何廣吉+吳堅(jiān)毅

[摘要] 目的 探討高效液相色譜法（HPLC）測(cè)定芩霍雙清飲中黃芩苷的含量。 方法 采用HPLC測(cè)定，以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；采用依利特Hypersil ODS2 5 μm 4.6 mm×250 mm色譜柱，以甲醇-冰醋酸-水（50∶1∶50）為流動(dòng)相；流速：1.0 ml/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為278 nm，色譜柱溫度為30℃。理論板數(shù)按黃芩苷峰計(jì)算應(yīng)≥2500。用該方法測(cè)定芩霍雙清飲中黃芩苷的含量進(jìn)行分析。 結(jié)果 黃芩苷在278 nm波長(zhǎng)，每毫升含50～500 μg溶液范圍檢測(cè)峰面積存在非常好的重現(xiàn)性，穩(wěn)定性好，平均回收率為96.02%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）=0.29%（n=6）。 結(jié)論 高效液相色譜法檢測(cè)黃芩苷含量的方法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、重現(xiàn)性好，可應(yīng)用于芩霍雙清飲中黃芩苷的定量測(cè)定，作為控制藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)加以推廣及應(yīng)用。

[關(guān)鍵詞] 高效液相色譜法；黃芩苷；含量測(cè)定

[中圖分類號(hào)] R927.2 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1674-4721（2014）07（b）-0010-04

中成藥芩霍雙清飲主要由梔子、黃芩苷、連翹、淡竹葉、甘草以及薄荷油等中藥組成，具有疏風(fēng)散熱、清熱解毒[1]之功效。原標(biāo)準(zhǔn)收載于原衛(wèi)生部頒布的中藥成方制劑標(biāo)準(zhǔn)第十三冊(cè)[2]，收載了理化鑒別以及黃芩的薄層色譜鑒別，無(wú)具體含量測(cè)定項(xiàng)，不容易控制主成分的含量，使該制劑療效不確切，并為制假、造假提供了便利。本研究主要采用高效液相色譜法（high performance liquid chrotomogrphy，HPLC）[3-6]對(duì)黃芩苷的主成分含量進(jìn)行測(cè)定，從而為該成分的準(zhǔn)確測(cè)定提供一種科學(xué)的檢驗(yàn)依據(jù)。

1 儀器與方法

1.1 儀器

日本島津高效液相色譜儀，型號(hào)：LC-2010CHT；島津高效液相色譜紫外-可見光檢測(cè)器；島津高效液相色譜工作站；依利特Hypersil ODS2 5 μm 4.6 mm×250 mm色譜柱；UPW-20NE超純水純水器；MS205DU電子分析天平等儀器。

1.2 樣品與對(duì)照品

供試品：芩霍雙清飲，廣東萬(wàn)年青制藥有限公司；黃芩苷對(duì)照品：中國(guó)藥品生物制品檢定所提供，批號(hào)：110715-200514；試劑：色譜甲醇、磷酸、乙醇以及超純水等。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；采用依利特Hypersil ODS2 5 μm 4.6 mm×250 mm色譜柱，以甲醇-冰醋酸-水（50∶1∶50）為流動(dòng)相；流速：1.0 ml/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為278 nm，色譜柱溫度為30℃，進(jìn)樣量為10 μl，理論板數(shù)按黃芩苷峰計(jì)算應(yīng)不低于2500[7]，且陰性無(wú)干擾。

2.2 供試品溶液的制備

精密量取10 ml供試品溶液至錐形瓶中，加入70%乙醇溶液40 ml，先加熱回流3 h使其溶解，再轉(zhuǎn)移至50 ml的容量瓶中并稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，作為供試品溶液。

2.3 對(duì)照品溶液的制備

精密稱取黃芩苷對(duì)照品約12 mg，至200 ml的容量瓶中，加甲醇使其溶解并稀釋至刻度（制成每毫升約含60 μg的溶液），作為對(duì)照品溶液[3]。

2.4 測(cè)定法

分別精密量取對(duì)照品溶液、供試品溶液各10 μl，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算，即得。

2.5 樣品測(cè)定

分別取對(duì)照品、供試品3批依“2.2”制備供試品溶液與“2.3”制備對(duì)照品溶液，按照“2.1”色譜條件，“2.4”測(cè)定法進(jìn)樣，測(cè)定其峰面積以及計(jì)算百分含量并進(jìn)行比較，平均含量為12.6%，RSD=0.2%（n=3），結(jié)果表明本方法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確（表1、表2）。

2.6 線性關(guān)系考察

精密稱定黃芩苷對(duì)照品11.97 mg，按“2.3”項(xiàng)下方法制成濃度為54.85 μg/ml的對(duì)照溶液，取上述溶液分別進(jìn)樣5、10、15、20、25 μl，測(cè)定色譜峰面積，以對(duì)照品進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程Y=1140.7X-3.583，R2=1，結(jié)果表明黃芩苷在0.2992～1.7955 μg范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系（表3、圖1）。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一供試品溶液，依“2.2”制備供試品溶液，“2.1”色譜條件，“2.4”測(cè)定法分別在0、5、10、15、20、25 h依次進(jìn)樣，測(cè)得其峰面積以及計(jì)算百分含量進(jìn)行比較，RSD=0.30%（n=6），結(jié)果表明供試品溶液在25 h內(nèi)穩(wěn)定性良好（表4）。

2.8 精密度試驗(yàn)

取依“2.2”制備的同一供試品溶液，依“2.1”色譜條件，“2.4”測(cè)定法連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)定其峰面積以及計(jì)算百分含量進(jìn)行比較（表5）。

2.9 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一供試品溶液取樣6份，依“2.2”項(xiàng)下方法分別制備供試品溶液，“2.1”色譜條件，“2.4”測(cè)定法測(cè)定，測(cè)得其峰面積以及計(jì)算百分含量進(jìn)行比較，平均含量為12.7%，RSD=0.12%（n=6），結(jié)果表明本方法重復(fù)性良好（圖2，表6）。

2.10 陰性對(duì)照試驗(yàn)

根據(jù)處方比例以及制備工藝，配制成不含有黃芩苷的陰性樣品，按“2.2”供試品溶液的制備方法制備陰性供試品，按“2.1”色譜條件，“2.4”測(cè)定法進(jìn)樣，測(cè)定其峰面積以及計(jì)算百分含量進(jìn)行比較，結(jié)果顯示，陰性供試品溶液沒有與黃芩苷對(duì)照品溶液主峰保留時(shí)間一致的色譜峰（圖3～5）。

2.11 加樣回收率試驗(yàn)

取已知含量的供試品（含量為12.74%）10 ml，精密加入按“2.3”對(duì)照品溶液的制備方法制備的已知含量的對(duì)照品溶液（含量為12.07%）10 ml，依“2.2”供試品溶液的制備方法制備混合溶液，按“2.1”色譜條件，“2.4”測(cè)定法測(cè)定其峰面積以及計(jì)算百分含量進(jìn)行比較，計(jì)算黃芩苷的回收率，平均回收率為96.02%，RSD=0.29%（表7）。

3 討論

據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[7-11]，用HPLC法測(cè)定芩霍雙清飲中黃芩苷的含量，方法簡(jiǎn)便，結(jié)果準(zhǔn)確，可有效控制藥品質(zhì)量，確保療效。因此，筆者測(cè)定芩霍雙清飲中主成分黃芩苷的含量方法完全按照《中國(guó)藥典》2010年版規(guī)定的HPLC測(cè)定[8]。在此色譜條件下，黃芩苷主峰明顯，主峰前、后分離度均>4.0，理論塔板數(shù)均在3000以上，完全達(dá)到藥典含量檢測(cè)的規(guī)定和要求。在實(shí)際的操作過程中，還應(yīng)注意一些問題，如采用甲醇和70%乙醇溶液兩種溶劑分別對(duì)樣品進(jìn)行超聲提取，結(jié)果顯示，僅用甲醇超聲提取，樣品提取不是很完全，選用70%乙醇溶液先加熱回流3 h，再測(cè)定黃芩苷的含量，提取率高 。

黃芩為芩霍雙清飲劑中的主藥之一，黃芩苷為其主要活性成分，具有抗菌抗炎[12]、清熱解毒的作用[1]。因此選擇對(duì)黃芩苷進(jìn)行含量測(cè)定，可以有效控制配方中黃芩的質(zhì)量，進(jìn)而控制芩霍雙清飲的質(zhì)量。為提高藥品質(zhì)量，確保療效，筆者參考有關(guān)文獻(xiàn)[13-15]，采用HPLC法對(duì)黃芩中的主要成分黃芩苷進(jìn)行含量測(cè)定。取黃芩苷對(duì)照品溶液在200～400 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行波長(zhǎng)掃描，圖譜中黃芩苷在278 nm波長(zhǎng)處有最大吸收，故以278 nm為檢測(cè)波長(zhǎng)。曾試用Kromasil C18、Merck C18、CAPCELL PAK C18、Diamonsil C18等多種品牌的色譜柱，各色譜柱所得待測(cè)成分色譜峰峰形好，分離度高，本實(shí)驗(yàn)色譜柱采用依利特Hypersil ODS2 5 μm 4.6 mm×250 mm色譜柱。

實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)溶解樣品的溶劑對(duì)黃芩苷的峰形有很大影響，若只以甲醇作為溶劑，黃芩苷的色譜峰會(huì)出現(xiàn)明顯肩峰，而改用7%乙醇溶液作為溶劑后，肩峰完全消失，峰形明顯改善。此外，在樣品的制備過程中發(fā)現(xiàn)加入甲醇后，樣品會(huì)出現(xiàn)較多的絮狀沉淀，易阻止黃芩苷的進(jìn)一步析出和溶解，使樣品回收率偏低。

綜上所述，高效液相色譜法用于黃芩苷的臨床測(cè)定，方法簡(jiǎn)便、確切以及重現(xiàn)性較好，可應(yīng)用于芩霍雙清飲中黃芩苷的含量測(cè)定，應(yīng)加以推廣及應(yīng)用。

[參考文獻(xiàn)]

[1] 王媛，范全民.HPLC測(cè)定清熱解毒口服液中綠原酸與黃芩苷含量[J].中國(guó)藥品標(biāo)準(zhǔn)，2011，12（1）：35.

[2] 國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)中藥方成制劑第十三冊(cè)[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，1991：41.

[3] 方瀅芝，齊蘚紅.HPLC法測(cè)定復(fù)方芩芍口服液中黃芩苷的含量[J].中藥新藥與臨床藥理，2003，14（2）：119-120.

[4] 應(yīng)永飛，陳慧華，吳平谷.高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜在獸藥殘留分析中的應(yīng)用[J].分析科學(xué)學(xué)報(bào)，2008，24（3）：359-366.

[5] 羅小敏，陳建真.黃芩及其制劑中黃芩苷定量方法研究進(jìn)展[J].世界科學(xué)技術(shù)，2006，8（5）：76-79.

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[7] 國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典[M].北京.化學(xué)工業(yè)出版社，2010：612.

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[9] 劉同祥，王慧森.HPLC法測(cè)定復(fù)方蒲芩片中黃芩苷的含量[J].中國(guó)中醫(yī)藥信息雜志，2004，11（3）：225-226.

[10] 付艷敏，李伯軍.HPLC法測(cè)定雙黃消炎片中黃芩苷的含量[J].中國(guó)藥師，2008，11（6）：654-655.

[11] 左惠芳，張金成，張春成.HPLC法測(cè)定雙黃消炎片中黃芩苷的含量[J].西北藥學(xué)雜志，2008，23（4）：202-203.

[12] 侯艷寧，朱秀媛，陳桂芳.黃芩苷的抗炎機(jī)理[J].藥學(xué)學(xué)報(bào)，2000，35（3）：161.

[13] 梁遠(yuǎn)園，馮彪，祝晨蔯，等.HPLC法測(cè)定枳實(shí)藥材中橙皮苷與柚皮苷的含量[J].中國(guó)新藥與臨床藥理，2006， 17（5）：359.

[14] 呂凌，路小東，戴萍萍，等.RP-HPLC測(cè)定銀黃咀嚼片中綠原酸和黃芩苷的含量[J].中成藥，2007，29（6）：921-922.

[15] 劉剛，王海濤，趙淼，等.HPLC 法測(cè)定雙黃連口服液中綠原酸和黃芩苷的含量[J].解放軍藥學(xué)學(xué)報(bào)，2007，23（4）：299-301.

（收稿日期：2014-03-04 本文編輯：林利利）

3 討論

據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[7-11]，用HPLC法測(cè)定芩霍雙清飲中黃芩苷的含量，方法簡(jiǎn)便，結(jié)果準(zhǔn)確，可有效控制藥品質(zhì)量，確保療效。因此，筆者測(cè)定芩霍雙清飲中主成分黃芩苷的含量方法完全按照《中國(guó)藥典》2010年版規(guī)定的HPLC測(cè)定[8]。在此色譜條件下，黃芩苷主峰明顯，主峰前、后分離度均>4.0，理論塔板數(shù)均在3000以上，完全達(dá)到藥典含量檢測(cè)的規(guī)定和要求。在實(shí)際的操作過程中，還應(yīng)注意一些問題，如采用甲醇和70%乙醇溶液兩種溶劑分別對(duì)樣品進(jìn)行超聲提取，結(jié)果顯示，僅用甲醇超聲提取，樣品提取不是很完全，選用70%乙醇溶液先加熱回流3 h，再測(cè)定黃芩苷的含量，提取率高 。

黃芩為芩霍雙清飲劑中的主藥之一，黃芩苷為其主要活性成分，具有抗菌抗炎[12]、清熱解毒的作用[1]。因此選擇對(duì)黃芩苷進(jìn)行含量測(cè)定，可以有效控制配方中黃芩的質(zhì)量，進(jìn)而控制芩霍雙清飲的質(zhì)量。為提高藥品質(zhì)量，確保療效，筆者參考有關(guān)文獻(xiàn)[13-15]，采用HPLC法對(duì)黃芩中的主要成分黃芩苷進(jìn)行含量測(cè)定。取黃芩苷對(duì)照品溶液在200～400 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行波長(zhǎng)掃描，圖譜中黃芩苷在278 nm波長(zhǎng)處有最大吸收，故以278 nm為檢測(cè)波長(zhǎng)。曾試用Kromasil C18、Merck C18、CAPCELL PAK C18、Diamonsil C18等多種品牌的色譜柱，各色譜柱所得待測(cè)成分色譜峰峰形好，分離度高，本實(shí)驗(yàn)色譜柱采用依利特Hypersil ODS2 5 μm 4.6 mm×250 mm色譜柱。

實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)溶解樣品的溶劑對(duì)黃芩苷的峰形有很大影響，若只以甲醇作為溶劑，黃芩苷的色譜峰會(huì)出現(xiàn)明顯肩峰，而改用7%乙醇溶液作為溶劑后，肩峰完全消失，峰形明顯改善。此外，在樣品的制備過程中發(fā)現(xiàn)加入甲醇后，樣品會(huì)出現(xiàn)較多的絮狀沉淀，易阻止黃芩苷的進(jìn)一步析出和溶解，使樣品回收率偏低。

綜上所述，高效液相色譜法用于黃芩苷的臨床測(cè)定，方法簡(jiǎn)便、確切以及重現(xiàn)性較好，可應(yīng)用于芩霍雙清飲中黃芩苷的含量測(cè)定，應(yīng)加以推廣及應(yīng)用。

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[1] 王媛，范全民.HPLC測(cè)定清熱解毒口服液中綠原酸與黃芩苷含量[J].中國(guó)藥品標(biāo)準(zhǔn)，2011，12（1）：35.

[2] 國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)中藥方成制劑第十三冊(cè)[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，1991：41.

[3] 方瀅芝，齊蘚紅.HPLC法測(cè)定復(fù)方芩芍口服液中黃芩苷的含量[J].中藥新藥與臨床藥理，2003，14（2）：119-120.

[4] 應(yīng)永飛，陳慧華，吳平谷.高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜在獸藥殘留分析中的應(yīng)用[J].分析科學(xué)學(xué)報(bào)，2008，24（3）：359-366.

[5] 羅小敏，陳建真.黃芩及其制劑中黃芩苷定量方法研究進(jìn)展[J].世界科學(xué)技術(shù)，2006，8（5）：76-79.

[6] 龍艷華.黃菊顆粒中黃芩的有效成份黃芩苷的含量測(cè)定[J].中國(guó)藥師，2006，9（7）：646-647.

[7] 國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典[M].北京.化學(xué)工業(yè)出版社，2010：612.

[8] 苗明，李振陶.現(xiàn)代實(shí)用中藥質(zhì)量控制技術(shù)[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，2000：877-888.

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[10] 付艷敏，李伯軍.HPLC法測(cè)定雙黃消炎片中黃芩苷的含量[J].中國(guó)藥師，2008，11（6）：654-655.

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[12] 侯艷寧，朱秀媛，陳桂芳.黃芩苷的抗炎機(jī)理[J].藥學(xué)學(xué)報(bào)，2000，35（3）：161.

[13] 梁遠(yuǎn)園，馮彪，祝晨蔯，等.HPLC法測(cè)定枳實(shí)藥材中橙皮苷與柚皮苷的含量[J].中國(guó)新藥與臨床藥理，2006， 17（5）：359.

[14] 呂凌，路小東，戴萍萍，等.RP-HPLC測(cè)定銀黃咀嚼片中綠原酸和黃芩苷的含量[J].中成藥，2007，29（6）：921-922.

[15] 劉剛，王海濤，趙淼，等.HPLC 法測(cè)定雙黃連口服液中綠原酸和黃芩苷的含量[J].解放軍藥學(xué)學(xué)報(bào)，2007，23（4）：299-301.

（收稿日期：2014-03-04 本文編輯：林利利）

3 討論

據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[7-11]，用HPLC法測(cè)定芩霍雙清飲中黃芩苷的含量，方法簡(jiǎn)便，結(jié)果準(zhǔn)確，可有效控制藥品質(zhì)量，確保療效。因此，筆者測(cè)定芩霍雙清飲中主成分黃芩苷的含量方法完全按照《中國(guó)藥典》2010年版規(guī)定的HPLC測(cè)定[8]。在此色譜條件下，黃芩苷主峰明顯，主峰前、后分離度均>4.0，理論塔板數(shù)均在3000以上，完全達(dá)到藥典含量檢測(cè)的規(guī)定和要求。在實(shí)際的操作過程中，還應(yīng)注意一些問題，如采用甲醇和70%乙醇溶液兩種溶劑分別對(duì)樣品進(jìn)行超聲提取，結(jié)果顯示，僅用甲醇超聲提取，樣品提取不是很完全，選用70%乙醇溶液先加熱回流3 h，再測(cè)定黃芩苷的含量，提取率高 。

黃芩為芩霍雙清飲劑中的主藥之一，黃芩苷為其主要活性成分，具有抗菌抗炎[12]、清熱解毒的作用[1]。因此選擇對(duì)黃芩苷進(jìn)行含量測(cè)定，可以有效控制配方中黃芩的質(zhì)量，進(jìn)而控制芩霍雙清飲的質(zhì)量。為提高藥品質(zhì)量，確保療效，筆者參考有關(guān)文獻(xiàn)[13-15]，采用HPLC法對(duì)黃芩中的主要成分黃芩苷進(jìn)行含量測(cè)定。取黃芩苷對(duì)照品溶液在200～400 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行波長(zhǎng)掃描，圖譜中黃芩苷在278 nm波長(zhǎng)處有最大吸收，故以278 nm為檢測(cè)波長(zhǎng)。曾試用Kromasil C18、Merck C18、CAPCELL PAK C18、Diamonsil C18等多種品牌的色譜柱，各色譜柱所得待測(cè)成分色譜峰峰形好，分離度高，本實(shí)驗(yàn)色譜柱采用依利特Hypersil ODS2 5 μm 4.6 mm×250 mm色譜柱。

實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)溶解樣品的溶劑對(duì)黃芩苷的峰形有很大影響，若只以甲醇作為溶劑，黃芩苷的色譜峰會(huì)出現(xiàn)明顯肩峰，而改用7%乙醇溶液作為溶劑后，肩峰完全消失，峰形明顯改善。此外，在樣品的制備過程中發(fā)現(xiàn)加入甲醇后，樣品會(huì)出現(xiàn)較多的絮狀沉淀，易阻止黃芩苷的進(jìn)一步析出和溶解，使樣品回收率偏低。

綜上所述，高效液相色譜法用于黃芩苷的臨床測(cè)定，方法簡(jiǎn)便、確切以及重現(xiàn)性較好，可應(yīng)用于芩霍雙清飲中黃芩苷的含量測(cè)定，應(yīng)加以推廣及應(yīng)用。

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[2] 國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)中藥方成制劑第十三冊(cè)[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，1991：41.

[3] 方瀅芝，齊蘚紅.HPLC法測(cè)定復(fù)方芩芍口服液中黃芩苷的含量[J].中藥新藥與臨床藥理，2003，14（2）：119-120.

[4] 應(yīng)永飛，陳慧華，吳平谷.高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜在獸藥殘留分析中的應(yīng)用[J].分析科學(xué)學(xué)報(bào)，2008，24（3）：359-366.

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（收稿日期：2014-03-04 本文編輯：林利利）