并改變局部微環(huán)境, 形成新生血管。在芽生過程中, 血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移、增殖、建立結(jié)點(diǎn), 最終形成穩(wěn)定的基底膜[7]。

穗花杉雙黃酮是一種黃酮類中藥單體，研究發(fā)現(xiàn)具有誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的作用[8-9]，在本文我們發(fā)現(xiàn)AF還具有抑制人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖的作用。內(nèi)皮細(xì)胞增殖是血管形成的基礎(chǔ)，除此之外，內(nèi)皮細(xì)胞的遷移也是血管形成的關(guān)鍵，細(xì)胞遷移是一個(gè)多步驟的動(dòng)態(tài)過程，在促進(jìn)血管生成和抑制血管生成的各種因子之間平衡精密調(diào)控下，血管內(nèi)皮細(xì)胞持續(xù)生長遷移, 延伸新生血管的頂端[7,10]。我們通過劃痕實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在采用絲裂霉素C處理后，在排除細(xì)胞增殖對細(xì)胞遷移距離的影響下，AF還是能夠明顯表現(xiàn)出對ECV304細(xì)胞遷移的抑制作用。最后，體外血管形成實(shí)驗(yàn)利用3D細(xì)胞基質(zhì)模型模擬體內(nèi)血管生成，也驗(yàn)證AF抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞形成血管的作用。

關(guān)于血管形成的影響因素很多，本研究中選取了幾個(gè)與細(xì)胞生長、遷移關(guān)系比較密切的因素初步探討了AF抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞血管形成的機(jī)制。PI3K/AKT信號途徑，不僅在細(xì)胞凋亡、增殖、遷移、極化、代謝中具有重要作用，也在肌肉和心肌纖維收縮、血管生成、干細(xì)胞自我更新中發(fā)揮重要功能[11-12]，非正常激活狀態(tài)的Akt 與多種疾病具有廣泛的聯(lián)系,尤其是腫瘤，Akt 的生物活性的全面激活需要S473 和T308 兩個(gè)位點(diǎn)的磷酸化[13], 本研究發(fā)現(xiàn)AF能夠抑制S473位點(diǎn)的磷酸化，由此我們推測AF抑制ECV304細(xì)胞的生長和遷移可能與AF抑制了AKT S473的磷酸化有關(guān)?；|(zhì)金屬蛋白酶(Matrix metalloproteinase, MMPs)是一種內(nèi)源性蛋白水解酶，MMP-9屬于明膠酶，在降解細(xì)胞外基質(zhì)各種成分中，最為重要的是降解Ⅳ型膠原，血管基膜的主要成分為Ⅳ型膠原，因此其在誘導(dǎo)新生血管的生成和重塑，促進(jìn)腫瘤浸潤和轉(zhuǎn)移方面起很重要的作用[14]。促血管生成素2 ( angiopoietin 2，Ang2) 由血管內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生，屬于血管生成素家族，該家族包括Ang-1，2，3，4 四個(gè)成員，Ang-1有助于促進(jìn)血管成熟，維持血管穩(wěn)定，而Ang-2在生長的血管中表達(dá)，通過與Tie-2受體相結(jié)合，競爭性的抑制Ang-1的作用，改變血管的穩(wěn)定性，并增加內(nèi)皮細(xì)胞對VEGF 等血管增殖因素的敏感性，誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞分裂增殖、萌芽、遷移，從而促進(jìn)血管生成和腫瘤生長的作用，與腫瘤血管生成的數(shù)目和密度、腫瘤大小、腫瘤侵襲及轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[15]。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)100 μmol/LAF能夠抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞細(xì)胞MMP-9及Ang-2的表達(dá)，因此我們推測這可能是AF抑制ECV304細(xì)胞遷移、增殖及血管形成的機(jī)制之一，但本實(shí)驗(yàn)中50 μmol/L AF對MMP-9和Ang-2的作用卻不是很確定，我們分析一方面可能與藥物濃度有關(guān)，在不同的藥物濃度下，藥物的作用效果不一定成線性關(guān)系，另一方面可能還有其他因素參與而在本實(shí)驗(yàn)中沒有檢測。

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Amentoflame inhibits human umbilical vein endothelial cells angiogenesis

ZHANGJinli,CAOWenjuan,XIONGXifei,DAILibing,LIUZhihe

(Guangzhou Institute of Traumatic Surgery，Guangzhou Red Cross Hospital，Medical Collage of Jinan University, Guangzhou 510220, China)

The present study was designed to investigate the effect of Amentoflame (AF) on the angiogenesis of human umbilical vein endothelial cells ECV304 and the mechanisms involved. MTS assay was performed to assess the effect of AF on ECV304 cell proliferation. Wound Healing was performed to assess the effect of AF on ECV304 cell migration. Matrigel assay was performed to assess the effect of AF on ECV304 tube formation. Western blotting was used to analyze the expression of cell angiogenesis related proteins such as angiopoietin 2 (Ang-2)、Matrix metalloproteinase-9 (MMP-9) and p-AKT in ECV304 treated with or without AF. The results demonstrated that AF inhibited the proliferation, migration and tube formation of ECV304 concentration-dependently. Western blot showed that the expression of p-AKT, Ang-2 and MMP-9 were significantly down-regulated by 100 μmol/l of AF.

angiogenesis；endothelial cells；Amentoflame

10.13471/j.cnki.acta.snus.2016.06.023

2016-04-08

廣州市衛(wèi)生局基金資助項(xiàng)目(20131A011038)；國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81272222)

張金麗(1979年生)，女；研究方向：腫瘤分子生物學(xué)；通訊作者：劉志河;E-mail:zliu0731@163.com

R961；R966

A

0529-6579(2016)06-0148-05