陳雪婷， 陳　卉， 王洛臨， 李智勇， 施之琪， 徐文杰

（1.廣東省中醫(yī)藥工程技術(shù)研究院，廣東廣州510095；2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)，廣東廣州510405）

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星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法優(yōu)選廣金錢(qián)草提取工藝

陳雪婷1， 陳卉2， 王洛臨1， 李智勇1， 施之琪1， 徐文杰1

（1.廣東省中醫(yī)藥工程技術(shù)研究院，廣東廣州510095；2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)，廣東廣州510405）

摘要：目的 優(yōu)選廣金錢(qián)草中夏佛塔苷和異牡荊苷的提取工藝。方法 以乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取時(shí)間和加液量為自變量，以夏佛塔苷和異牡荊苷含有量的總評(píng)“歸一值”為因變量，采用星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法優(yōu)選廣金錢(qián)草提取工藝。結(jié)果 最佳提取工藝為12倍量65％乙醇提取2次，每次1.2 h。結(jié)論 建立的數(shù)學(xué)模型預(yù)測(cè)精確度高。

關(guān)鍵詞：廣金錢(qián)草；提取工藝；夏佛塔苷；異牡荊苷；星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法

廣金錢(qián)草為豆科植物廣金錢(qián)Desmodium styracifolium （Osb）Merr.的干燥地上部分，具有利濕退黃，利尿通淋等功效［1］，其主要含黃酮、生物堿、酚類(lèi)、鞣質(zhì)、多糖等多種化學(xué)成分［1-3］。目前，國(guó)內(nèi)對(duì)廣金錢(qián)草提取工藝的研究多采用精確度較低的正交設(shè)計(jì)或均勻設(shè)計(jì)，而且大多以單一成分的定量分析為考察指標(biāo)，顯然不足以滿(mǎn)足日益發(fā)展的質(zhì)量控制要求。本實(shí)驗(yàn)在單因素考察的基礎(chǔ)上，以夏佛塔苷和異牡荊苷含有量為考察指標(biāo)，采用星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法優(yōu)化廣金錢(qián)草提取工藝，旨在為該植物的進(jìn)一步合理研究及開(kāi)發(fā)利用奠定基礎(chǔ)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Agilent1200高效液相色譜儀，包括DAD檢測(cè)器、四元梯度泵（美國(guó)安捷倫公司）；Mettler XS205DU電子天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；KQ5200 DE數(shù)控超聲波清洗器（上海楚定分析儀器有限公司）。

1.2 試藥 夏佛塔苷對(duì)照品（批號(hào)111912-201301），購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；異牡荊苷對(duì)照品（批號(hào)Y-127-110705，純度≥98％），購(gòu)自成都瑞芬思生物科技有限公司。廣金錢(qián)草藥材為廣東市售，經(jīng)廣東省中醫(yī)研究所劉法錦研究員鑒定為豆科植物廣金錢(qián)Desmodium styracifolium （Osb）Merr.的干燥地上部分。藥用乙醇（批號(hào)20140629，廣東順寧葡萄糖藥業(yè)有限公司）；甲醇為色譜純；水為超純水；其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 夏佛塔苷和異牡荊苷含有量測(cè)定方法［4-5］

2.1.1 色譜條件 Kromacil C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相甲醇-水（32∶68），等度洗脫；檢測(cè)波長(zhǎng)272 nm；柱溫30℃；體積流量1.0 mL/min；進(jìn)樣量5 μL；理論塔板數(shù)按夏佛塔苷和異牡荊苷計(jì)算，均不低于3 000。

2.1.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱(chēng)取夏佛塔苷和異牡荊苷對(duì)照品適量，加甲醇制成每1 mL含夏佛塔苷106.425 μg、異牡荊苷20.6 μg的對(duì)照品溶液。

2.1.3 供試品溶液的制備 取廣金錢(qián)草提取液（按星點(diǎn)設(shè)計(jì)優(yōu)化試驗(yàn)所得）適量，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.1.4 線(xiàn)性關(guān)系考察 分別精密吸取“2.1.2”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液1、2、4、6、8、10 μL，在“2.1.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，以峰面積（Y）對(duì)質(zhì)量濃度（X）進(jìn)行線(xiàn)性回歸，得回歸方程分別為夏佛塔苷Y=2.129 7X+ 6.250 1（r=0.999 97）、異牡荊苷Y=4.302 5 X-1.032 7 （r=0.999 98），表明兩者分別在106.425～1 064.25 ng、20.6～206 ng范圍內(nèi)呈良好的線(xiàn)性關(guān)系。

2.1.5 精密度試驗(yàn) 精密吸取同一供試品溶液10 μL，連續(xù)進(jìn)樣6次，在“2.1.1”項(xiàng)色譜條件下測(cè)定。結(jié)果，夏佛塔苷、異牡荊苷峰面積RSD分別為0.27％、0.31％，表明儀器精密度良好。

2.1.6 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一樣品，按“2.1.3”項(xiàng)下方法平行制備6份供試品溶液，在“2.1.1”項(xiàng)色譜條件下測(cè)定。結(jié)果，夏佛塔苷、異牡荊苷含有量RSD分別為0.96％、1.02％，表明該方法重復(fù)性良好。

2.1.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取同一供試品溶液，分別于0、2、4、6、8、12 h進(jìn)樣，測(cè)定峰面積。結(jié)果，夏佛塔苷、異牡荊苷峰面積RSD分別為0.62％、0.58％，表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.8 加樣回收率試驗(yàn) 精密吸取含有量已知的廣金錢(qián)草提取液5 mL，置于10 mL量瓶中，分別精密加入“2.1.2”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液適量，甲醇定容至刻度，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液分別進(jìn)樣，測(cè)定各成分的含有量，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1　加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n=6）

2.1.9 樣品測(cè)定 按“2.1.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)行分析，結(jié)果見(jiàn)圖1。

1.夏佛塔苷 2.異牡荊苷?qǐng)D1　高效液相色譜圖

2.2 廣金錢(qián)草提取工藝的優(yōu)化

2.2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 根據(jù)單因素考察結(jié)果，選擇提取時(shí)間（A）、乙醇體積分?jǐn)?shù)（B）及加液量（C）作為考察因素，因提取次數(shù)為非連續(xù)變量，無(wú)法進(jìn)行回歸處理，故結(jié)合工業(yè)生產(chǎn)實(shí)際暫定為2次。根據(jù)星點(diǎn)設(shè)計(jì)原理，每因素設(shè)5水平，用代碼值-α，-1，0，1，α表示，因素水平見(jiàn)表2。然后，以夏佛塔苷、異牡荊苷含有量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，權(quán)重系數(shù)各設(shè)定為0.5，采用效應(yīng)面法優(yōu)化提取條件，試驗(yàn)安排及結(jié)果見(jiàn)表3。

表2　因素水平

表3　星點(diǎn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

2.2.2 模型擬合 采用Design-Expert8.0.6軟件對(duì)各因素進(jìn)行多元回歸分析，發(fā)現(xiàn)三次多項(xiàng)式模型擬合方程有顯著意義，回歸方程為Y=87.45 +5.98A-3.39B+3.96C-2.37AB+0.94AC+0.62BC-2.23A2-7.93B2-0.96C2-1.76A2C-6.05AB2-0.45BC2（r=0.974 3，p<0.05）。根據(jù)所確立的多項(xiàng)式模型，分別繪制因素A、B、C對(duì)綜合評(píng)分影響的效應(yīng)面圖，見(jiàn)圖2～4。由圖可知，綜合評(píng)分值隨提取時(shí)間增加，基本呈線(xiàn)性增加趨勢(shì)；加液量對(duì)綜合評(píng)分值的影響逐漸增加，當(dāng)達(dá)到12倍量左右時(shí)趨于平穩(wěn)；乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)綜合評(píng)分值的影響基本呈二次關(guān)系，在65％～70％時(shí)達(dá)到最大。

2.2.3 工藝條件優(yōu)化與預(yù)測(cè) 結(jié)合回歸模型的分析結(jié)果，軟件系統(tǒng)給出綜合評(píng)分值大于92分的優(yōu)化方案有39個(gè)，各因素取值范圍分別為提取時(shí)間1.1～1.29 h、乙醇體積分?jǐn)?shù)64.79％～69.90％、加液量11.59～12.75倍。綜合考慮生產(chǎn)周期及成本問(wèn)題，最終確定優(yōu)化提取條件為12倍量65％乙醇提取2次，每次1.2 h。

2.2.4 驗(yàn)證試驗(yàn) 按優(yōu)選方案進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，平行3次，測(cè)得夏佛塔苷和異牡荊苷平均提取率分別為67.23％和54.30％，再將測(cè)定結(jié)果與擬合方程預(yù)測(cè)值進(jìn)行比較，計(jì)算相對(duì)偏差［相對(duì)偏差=（預(yù)測(cè)值-實(shí)測(cè)值）/預(yù)測(cè)值× 100％］。結(jié)果，RSD為1.69％，表明所建立的數(shù)學(xué)模型預(yù)測(cè)性良好，優(yōu)選工藝條件重復(fù)性理想。

3 討論

廣金錢(qián)草主要分布于兩廣地區(qū)，屬于廣東道地藥材，黃酮類(lèi)化合物是其主要化學(xué)成分?，F(xiàn)代藥理研究顯示，其總黃酮能明顯增加小鼠心肌營(yíng)養(yǎng)性血流量，增加在體狗冠脈及腦血流量，對(duì)小鼠常壓缺氧耐受力有也顯著的增加作用［6-10］，故在工藝優(yōu)選時(shí)，選擇黃酮類(lèi)成分夏佛塔苷和異牡荊苷提取率的綜合評(píng)分作為評(píng)價(jià)指標(biāo)。先通過(guò)單因素試驗(yàn)，考察了乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取時(shí)間、溶劑量對(duì)兩者提取率的影響，再進(jìn)一步用星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法優(yōu)選這3個(gè)參數(shù)，得到最佳提取條件為加入12倍量65％乙醇，提取2次，每次1.2 h。

圖2　提取時(shí)間和乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)綜合評(píng)分的影響

圖3　提取時(shí)間和加液量對(duì)綜合評(píng)分的影響

圖4　乙醇體積分?jǐn)?shù)和加液量對(duì)綜合評(píng)分的影響

在工藝研究中，常用的正交設(shè)計(jì)和均勻設(shè)計(jì)均基于線(xiàn)性模型，預(yù)測(cè)性較差，精確度不高，而星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法很好地克服了這個(gè)缺點(diǎn)，通過(guò)非線(xiàn)性模型擬合來(lái)預(yù)測(cè)最佳實(shí)驗(yàn)條件，最大程度上優(yōu)化工藝條件或篩選最優(yōu)處方。本實(shí)驗(yàn)采用該方法對(duì)廣金錢(qián)草的提取工藝進(jìn)行了優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)預(yù)測(cè)值與實(shí)測(cè)值比較吻合，相對(duì)偏差較小，可為該植物的開(kāi)發(fā)利用奠定基礎(chǔ)［11-14］。

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網(wǎng)絡(luò)出版日期：2015-06-04

網(wǎng)絡(luò)出版地址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/31.1368.R.20150604.1502.001.htm l

作者簡(jiǎn)介：陳雪婷（1988—），女，碩士，中藥師，從事中藥質(zhì)量評(píng)價(jià)及中藥制劑研究開(kāi)發(fā)。Tel：15920473276，E-mail：397095007@qq.com

收稿日期：2015-02-12

doi：10.3969/j.issn.1001-1528.2016.05.046

中圖分類(lèi)號(hào)：R284.2

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：B

文章編號(hào)：1001-1528（2016）05-1171-04