陳鴻飛，劉付麗，吳一泉，徐旭仲（溫州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院 麻醉科，浙江 溫州 325015）

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腎上腺素對布比卡因抑制大鼠心室肌細胞鈉電流的影響

陳鴻飛，劉付麗，吳一泉，徐旭仲
（溫州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院 麻醉科，浙江 溫州 325015）

［摘 要］目的：研究腎上腺素對較低濃度布比卡因所抑制的大鼠心室肌細胞鈉電流（INa）的影響。方法：采用急性酶解分離法獲得Sprague-Dawley雄性大鼠心室肌細胞，隨機分為2組（n=5），以全細胞膜片鉗技術(shù)記錄INa，觀察0.15 μg/mL腎上腺素對40 μmol/L布比卡因和50 μmol/L布比卡因所抑制的INa的影響。結(jié)果：40 μmol/L和50 μmol/L布比卡因?qū)Υ笫笮氖壹〖毎鸌Na抑制率分別為（50.2%±5.8%）和（62.7%±7.7%），差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。當加入0.15 μg/mL腎上腺素后，40 μmol/L布比卡因組抑制率變到（33.7%± 10.2%），差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；50 μmol/L布比卡因組抑制率變?yōu)椋?2.1%±7.3%），差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），腎上腺素對I-V曲線無明顯影響。結(jié)論：腎上腺素可以部分恢復較低濃度布比卡因所抑制的心室肌細胞INa，但其作用在較高濃度布比卡因中受到限制。

［關(guān)鍵詞］布比卡因；腎上腺素；鈉電流；心室肌細胞；大鼠

超聲引導神經(jīng)阻滯在臨床中得到廣泛應用［1-2］，但是并不能完全避免局麻藥中毒的發(fā)生［3-5］?，F(xiàn)局麻藥中毒治療指南將脂肪乳劑作為主要復蘇藥物，腎上腺素作為重要輔助用藥［6］。然而對于腎上腺素應用于局麻藥中毒的有效性，尚存爭議［7-8］。本課題組已證實腎上腺素可以逆轉(zhuǎn)高濃度布比卡因所抑制的L鈣通道電流（ICa-L）和瞬時外向鉀電流（Ito），但不能恢復鈉電流（INa）［9］。為進一步驗證腎上腺素是否可以恢復較低濃度布比卡因所抑制的INa，本研究采用全細胞膜片鉗技術(shù)，研究腎上腺素對較低濃度布比卡因所抑制的大鼠心室肌細胞INa的影響。

1　材料和方法

1.1材料

1.1.1實驗動物：Sprague-Dawley雄性大鼠，體質(zhì)量280～330 g，由溫州醫(yī)科大學實驗動物中心提供。1.1.2 實驗試劑：鹽酸布比卡因粉劑（批號100959 032），I型膠原酶，XIV型蛋白酶，牛血清白蛋白（BSA），N-2-羥乙基哌嗪-N-2-乙磺酸（HEPES）、乙二醇-四乙酸（EGTA）、氯化銫（Cs Cl）、谷氨酸、?；撬帷aCl2、Na2ATP、CsOH為Sigma公司產(chǎn)品。注射用腎上腺素（批號：1104111）為金輝制藥有限公司提供。其余化學試劑為國產(chǎn)分析純試劑。

1.2方法

1.2.1大鼠心肌細胞急性分離：采用腹腔注射5%水合氯醛7 mL/kg，無反射后迅速開胸取心臟。在4 ℃臺氏液（試劑單位均為mmol/L）（NaCl 137、KCl 5.4、CaCl21.8、MgCl21.0、NaH2PO40.33、HEPES 10、Glucose 10，NaOH調(diào)pH至7.4±0.5）中去除脂肪和心包膜，分離主動脈并插管到Langendorff心臟灌流裝置。用無鈣臺氏液灌流5 min，再用含1 mg/mL I型膠原酶、0.05 mg/mL XIV型蛋白酶和50 μmol/L CaCl2的無鈣臺氏液30 mL循環(huán)灌流約6～10 min。整個灌流系統(tǒng)溫度保持在35～37 ℃，流速10～12 mL/min。所有灌流液和KB液（KCl 40、KH2PO420、MgSO43.0、KOH 80、Glutamate 50、Taurine 20、HEPES 10、Glucose 10、EGTA 0.5，KOH調(diào)pH至7.35）均通以100% O2飽和15 min以上。然后將心臟從Langendorff裝置上取下，剪下心室部分，放入含10 mg/mL BSA的KB液中，用小剪刀將其剪碎至約1 mm3，再用玻璃滴管充分吹打2～3 min，用100目微孔尼龍膜過濾后，留取濾液室溫下穩(wěn)定1 h后備用。采用急性酶解分離法獲得心室肌細胞，保存于KB液中，室溫下穩(wěn)定1 h備用。INa細胞外液（Choline-Cl 140、NaCl 20、MgCl21.0、HEPES 5、Glucose 10、CsCl 4.6，CsOH調(diào)pH至7.4）和INa電極內(nèi)液（CsCl 120、NaCl 10、MgCl21.0、Na2ATP 5.0、EGTA 10、HEPES 10，CsOH調(diào)pH至7.3）使用前均預充氧15 min。

1.2.2實驗分組：心室肌細胞10個，隨機分為2組（n=5）：40 μmol/L布比卡因組和50 μmol/L布比卡因組。40 μmol/L布比卡因組：先記錄空白鈉通道電壓-電流（I-V）曲線（T0），然后灌流含40 μmol/L布比卡因的細胞外液5 min后（T1），記錄I-V曲線，再灌流含有40 μmol/L布比卡因和0.15 μg/mL腎上腺素的細胞外液5 min后（T2），記錄I-V曲線。50 μmol/L布比卡因組：先記錄空白鈉通道I-V曲線（T0），然后灌流含50 μmol/L布比卡因的細胞外液5 min后（T1），記錄I-V曲線，再灌流含有50 μmol/L布比卡因和0.15 μg/mL腎上腺素的細胞外液5 min后（T2），記錄記錄I-V曲線。

1.2.3全細胞膜片鉗技術(shù)測定鈉通道I-V曲線：膜片鉗放大器（EPC 10，HEKA公司，德國）通過A/D和D/ A數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換同計算機相連接。刺激信號及電壓、電流輸入信號的采集均由軟件pulse 8.0（HEKA公司，德國）控制。玻璃毛坯（SUTTER公司，美國）經(jīng)微電極拉制儀（P-97，SUTTER公司，美國）拉制而成，尖端直徑1～1.5 μm，入水電阻為1.0～2.5 MΩ。記錄INa時細胞內(nèi)外液中以CsCl代替KCl以消除鉀電流對INa的影響。為了降低INa的電流強度以減少鉗位誤差，降低細胞外液的NaCl濃度至20 mmol/L，其余NaCl成分用Choline-Cl代替以維持滲透壓平衡。

1.2.4刺激參數(shù)設(shè)置和數(shù)據(jù)采集：記錄INa的I-V曲線刺激方案為鉗制電位-90 mV，電位從-90 mV開始，以10 mV階躍刺激至+50 mV，波寬50 ms，刺激頻率0.2 Hz。根據(jù)INaV曲線結(jié)果，得到INa峰值，計算給藥后INa電流抑制率。

1.3統(tǒng)計學處理方法 采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行分析，實驗數(shù)據(jù)以±s表示，電流抑制率比較采用配對t檢驗，不同時間點的電流密度比較采用單因素方差分析及LSD法兩兩比較，同一時間點的組間電流密度比較采用成組t檢驗，使用Origin 8.0軟件對測量后的數(shù)據(jù)進行繪圖。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2　結(jié)果

2.1布比卡因?qū)Na峰值的抑制率的作用 所有細胞均在測試電壓-30 mv出現(xiàn)INa峰值。40 μmol/L布比卡因組中，40 μmol/L布比卡因?qū)Na峰值抑制率為（50.2%±5.8%），差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；50 μmol/L布比卡因濃度組中，50 μmol/L布比卡因?qū)Na峰值的抑制率為（62.7%±7.7%），差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。2組電流密度和原始電流圖，見表1和圖1。

表1　2組INa電流密度給藥前后比較（n=5，±s）

表1　2組INa電流密度給藥前后比較（n=5，±s）

與40 μmol/L布比卡因組比：aP＜0.05；同組內(nèi)與T0比：bP＜0.05；同組內(nèi)與T1比：cP＜0.05

組別　T0（PA/PF）　T1（PA/PF）　T2（PA/PF）40 μmol/L布比卡因組　-26.82±5.06　-13.19±1.29ba　-18.78±3.19bc50 μmol/L布比卡因組　-28.83±6.56　-10.40±0.97ab　-10.61±1.20ab

圖1 2組大鼠心室肌的INa原始電流圖

2.2腎上腺素對布比卡因所抑制的INa峰值抑制率的作用 給予含0.15 μg/mL腎上腺素的細胞外液后，在40 μmol/L布比卡因組中，INa峰值抑制率變?yōu)椋?3.7%±10.2%），與給藥前比差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.09）。在50 μmol/L布比卡因組中，INa峰值抑制率變?yōu)椋?2.1%±7.3%），與給藥前比差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。2組電流密度比較，見表1。

2.3腎上腺素對布比卡因抑制的對I-V曲線的影響

2組INa的激活電壓約為-60 mV，峰電流在-30 mV出現(xiàn)，反轉(zhuǎn)電位在+20 mV。40 μmol/L和50 μmol/L布比卡因?qū)λ兄噶铍妷簵l件下均引起INa降低，使I-V曲線上移，但并不改變激活電位和反轉(zhuǎn)電位。在40 μmol/L組中，0.15 μg/mL腎上腺素可使INa有所增加，但對激活電位和反轉(zhuǎn)電位無明顯影響，見圖2。

圖2　腎上腺素對40 μmol/L和50 μmol/L布比卡因存在時鈉通道I-V曲線的影響（n=5，±s）

3　討論

大劑量酰胺類局麻藥可造成嚴重循環(huán)虛脫甚至心搏驟停［10］，如不及時搶救，死亡率高，而且復蘇后并發(fā)癥多。酰胺類局麻藥的心臟毒性主要表現(xiàn)為心律失常和負性肌力作用。心臟毒性機制可能是布比卡因阻斷心肌細胞INa［11］、ICa和IK；干擾心肌細胞線粒體能量代謝等。

近年來靜脈注射脂肪乳的應用大大提高了布比卡因所致心搏驟停的復蘇率［12-14］，但對于腎上腺素是否能有效提高復蘇率和延長生存時間仍未達成共識。Liu等［15］報道了大鼠離體心臟腎上腺素、脂肪乳劑聯(lián)合使用比單獨使用脂肪乳劑或者腎上腺素效果好，但同樣有研究［7］表明腎上腺素并不能有效治療局麻藥所致毒性。目前明確的是腎上腺素可以激動心肌傳導系統(tǒng)和竇房結(jié)的β腎上腺素受體，從而增強心肌收縮力，加快心率，擴張冠脈而有利于解救局麻藥毒性。同時β腎上腺素受體激活后可作用于心肌細胞，改變INa、ICa和IK［16］，但腎上腺素通過β腎上腺素受體的激活影響局麻藥對心肌離子通道電流抑制的研究很少。

研究發(fā)現(xiàn)灌注濃度為40 μmol/L布比卡因可使離體大鼠心臟全部停搏［17］，而灌注濃度為30 μmol/L時，心臟只有部分停搏［15］，因此選擇40 μmol/L左右灌注濃度進行研究對腎上腺素在布比卡因所致心搏驟停的應用中具有一定指導意義。本項目組之前研究發(fā)現(xiàn)，腎上腺素可以逆轉(zhuǎn)高濃度布比卡因（100 μmol/L）所抑制的L型鈣通道電流（ICa-L）和瞬時外向鉀離子電流（ITo），但是對INa并無逆轉(zhuǎn)作用［9］。在此基礎(chǔ)上，本研究降低了布比卡因濃度，當濃度為50 μmol/L時，腎上腺素同樣不能逆轉(zhuǎn)布比卡因所抑制的INa；但再將布比卡因濃度降低到40 μmol/L時，腎上腺素可以部分恢復布比卡因所致的INa峰值抑制。提示當布比卡因在體內(nèi)的濃度較高時，腎上腺素的復蘇效果可能會受到影響。這也可能是在脂肪乳劑應用于局麻藥毒性解救前，而僅僅使用腎上腺素，復蘇成功率不高的原因之一。研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)β腎上腺素受體的激活可以增強INa，但是腎上腺素如何影響布比卡因?qū)π氖壹Na抑制的機制需要進一步研究確定。腎上腺素可以部分恢復較低濃度布比卡因所抑制的INa，但增加布比卡因濃度到一定程度（50 μmol/L）后，這一作用將受到限制。

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（本文編輯：吳彬）

Effect of epinephrine on inhibition of sodium current induced by bupivacaine in ventricular myocytes of rats

CHEN Hongfei，LIU Fuli，WU Yiquan，XU Xuzhong. Department of Anesthesiology，the First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University，Wenzhou，325015

Abstract:Objective: To determine the effect of epinephrine on inhibition of sodium current （INa） induced by bupivacaine inventricular myocytes of rats. Methods: The ventricular myocytes isolated from Sprague-Dawley rats by acute enzymatic dissociation were randomly divided into two groups （n=5）. The whole-cell patch clamp technique was used to record INain single ventricular myocytes and the effect of 0.15 ug/mL epinephrine inhibition of INaon induced by 40 or 50 μmol/L bupivacaine were observed. Results: The inhibition rates of 40 μmol/L bupivacaine or 50 μmol/L bupivacaine on INawas 50.2%±5.8 % or 62.7%±7.7 % （P＜0.05） respectively. After the administration of 0.15 ug/mL epinephrine，the inhibition rates in the 40 μmol/L bupivacaine group changed to be 33.7%±10.2 % （P＜0.05），and which was 62.1%±7.3% （P＞0.05） in the 50 μmol/L bupivacaine group. Epinephrine did not shift the I-V curve. Conclusion: Epinephrine can reverse inhibition of INainduced by low-concentration bupivacaine. This effect of epinephrine will be limited to a higher level concentration of bupivacaine.

Key words:bupivacaine； epinephrine； sodium current； ventricular myocytes； rats

通信作者：徐旭仲，教授，Email：xuzhong@263.net。

作者簡介：陳鴻飛（1986-），男，湖南邵陽人，住院醫(yī)師，碩士。

基金項目：國家自然科學基金資助項目（81470419）；浙江省科技廳國際科技合作專項（合作研究）項目（2012C24018）；溫州市科技局科研基金資助項目（Y20150239）。

收稿日期：2015-12-25

［中圖分類號］R614

［文獻標志碼］A

DOI:10.3969/j.issn.2095-9400.2016.05.003