王海麗

（寶雞市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心，陜西寶雞721013）

?

HPLC法同時(shí)測(cè)定兒童回春顆粒中4種成分

王海麗

（寶雞市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心，陜西寶雞721013）

摘要：目的 建立HPLC法同時(shí)測(cè)定兒童回春顆粒（葛根、黃芩、牛蒡子等）中葛根素、黃芩苷、牛蒡苷、鹽酸小檗堿。方法 分析采用Atlantis C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；以乙腈-0.05 mol/L磷酸二氫鉀溶液為流動(dòng)相，梯度洗脫；體積流量1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)280 nm；柱溫25℃。結(jié)果 葛根素、黃芩苷、牛蒡苷、鹽酸小檗堿的線性范圍分別為2.92～58.4 μg/mL（r=0.999 8）、2.12～42.4 μg/mL（r=0.999 9）、2.032～40.64 μg/mL（r=0.999 9）、0.80～16 μg/mL（r=0.999 9），平均加樣回收率在99.1％～100.3％之間。結(jié)論 該方法簡(jiǎn)便、靈敏、準(zhǔn)確，可用于兒童回春顆粒的質(zhì)量控制。

關(guān)鍵詞：兒童回春顆粒；葛根素；黃芩苷；牛蒡苷；鹽酸小檗堿；HPLC

兒童回春顆粒屬于常見(jiàn)兒童藥物，具有清熱解毒、透表豁痰的功效，用于急性驚風(fēng)、傷寒發(fā)熱、臨夜發(fā)燒、小便帶血、麻疹隱現(xiàn)不出引起的身熱咳嗽，以及赤痢、水瀉、食積、腹痛等癥，已應(yīng)用于臨床多年，效果較好。該制劑由黃連、水牛角濃縮粉、羚羊角、人中白（煅）、淡豆豉、大青葉、荊芥（去粗梗）、羌活、葛根、地黃、川木通、赤芍、黃芩、前胡、玄參（去蘆）、桔梗、柴胡、西河柳、升麻、牛蒡子（炒）20味中藥組成，而現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)［1］中，只有相關(guān)鑒別項(xiàng)，過(guò)于簡(jiǎn)單，無(wú)法保證藥品質(zhì)量。在兒童回春顆粒中，葛根具有解肌退熱、生津、透疹、升陽(yáng)止瀉的功效，其指標(biāo)成分為葛根素；黃芩具有清熱燥濕、瀉火解毒的功效，其指標(biāo)成分為黃芩苷；牛蒡子具有疏散風(fēng)熱、宣肺透疹、解毒利咽的功效，其指標(biāo)成分為牛蒡苷；黃連具有清熱燥濕、瀉火解毒的功效，其指標(biāo)成分為鹽酸小檗堿，因此選擇葛根素、黃芩苷、牛蒡苷、鹽酸小檗堿4種成分進(jìn)行研究。本實(shí)驗(yàn)在參考文獻(xiàn)［2-13］的基礎(chǔ)上，采用HPLC梯度洗脫法同時(shí)測(cè)定兒童回春顆粒中這4個(gè)成分的含有量，以期控制該藥物的質(zhì)量，為其質(zhì)量監(jiān)管提供科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Waters e2695HPLC色譜儀，包括Waters 2498檢測(cè)器；AE-240電子分析天平（十萬(wàn)分之一，瑞士梅特勒-托利多公司）；KQ-200VDE三頻數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 試藥 葛根素（批號(hào)110752-200912，含有量96.0％）、黃芩苷（批號(hào)110715-200514，含有量94.0％）、牛蒡苷（批號(hào)110819-21309，含有量95.6％）、鹽酸小檗堿（批號(hào)110713-201212，含有量86.7％）對(duì)照品均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院。乙腈為色譜純；水為超純水；其他試劑均為分析純。兒童回春顆粒（貴州漢方藥業(yè)有限公司，批號(hào)1404102、1406105、1409168）。陰性對(duì)照樣品（自制）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 Atlantis C18色譜柱（250 mm× 4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相為乙腈（A）-0.05 mol/L磷酸二氫鉀溶液（B）［14］，梯度洗脫（0～10 min，10％～20％A；10～20 min，20％A；20～35 min，20％～30％A；35～45 min，30％～40％A；45～55 min，40％～10％A）；體積流量1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)280 nm；柱溫25℃；進(jìn)樣量10 μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合對(duì)照品溶液 分別精密稱取葛根素、黃芩苷、牛蒡苷、鹽酸小檗堿對(duì)照品7.61、11.28、10.63、4.62 mg，置于5 mL量瓶中，甲醇超聲溶解并稀釋至刻度。精密移取上述對(duì)照品溶液各1 mL，置于同一10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，制得質(zhì)量濃度分別為0.146、0.212、0.203 2、0.080 mg/mL的混合對(duì)照品貯備液。

精密量取貯備液5 mL，置于50 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，0.45 μm微孔濾膜濾過(guò)，得到混合對(duì)照品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下測(cè)定，得到葛根素、黃芩苷、牛蒡苷、鹽酸小檗堿對(duì)照品的HPLC色譜圖。見(jiàn)圖1。

2.2.2 供試品溶液的制備 取兒童回春顆粒，研細(xì)，精密稱取2.0 g，置于具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50 mL，密塞，稱定質(zhì)量，超聲處理30 min，放冷，再稱定質(zhì)量，甲醇補(bǔ)充減失的質(zhì)量，搖勻，0.45 μm微孔濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。在“2.1”項(xiàng)色譜條件下測(cè)定，得到兒童回春顆粒樣品的HPLC色譜圖。見(jiàn)圖1。

2.2.3 陰性供試品溶液的制備 按制劑工藝制備不含葛根、黃芩、牛蒡子、黃連的陰性樣品，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下測(cè)定，HPLC色譜圖見(jiàn)圖1，陰性對(duì)照無(wú)干擾。

1.葛根素 2.黃芩苷 3.牛蒡苷 4.鹽酸小檗堿1.puerarin 2.baicalin 3.arctiin 4.berberine hydrochloride圖1　HPLC色譜圖Fig.1 HPLC chromatogram s

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 線性關(guān)系 分別精密吸取“2.2.1”項(xiàng)下對(duì)照品溶液1、2、4、6、8、10、15、20 μL，注入HPLC色譜儀，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下測(cè)定峰面積，以峰面積積分值（Y）對(duì)質(zhì)量濃度（μg/mL，X）進(jìn)行線性回歸，得4種活性成分的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程、相關(guān)系數(shù)（r）和線性范圍，見(jiàn)表1。由表可知，各成分線性關(guān)系良好。

表1　4種成分的線性關(guān)系Tab.1 Linear relationships of four constituents

2.3.2 精密度試驗(yàn) 精取吸取同一混合對(duì)照品溶液10 μL，重復(fù)進(jìn)樣6次（n =6），記錄峰面積。結(jié)果，葛根素、黃芩苷、牛蒡苷、鹽酸小檗堿峰面積RSD值分別為0.61％、0.45％、0.57％、0.73％，表明儀器精密度良好。

2.3.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取同一批號(hào)（1409168）兒童回春顆粒的供試品溶液適量，于0、2、6、12、24 h后進(jìn)樣，測(cè)定各成分的峰面積。結(jié)果，樣品中葛根素、黃芩苷、牛蒡苷、鹽酸小檗堿峰面積RSD值分別為0.59％、0.63％、0.48％、0.95％，表明在室溫條件下，供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.4 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批號(hào)（1409168）供試品適量，研細(xì)，精密稱取6份，按“2.2.2”項(xiàng)下方法平行制備6份供試品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下測(cè)定。結(jié)果，葛根素、黃芩苷、牛蒡苷、鹽酸小檗堿峰面積RSD值分別為0.71％、0.46％、0.92％、1.1％，表明該方法重復(fù)性良好。

2.3.5 加樣回收率試驗(yàn) 取各成分含有量已知的供試品（批號(hào)1409168，葛根素、黃芩苷、牛蒡苷、鹽酸小檗堿的質(zhì)量濃度分別為0.138、0.235、0.216、0.097 2 mg/g）適量，研細(xì)，精密稱取6份，置于具塞錐形瓶中，分別精密加入混合對(duì)照品溶液1 mL（即質(zhì)量濃度分別為0.146、0.212、0.203 2、0.080 mg/mL的混合對(duì)照品溶液），按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備，依法測(cè)定。結(jié)果表明，該方法回收率良好，見(jiàn)表2。

2.4 含有量測(cè)定 取兒童回春顆粒樣品3批，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下測(cè)定，記錄色譜峰面積，外標(biāo)法計(jì)算含葛根素、黃芩苷、牛蒡苷、鹽酸小檗堿的含有量，結(jié)果見(jiàn)表3。

表2　加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n=6）Tab.2 Results of recovery tests（n=6）

表3　含有量測(cè)定結(jié)果（n=3）Tab.3 Results of content determ ination（n=3）

3 討論

3.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇 本實(shí)驗(yàn)對(duì)4種成分在200～400 nm波長(zhǎng)處進(jìn)行掃描，發(fā)現(xiàn)葛根素在250 nm，黃芩苷在278、316 nm，牛蒡苷在278、229 nm，鹽酸小檗堿在235、265與345 nm處有最大吸收。參考《中國(guó)藥典》2010年版一部中黃芩、葛根、牛蒡子、黃連含有量測(cè)定項(xiàng)下的檢測(cè)波長(zhǎng)（葛根素250 nm、黃芩苷280 nm、牛蒡苷280 nm、鹽酸小檗堿265 nm［15］），最終選擇在280 nm處進(jìn)行測(cè)定，此時(shí)均有較好的吸收。

3.2 提取方法的選擇 在供試品溶液的制備過(guò)程中，為了保證樣品充分提取，本實(shí)驗(yàn)對(duì)50％、100％甲醇，30％、50％、70％乙醇分別進(jìn)行了考察。結(jié)果表明，100％甲醇超聲30 min時(shí)，提取效果最佳。

3.3 流動(dòng)相的選擇 兒童回春顆粒有效成分眾多，為了保證分離效果，本實(shí)驗(yàn)以甲醇-水、乙腈-水、乙腈-0.05 moL/L磷酸二氫鉀溶液為流動(dòng)相，進(jìn)行考察。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在流動(dòng)相中加入磷酸二氫鉀溶液時(shí)，保留時(shí)間更穩(wěn)定，分離效果較好，故選用乙腈-0.05 moL/L磷酸二氫鉀溶液作為流動(dòng)相，進(jìn)行梯度洗脫。

3.4 其他成分的考察 兒童回春顆粒中含20味中藥，本實(shí)驗(yàn)除對(duì)以上4種成分進(jìn)行研究外，還曾對(duì)羚羊角、水牛角、人中白等其他16味作了考察，發(fā)現(xiàn)其對(duì)實(shí)驗(yàn)均無(wú)干擾。其中，赤芍中芍藥苷在13 min時(shí)也可檢出，但因其含有量較低，故未納入研究范疇，而其他成分有待作進(jìn)一步探討。

參考文獻(xiàn)：

［1］ WS3-B-2276-97-1，國(guó)家藥品標(biāo)準(zhǔn)［S］.

［2］ 楊宏靜，陳 瑛，方應(yīng)權(quán).HPLC法同時(shí)測(cè)定五味消毒飲中4種成分［J］.中成藥，2015，37（4）：778-781.

［3］ 張 梅，任愛(ài)農(nóng)，楊玉蘭，等.HPLC波長(zhǎng)切換法同時(shí)測(cè)定清清顆粒中9個(gè)成分的含量［J］.藥物分析雜志，2015，35（1）：29-33.

［4］ 劉宏明，張 葉，聶 磊.HPLC法同時(shí)測(cè)定小兒柴桂退熱顆粒中葛根素、大豆苷、黃芩苷、大豆苷元、桂皮醛、黃芩素的含量［J］.藥物分析雜志，2014，34（6）：1038-1042.

［5］ 于 艷，于世杰，修麗麗，等.HPLC法同時(shí)測(cè)定祛瘀清胰顆粒中虎杖苷和黃芩苷［J］.中成藥，2013，35（5）：964-966.

［6］ 徐 強(qiáng).HPLC法同時(shí)測(cè)定茵梔黃分散片、顆粒、膠囊中綠原酸、梔子苷與黃芩苷［J］.中成藥，2013，35（5）：967-970.

［7］ 劉曉哲.HPLC法同時(shí)測(cè)定香砂六君丸中3種成分［J］.中成藥，2013，35（6）：1219-1221.

［8］ 閆高穎，董娟妮，楊 洋，等.HPLC法同時(shí)測(cè)定心腦康膠囊中6種成分［J］.中成藥，2013，35（8）：1672-1675.

［9］ 周 蓬，宋 青，馬 帥.HPLC法同時(shí)測(cè)定小兒豉翹清熱顆粒中梔子苷、芍藥苷、黃芩苷、黃芩素和漢黃芩素［J］.中成藥，2013，35（8）：1693-1696.

［10］ 史國(guó)生，林永強(qiáng)，徐麗華，等.HPLC法同時(shí)測(cè)定銀黃顆粒中6個(gè)咖啡?？鼘幩幔跩］.中成藥，2015，37（2）：311-315.

［11］ 劉書芬，梁倩倩，陳 巖，等.HPLC法同時(shí)測(cè)定防己黃芪湯中5種成分［J］.中成藥，2014，36（11）：2312-2315.

［12］ 汪 芳，林 吉，鄧麗紅，等.HPLC法同時(shí)測(cè)定加味穿心蓮散中6種成分［J］.中成藥，2014，36（12）：2521-2525.

［13］ 王鼎峰，胡 冰，王荔青.HPLC法同時(shí)測(cè)定丹燈通腦膠囊中阿魏酸、丹酚酸B、葛根素、野黃芩苷［J］.中成藥，2014，36（12）：2532-2536.

［14］ 牟英迪，林吉茂.HPLC程序波長(zhǎng)發(fā)測(cè)定牛黃上清丸中黃芩苷連翹苷和鹽酸小檗堿［J］.中成藥，2013，35（9）：1933-1936.

［15］ 國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典：2010年版一部［S］.北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010：458，1139，1183，1140.

Simultaneous determ ination of four consitituents in Ertong Huichun Granules

WANG Hai-li
（Baoji MuniciPal Food and Drug Testing Center，Baoji721013，China）

ABSTRACT：AIM To establish an HPLCmethod for simultaneously determining puerarin，baicalin，arctiin and berberine hydrochloride in Ertong Huichun Granules（puerariae Radix，Scutellariae Radix，Arctii Fructus，etc.）. METHODS The analysiswas performed on Atlantis C18column（250 mm×4.6 mm，5 μm）with its temperature maintained at25℃，mobile phase comprising of acetonitrile-0.05 mol/L potassium dihydrogen phosphate solution in a gradientelution manner，flow rate of1.0 mL/min，and detectivewavelength of280 nm.RESULTS The linear ranges of puerarin，baicalin，actiin and berberine hydrochloride were 2.92 -58.4 μg/mL（r=0.999 8），2.12 -42.4 μg/mL（r=0.999 9），2.032 -40.64 μg/mL（r=0.999 9）and 0.80 -16 μg/mL（r=0.999 9），respectively，whose average recoveries were 99.1％-100.3％.CONCLUSION This simple，sensible and accuratemethod can be applied in the quality control of Ertong Huichun Granules.

KEY WORDS：Ertong Huichun Granules；puerarin；baicalin；arctiin；berberine hydrochloride；HPLC

作者簡(jiǎn)介：王海麗，女，主管中藥師，從事中藥檢驗(yàn)及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)起草研究。Tel：（0917）3851855，E-mail：2778108526@qq.com

收稿日期：2015-09-06

doi：10.3969/j.issn.1001-1528.2016.05.016

中圖分類號(hào)：R927.2

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1001-1528（2016）05-1044-04