麻曉鴿，王松濤，覃飛，貢文武24

（華南師范大學(xué) 體育科學(xué)學(xué)院，廣東 廣州 510006）

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不同強(qiáng)度激光對(duì)遞增負(fù)荷運(yùn)動(dòng)大鼠心臟炎性損傷和CD8+T淋巴細(xì)胞表達(dá)的影響

麻曉鴿，王松濤，覃飛，貢文武24

（華南師范大學(xué) 體育科學(xué)學(xué)院，廣東 廣州 510006）

摘 要：觀察遞增負(fù)荷運(yùn)動(dòng)大鼠心臟炎癥損傷和CD8+T淋巴細(xì)胞的改變及其關(guān)系，探討不同強(qiáng)度激光治療對(duì)大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)心臟的保護(hù)作用。8周齡雄性SD大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組（C），54只；實(shí)驗(yàn)組54只，分為低強(qiáng)度激光+運(yùn)動(dòng)組（LE）、高強(qiáng)度激光+運(yùn)動(dòng)組（HE）、運(yùn)動(dòng)組（E），每組18只。各組分別在2、4、6周末時(shí)取材，評(píng)定大鼠心臟系數(shù)、心臟整體形態(tài)、心肌病理積分、心肌CD8+T淋巴細(xì)胞及心肌細(xì)胞凋亡情況。結(jié)果：與C組比較，E組大鼠6周末時(shí)心肌細(xì)胞呈現(xiàn)明顯炎性浸潤(rùn)，心肌纖維扭曲、腫脹及斷裂，病理積分呈顯著性差異（P＜0.05）；大鼠血清TNF-α增加、心肌CD8+T淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)、心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)增加呈非常顯著性差異（P＜0.01）。同時(shí)期（2、4、6周末）LE組與E組比較，心肌細(xì)胞炎性略輕。6周末時(shí)LE組CD8+T淋巴細(xì)胞及心肌細(xì)胞凋亡數(shù)較C組均上升，而較E組均非常顯著性下降（P＜0.01）。結(jié)果說(shuō)明低激光治療可在一定程度上減輕心肌內(nèi)炎癥浸潤(rùn)和致炎性因子，降低心肌病理程度，抑制心肌細(xì)胞的凋亡進(jìn)程。

關(guān) 鍵 詞：運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)；心肌炎性損傷；遞增負(fù)荷運(yùn)動(dòng)；低強(qiáng)度激光；CD8+T淋巴細(xì)胞；大鼠

科學(xué)合理的運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練可使心臟產(chǎn)生良好的適應(yīng)，提高心肌功能，而不當(dāng)?shù)拇髲?qiáng)度運(yùn)動(dòng)或訓(xùn)練則可對(duì)機(jī)體造成不同程度的損傷，尤其是心臟作為最敏感的動(dòng)力泵血器官，易產(chǎn)生病理性心肌損傷。已有研究證實(shí)，重復(fù)性的大強(qiáng)度應(yīng)力刺激會(huì)導(dǎo)致心肌炎癥、心肌纖維化、心衰和室壁運(yùn)動(dòng)異常等［1］。心肌細(xì)胞凋亡及局部炎癥因子浸潤(rùn)可能是導(dǎo)致大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)誘發(fā)心肌損傷和心功能障礙的重要機(jī)制之一［2］。有的研究也證實(shí)免疫系統(tǒng)和炎癥在多種代謝性疾病，如胰島素抵抗、2型糖尿病、動(dòng)脈粥樣硬化、非酒精性脂肪肝等疾病的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起著重要作用［3］。因此，炎癥可能是心血管疾病和大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)所致心功能異常的重要啟動(dòng)因素。T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫是機(jī)體致病的重要機(jī)制，其介導(dǎo)的細(xì)胞免疫形式主要是CD4+T細(xì)胞介導(dǎo)的遲發(fā)型超敏反應(yīng)及CD8+T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性反應(yīng)，而CD8+T淋巴細(xì)胞在多種免疫性及炎癥性疾病，如獲得性免疫缺陷綜合征、腫瘤等的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要作用。但目前，CD8+T淋巴細(xì)胞在心肌細(xì)胞病變中的免疫調(diào)節(jié)作用仍然不清。因此，探討大強(qiáng)度遞增負(fù)荷運(yùn)動(dòng)導(dǎo)致的心肌損傷及其相關(guān)免疫調(diào)節(jié)機(jī)制，對(duì)于解決運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)和臨床醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的相關(guān)疾病和健康問(wèn)題均具有重要意義。激光醫(yī)學(xué)的發(fā)展促進(jìn)了運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)領(lǐng)域?qū)す獾闹匾暋＜す馐饔糜谏锝M織時(shí)，不會(huì)造成生物組織不可逆的損傷，但可刺激機(jī)體產(chǎn)生一系列生理生化反應(yīng)，對(duì)組織或機(jī)體起到調(diào)節(jié)、增強(qiáng)或抑制作用。低強(qiáng)度激光（Low-level laser therapy，LLLT）在調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)、減緩疼痛、抑制深層組織損傷等方面療效已得到公認(rèn)［4-5］，而運(yùn)動(dòng)性心肌損傷的激光調(diào)節(jié)作用，目前尚缺乏研究。綜上所述，我們推測(cè)低強(qiáng)度激光可能會(huì)在調(diào)節(jié)大強(qiáng)度遞增負(fù)荷運(yùn)動(dòng)所致心臟結(jié)構(gòu)和功能性異常中發(fā)揮重要作用，其機(jī)制可能涉及CD8+T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥性免疫反應(yīng)。因此，本研究在大鼠遞增負(fù)荷運(yùn)動(dòng)模型基礎(chǔ)上，通過(guò)檢測(cè)炎癥因子TNF-α、心肌組織學(xué)改變、心肌CD8+T淋巴細(xì)胞表達(dá)和心肌細(xì)胞凋亡等情況，揭示大負(fù)荷運(yùn)動(dòng)所致的心肌炎癥性損傷，并探討CD8+T淋巴細(xì)胞在其中的調(diào)控機(jī)制。同時(shí)，采用兩種不同強(qiáng)度的激光（低強(qiáng)度和高強(qiáng)度）進(jìn)行干預(yù)治療，進(jìn)一步探索不同強(qiáng)度激光對(duì)遞增負(fù)荷大鼠心肌炎性改變和CD8+T淋巴細(xì)胞表達(dá)的影響，為運(yùn)動(dòng)性心臟損傷的保護(hù)提供相應(yīng)的干預(yù)靶點(diǎn)及實(shí)驗(yàn)支持。

1 研究對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象及分組

108只SPF 8周齡雄性SD大鼠（廣東省中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，許可證號(hào)：SCXK（粵）2008-0020；NO:0043379，粵監(jiān)證字F2008A002，體重180～200 g）。分籠飼養(yǎng)，每籠4～5只，溫度（24±2） ℃，相對(duì)濕度45%～65%，自然光照，自由攝取食物和水。動(dòng)物處置符合《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)性意見(jiàn)》（2006，科技部）。

大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組（C，54只），正常喂養(yǎng)，不運(yùn)動(dòng)，用于判別大鼠生長(zhǎng)對(duì)實(shí)驗(yàn)指標(biāo)的影響。實(shí)驗(yàn)組54只分為低強(qiáng)度激光+運(yùn)動(dòng)組（LE，18只）、高強(qiáng)度激光+運(yùn)動(dòng)組（HE，18只）、運(yùn)動(dòng)組（E，18只）3組，分別進(jìn)行遞增負(fù)荷運(yùn)動(dòng)和激光治療干預(yù)。各組在第2、4、6周末時(shí)隨機(jī)抽樣，取材測(cè)定相關(guān)指標(biāo)。

1.2 運(yùn)動(dòng)方案

運(yùn)動(dòng)組和激光治療組大鼠進(jìn)行逐級(jí)遞增負(fù)荷跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練6周，坡度為0°，30 min/次，1次/d，6 d/周（周日休息）。第1周運(yùn)動(dòng)負(fù)荷為10 m/min，第2周負(fù)荷遞增至20 m/min，隨后每周遞增負(fù)荷量為5 m/min，至第6周，跑臺(tái)速度達(dá)到40 m/min最大負(fù)荷強(qiáng)度。

1.3 激光治療方案

激光治療采用He-Ne半導(dǎo)體激光治療儀，每天在大鼠運(yùn)動(dòng)后2 h，分別采用低強(qiáng)度（1 mW，6.79 J/cm2）和高強(qiáng)度（2 mW，13.58 J/cm2）激光，在大鼠鼻翼兩側(cè)照射2 min。

1.4 測(cè)試指標(biāo)及方法

主要試劑：R-TNF-α試劑盒（Multisciences，中國(guó)）；CD8+T細(xì)胞試劑盒（Abcam，UK）；TUNEL凋亡檢測(cè)試劑盒（Roche，USA）。

1）組織取材：大鼠末次運(yùn)動(dòng)后休息1 d，隔日晨質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%水合氯醛（3.5～4.5 mL/kg）腹腔注射麻醉，打開(kāi)腹腔，腹主動(dòng)脈取血，靜置后離心取血清，-80 ℃保存待測(cè)。立即取出心臟放入預(yù)冷的生理鹽水中，洗去血跡，去除結(jié)締組織，用濾紙吸干，分別記錄心臟質(zhì)量（Hw）與體質(zhì)量分?jǐn)?shù)（Bw）；后放入質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%的中性甲醛內(nèi)固定，待HE及免疫組化分析。

2）大鼠心肌組織切片、HE染色及病理學(xué)檢測(cè)：心肌組織切片經(jīng)過(guò)常規(guī)HE染色，觀察心肌纖維變化及心臟組織炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)情況；參照Rezkalla［6］的方法計(jì)算心肌病理組織學(xué)積分，即每張切片隨機(jī)取5個(gè)400倍視野，計(jì)算每個(gè)視野中炎性細(xì)胞浸潤(rùn)及壞死面積與整個(gè)面積的比值。無(wú)病變計(jì)0分、病變面積＜25%計(jì)1分、25%～50%計(jì)2分、50%～75%計(jì)3分、＞75%計(jì)4分，以此判定心肌炎癥的變化情況。

3）免疫組化法（SP法）檢測(cè)心肌組織中CD8+T淋巴細(xì)胞的表達(dá)：常規(guī)脫蠟、水化，枸櫞酸修復(fù)液高壓抗原修復(fù)5～8 min。質(zhì)量分?jǐn)?shù)3%H2O2室溫下孵育15 min，以阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化氫酶活性，PBS洗滌，滴加鼠抗兔CD8+T細(xì)胞（1∶100）單克隆抗體。4 ℃冰箱過(guò)夜，PBS洗滌，均勻滴加生物素標(biāo)記的抗鼠IgG抗體-HRP多聚體，37 ℃孵育20 min，PBS洗滌，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，脫水、透明、封片。陰性對(duì)照組采用PBS代替一抗，其他步驟相同。光鏡下觀察，每張片子隨機(jī)選取10個(gè)400倍視野，每個(gè)視野計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目（陽(yáng)性細(xì)胞為胞膜棕黃染色），并將CD8+T淋巴陽(yáng)性細(xì)胞所占浸潤(rùn)炎癥細(xì)胞數(shù)的平均百分比作為陽(yáng)性細(xì)胞百分率。

4）TUNEL法檢測(cè)心肌細(xì)胞凋亡：切片脫蠟、水化，PBS沖洗后蛋白酶K消化，TDT酶/生物素-dUTP反應(yīng)液等處理，具體嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明進(jìn)行操作。光鏡下正常細(xì)胞核呈藍(lán)色，凋亡細(xì)胞核呈現(xiàn)棕黃色。結(jié)果判定：隨機(jī)選取10個(gè)400高倍視野的心肌細(xì)胞總數(shù)及陽(yáng)性染色心肌細(xì)胞數(shù)目，按照Nsrula方法計(jì)算，公式：陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)×100%計(jì)算心肌細(xì)胞凋亡百分率。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有數(shù)據(jù)均采用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件處理，測(cè)試結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。正態(tài)性檢驗(yàn)采用Kolmogorov-Smirnov Test法；方差齊性檢驗(yàn)采用Homogeneity of Variances法。正態(tài)分布數(shù)據(jù)采用單因素方差分析（one-way ANOVA），若方差齊性，以最小顯著差法（LSD法）進(jìn)行兩兩比較；若方差不齊，以Dennett’s T3法進(jìn)行兩兩比較。

2 研究結(jié)果及分析

2.1 六周遞增負(fù)荷運(yùn)動(dòng)大鼠心肌炎性改變

實(shí)驗(yàn)中對(duì)照組（C）大鼠正常喂養(yǎng)，不運(yùn)動(dòng)，用于判別生長(zhǎng)對(duì)大鼠實(shí)驗(yàn)指標(biāo)的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組各指標(biāo)（心肌組織病理檢測(cè)，細(xì)胞因子TNF-α、心肌CD8+T淋巴細(xì)胞和心肌凋亡指數(shù)）在各周之間無(wú)顯著性差異（P＞0.05），提示6周的自然生長(zhǎng)周期對(duì)上述各指標(biāo)均無(wú)顯著影響。但與對(duì)照組（C）比較，6周遞增負(fù)荷運(yùn)動(dòng)（E）可導(dǎo)致大鼠心肌呈現(xiàn)顯著的炎性改變（見(jiàn)表1）

表1　遞增負(fù)荷運(yùn)動(dòng)所致心肌炎性改變（±s）

表1　遞增負(fù)荷運(yùn)動(dòng)所致心肌炎性改變（±s）

與C組比較，1）P＜0.05，2）P＜0.01

組別 　n/只 　　心肌病理積分 　Ρ（TNF-α）/（pg·mL-1）　CD8+T淋巴細(xì)胞百分率/% 心肌細(xì)胞凋亡率/% C 　6 　0 　11.18±5.53 　0.34±0.12 　0.88±0.23 E 　6 　2.93±0.561）　15.06±3.3 　22.88±5.072）　52.12±7.142）差值 　6 　2.93±0.56 　3.88±2.69 　22.53±5.02 　51.24±7.14

2.2 激光對(duì)6周遞增負(fù)荷運(yùn)動(dòng)大鼠心肌炎性損傷的影響

1）心臟重量及心臟系數(shù)。

研究結(jié)果顯示不同時(shí)間點(diǎn)（2、4、6周）的低強(qiáng)度激光治療組（LE）的心臟質(zhì)量、體質(zhì)量和心臟系數(shù)均低于同時(shí)間段的HE和E組，尤其是6周的E組大鼠心臟質(zhì)量、體質(zhì)量都較2周的HE組和6周的LE組高，差異非常顯著（P＜0.01）；其他組之間差異則不顯著（見(jiàn)表2）。

表2　激光對(duì)6周遞減運(yùn)動(dòng)負(fù)荷小鼠心臟質(zhì)量、體質(zhì)量和心臟系數(shù)的影響（±s）

表2　激光對(duì)6周遞減運(yùn)動(dòng)負(fù)荷小鼠心臟質(zhì)量、體質(zhì)量和心臟系數(shù)的影響（±s）

1）各組2周與4周比較，P＜0.05；2）4周與6周比較，P＜0.05；3）2周與6周比較，P＜0.05；4）2周與6周比較，P＜0.01；5） E組與LE組比較，P＜0.05；6）LE與HE比較，P＜0.01

心臟質(zhì)量/g 　 　　體質(zhì)量/g 　　心臟系數(shù)組別n/ 只 　2周 　4周 　6周 　2周 　4周 　6周 　2周 　4周 　6周E 　6 　1.012 4± 0.135 0 1.066 9± 0.122 7 1.116 1± 0.151 8 278± 17.81 288.83± 25.33 317.4± 16.473）0.003 64± 0.000 358 0.003 69± 0.000 214 0.003 52± 0.000 346 LE 　6 　0.968 1± 0.045 4 1.093 5± 0.064 4 0.940 0± 0.0516 12）5）273.17± 22.5 308.25± 18.151）307.17± 16.193）0.003 56± 0.000 202 0.003 55± 0.000 206 0.003 06± 0.000 195 HE 　6 　1.012 2± 0.084 7 1.123 7± 0.125 8 1.249 4± 0.207 94）6）274± 23.58 295± 28.71 327.4± 48.424）0.003 71± 0.000 377 0.003 84± 0.000 579 0.003 90± 0.000 9606）

2）心肌組織病理學(xué)。

心肌組織切片經(jīng)過(guò)HE染色，參照Rezkalla等［6］的方法計(jì)算心肌病理組織學(xué)積分。結(jié)果見(jiàn)圖1、表3。

研究發(fā)現(xiàn)正常（C）組大鼠心肌細(xì)胞形態(tài)正常，細(xì)胞橫紋清晰，胞漿嗜酸性染色，胞核完整，肌原纖維排列整齊，纖維互聯(lián)呈網(wǎng)狀，間質(zhì)細(xì)胞正常，無(wú)病理改變。

隨運(yùn)動(dòng)周期的增加，從第2周末開(kāi)始，E組大鼠心肌開(kāi)始呈現(xiàn)變形性壞死，肌原纖維扭曲，并呈現(xiàn)波浪狀樣改變。大鼠心肌炎癥程度和病理?yè)p傷程度隨運(yùn)動(dòng)負(fù)荷遞增不斷加深，6周末E組大鼠心肌細(xì)胞炎性浸潤(rùn)表現(xiàn)最為明顯，心肌組織可見(jiàn)大量浸潤(rùn)炎癥細(xì)胞，肌原纖維腫脹、扭曲變樣，并有散在性的局灶性壞死區(qū)，部分融合成片（黑色箭頭所示）。

而LE組大鼠心肌相較同時(shí)期的E組大鼠心肌細(xì)胞炎性表達(dá)相對(duì)較輕，但至6周末，心肌細(xì)胞內(nèi)仍然存在條索狀的細(xì)胞核聚集現(xiàn)象。HE組大鼠心肌細(xì)胞炎性細(xì)胞浸潤(rùn)現(xiàn)象與同期E組比，有輕微改善，但仍可見(jiàn)大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，心肌纖維斷裂，壞死病變廣泛。低、高強(qiáng)度的激光治療都可在一定程度上改善同時(shí)期大鼠心肌細(xì)胞損傷病變，但尚不能完全逆轉(zhuǎn)由遞增跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)所致的炎性浸潤(rùn)現(xiàn)象（見(jiàn)圖1）。

其病理程度評(píng)分見(jiàn)表3，運(yùn)動(dòng)組（E）心肌炎癥表達(dá)在2周末時(shí)較輕，但4周末時(shí)心肌的炎癥因子表達(dá)面積已超過(guò)25%，評(píng)分大于1，到了6周末心肌炎癥病變面積增加到50%左右，病理積分達(dá)2.93±0.56（P＜0.01），說(shuō)明隨運(yùn)動(dòng)負(fù)荷和訓(xùn)練期限的增加，心肌炎性變化不斷累積。但是LE和HE組的心肌病變程度比同一階段（4周、6周）的E組輕（P＜0.01），且LE組心肌病理積分明顯低于HE組（P＜0.01）。

圖1　大鼠心肌組織病理切片（HE染色40×10）

表3　大鼠心肌病理積分（±s）

表3　大鼠心肌病理積分（±s）

時(shí)間點(diǎn) 　E組 　LE組 　HE組2周末 　0.52±0.22 　0.43±0.18 　0.48±0.13 4周末 　1.17±0.231）　1.01±0.271）　1.14±0.271）6周末 　2.93±0.562）3）　2.01±0.262）3）4）　2.45±0.412）3）5）6）

1）2周與4周比較，P＜0.01；2）4周與6周比較，P＜0.01；3）2周與6周比較，P＜0.01；4）E組與LE組比較，P＜0.01；5）LE與HE組比較，P＜0.01；6）E組與HE組比較， P＜0.01

3）細(xì)胞因子TNF-α。

從兩者的變化趨勢(shì)上看，隨著運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度和訓(xùn)練期限的增加，E組的TNF-α表達(dá)量在4周末時(shí)上升至最高（P＜0.01），卻在6周末時(shí)稍微回落。不同時(shí)間段（2、4、6周）LE組的TNF-α表達(dá)量均低于E和HE組。但LE和HE組，隨著運(yùn)動(dòng)時(shí)間的延長(zhǎng)，TNF-α的表達(dá)量在4周末時(shí)升至最高（P＜0.01），6周末時(shí)稍微降低，但仍與2周末時(shí)存在非常顯著性差異（P＜0.01）（見(jiàn)表4）。

表4　大鼠TNF-α的變化（±s）

表4　大鼠TNF-α的變化（±s）

1）2周與4周組比較， P＜0.05；2）2周與4周比較，P＜0.01；3）2周與6周組比較，P＜0.05，4）2周與6周比較，P＜0.01

時(shí)間點(diǎn) 　E組 　LE組 　HE組2周末 　9.23±7.72 　5.61±3.70 　7.39±3.20 4周末 18.12±5.062）15.32±2.002）15.99±4.431）6周末 15.06±3.303）14.54±1.994）　14.75±4.963）

4）心肌CD8+T細(xì)胞。

從圖2看出，E組大鼠心肌組織中可見(jiàn)棕黃色的CD8+T淋巴細(xì)胞，且多分布于變性壞死的心肌細(xì)胞周圍，6周末E組心肌組織中仍可見(jiàn)大量顏色較深的黃色顆粒呈團(tuán)簇狀分布（（22.81±5.07）%，P＜0.01），提示CD8+T細(xì)胞浸潤(rùn)明顯增多，心臟損傷嚴(yán)重。

LE組大鼠心肌組織中CD8+T淋巴細(xì)胞陽(yáng)性表達(dá)量從2周末開(kāi)始逐漸增加，但較同時(shí)期的E組（2、4、6周）而言，陽(yáng)性表達(dá)量明顯較低（P＜0.01）。而相對(duì)于HE組，同周期的CD8+T淋巴細(xì)胞的陽(yáng)性表達(dá)量基本與LE組持平，卻又低于E組（P＜0.01），說(shuō)明兩種強(qiáng)度的激光治療都可減緩心肌組織炎性表達(dá)（見(jiàn)表5）。

圖2　大鼠心肌CD8+T淋巴細(xì)胞免疫組化染色（40×10）

表5　大鼠CD8+ T淋巴細(xì)胞百分率（±s） %

表5　大鼠CD8+ T淋巴細(xì)胞百分率（±s） %

時(shí)間點(diǎn) 　E組 　LE組 　HE組2周末 5.43±1.08 　2.61±0.604）　3.15±0.47 4周末 13.03±2.031）　4.15±0.694）　6.55±1.401）5）7）6周末 22.81±5.072）3）　10.75±1.872）3）4）　15.32±2.012）3）4）6）7）

1）2周與4周組比較， P＜0.01；2）4周與6周組比較， P＜0.01；3）2周與6周組比較， P＜0.01；4）E組與LE組比較， P＜0.01；5）LE組與HE組比較，P＜0.05，6）LE組與HE組比較，P＜0.01；7）E組與HE組比較，P＜0.01

5）心肌細(xì)胞凋亡率。

運(yùn)用TUNEL法進(jìn)行原位末端標(biāo)記與光鏡下觀察，同時(shí)參照Nsrula計(jì)算公式，計(jì)算出陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)量（見(jiàn)表6）。結(jié)果顯示隨運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度和期限增加，E組大鼠的心肌細(xì)胞凋亡率逐漸增加，尤其是到了6周末，表現(xiàn)最為嚴(yán)重（（52.12±7.14）%，P＜0.01），細(xì)胞排列雜亂無(wú)序，胞核破裂溢出，凋亡細(xì)胞出現(xiàn)明顯的核濃縮及破裂現(xiàn)象，呈現(xiàn)陽(yáng)性深褐色著染。

LE組心肌細(xì)胞凋亡率相與同期的E組（4、6周末）比較，相對(duì)較?。≒＜0.01），但隨運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度增加心肌凋亡率亦增大，表現(xiàn)為心肌細(xì)胞排列相對(duì)松散，單陽(yáng)性細(xì)胞著色相對(duì)于運(yùn)動(dòng)組較淺。HE組大鼠心肌細(xì)胞凋亡率隨運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度增加而逐漸增加，相對(duì)于E組輕，但高于LE組（6周末時(shí)，P＜0.01），提示兩種強(qiáng)度激光照射均可抑制心肌細(xì)胞凋亡，但HE組抑制心肌細(xì)胞凋亡的效果次于LE組。

表6　大鼠心肌細(xì)胞凋亡率（±s） %

表6　大鼠心肌細(xì)胞凋亡率（±s） %

1）2周與4周組比較，P＜0.01；2）4周與6周組比較，P＜0.01；3）2周與6周組比較，P＜0.01；4）E組與LE比較， P＜0.01；5）LE與HE組比較， P＜0.01

時(shí)間點(diǎn) 　E組 　LE組 　HE組2周末 　21.14±5.03 　15.72±4.27 　17.15±3.33 4周末 　42.04±6.221）　29.28±5.461）4）　38.12±7.281）6周末 　52.12±7.142）3）43.54±6.702）3）4）　48.65±7.312）3）5）

3 討論

研究指出，過(guò)度運(yùn)動(dòng)負(fù)荷或過(guò)度訓(xùn)練可使心肌細(xì)胞排列紊亂，甚至部分?jǐn)嗔?，?dǎo)致收縮力下降［7］。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)也表明，不同強(qiáng)度耐力訓(xùn)練的大鼠心肌細(xì)胞表現(xiàn)出不同程度的凋亡現(xiàn)象，尤其是持續(xù)的大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練可使心肌細(xì)胞產(chǎn)生不可逆的病理性改變［8］。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，隨著運(yùn)動(dòng)負(fù)荷的逐漸增加和訓(xùn)練期限的延長(zhǎng)，大鼠心肌纖維斷裂、腫脹，炎性因子TNF-α表達(dá)，及心肌細(xì)胞凋亡也逐漸增多，說(shuō)明長(zhǎng)期大負(fù)荷遞增運(yùn)動(dòng)可導(dǎo)致心肌炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，誘發(fā)炎癥性損傷。炎癥細(xì)胞可釋放各種細(xì)胞因子，通過(guò)不同的促炎及抗炎途徑調(diào)節(jié)心肌組織對(duì)各種應(yīng)激因素的應(yīng)答反應(yīng)。本研究觀察了CD8+T淋巴細(xì)胞以及細(xì)胞因子TNF-α在長(zhǎng)期遞增負(fù)荷運(yùn)動(dòng)誘導(dǎo)的心肌損傷中的作用，分析運(yùn)動(dòng)性心肌損傷的免疫調(diào)節(jié)機(jī)制。

TNF-α是細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵成分，過(guò)量的TNF-α可介導(dǎo)免疫損傷及一些嚴(yán)重的病理生理過(guò)程。TNF-α主要由心肌單核-巨噬細(xì)胞及心肌細(xì)胞產(chǎn)生，心臟既是TNF-α的產(chǎn)生場(chǎng)所，同時(shí)也是其作用的靶器官，可參與多種心臟疾病的發(fā)生發(fā)展過(guò)程，且心肌產(chǎn)生的TNF-α足以造成嚴(yán)重的心肌疾?。?］。本研究發(fā)現(xiàn)6周遞增負(fù)荷運(yùn)動(dòng)過(guò)程中，TNF-α表達(dá)呈增加趨勢(shì)，4周時(shí)達(dá)最高。結(jié)合同時(shí)期的心肌病理學(xué)變化，提示TNF-α參與了遞增負(fù)荷運(yùn)動(dòng)過(guò)程中心肌的炎癥反應(yīng)，在其發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。6周遞增負(fù)荷運(yùn)動(dòng)，由于運(yùn)動(dòng)負(fù)荷的不斷增加導(dǎo)致大鼠心肌組織內(nèi)炎癥累積，進(jìn)而產(chǎn)生相應(yīng)的病理性改變。TNF-α作為一種炎癥前細(xì)胞因子，其升高可激活淋巴細(xì)胞增殖分裂，活化巨噬細(xì)胞、趨化各種炎性細(xì)胞，如調(diào)節(jié)IL-1 和IL-6等的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)中性粒細(xì)胞在心肌內(nèi)的黏附、聚集，并釋放可溶性介質(zhì)，導(dǎo)致心肌微血管的阻塞和心肌損傷不斷加重［10-11］。綜上所述，組織內(nèi)免疫細(xì)胞因子TNF-α的升高，不僅抑制心肌細(xì)胞正常的生理功能，還可導(dǎo)致心肌細(xì)胞出現(xiàn)自身?yè)p害加重、心臟重構(gòu)等病理性變化。

本研究采取激光照射作為大強(qiáng)度遞增負(fù)荷運(yùn)動(dòng)心肌炎性損傷的干預(yù)手段，選取鼻翼兩側(cè)激光照射的處理方式，因鼻腔內(nèi)血管相對(duì)豐富，鼻黏膜下層有多支血管構(gòu)成網(wǎng)狀血管層，且鼻黏膜和鼻腔內(nèi)的小血管壁都較薄弱，因此激光較易穿透組織而作用于血細(xì)胞，以達(dá)到治療的目的。既往研究均證實(shí)低強(qiáng)度激光（Low-level laser therapy，LLLT）在調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)、減緩疼痛、抑制深層組織損傷等方面都具有良好療效［12］，且運(yùn)動(dòng)后激光照射可以減輕運(yùn)動(dòng)所致的肌肉損傷及炎癥反應(yīng)［13］。結(jié)合本研究發(fā)現(xiàn)，激光照射組（LE和HE）大鼠血清中TNF-α相較同時(shí)期的E組減少，而此時(shí)心肌內(nèi)的炎癥細(xì)胞表達(dá)亦減少，心肌病理積分相對(duì)E組降低，說(shuō)明心肌組織由壞死后炎癥反應(yīng)逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)樾募〗M織的修復(fù)，提示激光治療可在心肌損傷的緩解、修復(fù)和改善中發(fā)揮重要作用。本研究也與大部分臨床心血管疾病研究結(jié)果一致，證明低強(qiáng)度激光治療可減輕機(jī)體的炎癥反應(yīng)，減少炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)及炎癥因子的表達(dá)量，達(dá)到保護(hù)心肌的目的［14］，其機(jī)制可能是激光束發(fā)射的近紅外光子可增加ROS表達(dá)和NO釋放量，激活轉(zhuǎn)錄因子如NF-κB信號(hào)通路，促進(jìn)細(xì)胞存活、增殖和遷移［15-16］；相反高強(qiáng)度激光卻具有一定的抑制效應(yīng)［17］。

Nishimura［18］研究發(fā)現(xiàn)，CD8+T細(xì)胞在組織炎癥發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起重要作用，可通過(guò)分泌趨化因子，激活巨噬細(xì)胞引起炎癥，誘導(dǎo)MHC-I類分子表達(dá)，這可能是心肌成纖維細(xì)胞表型發(fā)生轉(zhuǎn)變的始動(dòng)環(huán)節(jié)，激活免疫應(yīng)激反應(yīng)，最終誘導(dǎo)心肌朝著纖維化的方向發(fā)展。本研究發(fā)現(xiàn)CD8+T淋巴細(xì)胞在正常大鼠心肌組織內(nèi)不表達(dá)或低表達(dá)狀態(tài)［19］，但隨運(yùn)動(dòng)負(fù)荷遞增，CD8+T淋巴細(xì)胞在心肌組織中表達(dá)量明顯升高。Khan［20］指出心肌炎癥的發(fā)展進(jìn)程及嚴(yán)重程度均取決于T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫反應(yīng)，TH細(xì)胞在炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要調(diào)控作用，即CD8+T細(xì)胞在心肌炎時(shí)浸潤(rùn)增加，參與心肌細(xì)胞損傷過(guò)程并作用于心肌炎的發(fā)展。同時(shí)CD8+T淋巴細(xì)胞可通過(guò)TNF-α的過(guò)度表達(dá)，誘導(dǎo)膠原含量增加，干預(yù)心肌纖維化進(jìn)程，同時(shí)TNF-α也是細(xì)胞凋亡家族的重要成員［21］。結(jié)合本研究CD8+T淋巴細(xì)胞在各組的變化趨勢(shì)（見(jiàn)表6），我們認(rèn)為遞增負(fù)荷運(yùn)動(dòng)可刺激CD8+T淋巴細(xì)胞促進(jìn)心肌的巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)和活化，增強(qiáng)促炎性因子和趨炎性因子（如TNF-α）的表達(dá)，進(jìn)而加重心肌的炎癥進(jìn)程。與之相關(guān)的研究表明，6周遞增負(fù)荷運(yùn)動(dòng)，運(yùn)動(dòng)組大鼠胸腺的CD8+T淋巴細(xì)胞在2、4、6周中均明顯高于對(duì)照組［22］，推測(cè)可能是運(yùn)動(dòng)后抑制性T細(xì)胞被激活，以控制抗原暴露所致的自身免疫損傷；但抑制性T細(xì)胞過(guò)度激活卻又影響其他亞型T細(xì)胞功能，導(dǎo)致訓(xùn)練后免疫抑制；而過(guò)度訓(xùn)練也使抑制性巨噬細(xì)胞增多，提高抑制性T細(xì)胞功能，進(jìn)一步加劇訓(xùn)練后的免疫抑制［23］。結(jié)合本研究結(jié)果，推測(cè)遞增負(fù)荷運(yùn)動(dòng)致使心肌承受的應(yīng)力負(fù)荷增加，心肌內(nèi)炎癥反應(yīng)累積，在此基礎(chǔ)上激活了CD8+T淋巴細(xì)胞的效應(yīng)，炎性因子TNF-α的表達(dá)增加，心肌病理?yè)p傷加重。但低強(qiáng)度激光卻通過(guò)下調(diào)CD8+T淋巴細(xì)胞及TNF-α的炎性表達(dá)，延緩心肌內(nèi)的炎癥發(fā)展進(jìn)程，以達(dá)到改善心肌的目的。

作為生命過(guò)程的一種生理現(xiàn)象，細(xì)胞凋亡和增殖都是生命的正?，F(xiàn)象，以維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)。Phaneuf等［24］研究認(rèn)為運(yùn)動(dòng)導(dǎo)致細(xì)胞凋亡屬于正常的機(jī)體調(diào)節(jié)過(guò)程，通過(guò)排斥部分無(wú)不良反應(yīng)的破壞細(xì)胞，以保證組織處在最佳的機(jī)能狀態(tài)。而研究運(yùn)動(dòng)對(duì)心肌和骨骼肌細(xì)胞凋亡的關(guān)系時(shí)發(fā)現(xiàn)，不管是短時(shí)間還是長(zhǎng)時(shí)間的運(yùn)動(dòng)都會(huì)導(dǎo)致肌細(xì)胞損傷［25］。如常蕓［8］、張鈞［26］和金其貫［27］等，研究不同強(qiáng)度耐力訓(xùn)練、力竭運(yùn)動(dòng)或超負(fù)荷運(yùn)動(dòng)后大鼠心肌細(xì)胞凋亡情況，發(fā)現(xiàn)過(guò)度訓(xùn)練可導(dǎo)致大鼠心肌細(xì)胞凋亡增加，提示心肌細(xì)胞凋亡參與由超負(fù)荷運(yùn)動(dòng)所致的心臟病理性失代償?shù)霓D(zhuǎn)變過(guò)程，導(dǎo)致運(yùn)動(dòng)性心臟損傷。本研究結(jié)果顯示，6周遞增負(fù)荷運(yùn)動(dòng)過(guò)程中，隨運(yùn)動(dòng)負(fù)荷強(qiáng)度遞增，大鼠心肌細(xì)胞凋亡發(fā)生率逐漸增加，而激光組心肌細(xì)胞凋亡明顯少于同時(shí)期運(yùn)動(dòng)組，提示低強(qiáng)度激光可作為對(duì)抗心肌細(xì)胞凋亡的重要調(diào)控方式。DE等［28］研究指出，激光在對(duì)抗炎癥反應(yīng)過(guò)程中表現(xiàn)為雙刃劍的劑量依賴性關(guān)系，這就意味著中等強(qiáng)度激光在“治療窗”會(huì)激發(fā)照射部位產(chǎn)生生物學(xué)反應(yīng)；而超出此范圍則不能產(chǎn)生任何效應(yīng)。本研究中，LE組心肌細(xì)胞凋亡率明顯低于HE組也恰與此結(jié)論一致。

低強(qiáng)度激光具有安全、有效、易操作和可實(shí)施性強(qiáng)等特點(diǎn)。本研究在運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)領(lǐng)域及其他臨床醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的研究均證實(shí)，低強(qiáng)度激光可作為抵抗心血管疾病的抗炎癥損傷、減輕疼痛、促進(jìn)細(xì)胞增殖的有效手段。

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Effects of laser of different intensities on the myocardial inflammatory injury and CD8+T lymphocyte expression of rats exercising with an incremental load

MA Xiao-ge，WANG Song-tao，QIN Fei，GONG Wen-wu
（School of Physical Education，South China Normal University，Guangzhou 510006，China）

Abstract:In order to observe the changing of and relationship between the myocardial inflammatory injury and CD8+T lymphocyte expression of rats exercising with an incremental load, and to probe into the function of laser therapy of different intensities on protecting a heat undergoing a high intensity exercise, the authors divided 8-week old male SD rats randomly into a control group （C） consisting of 54 rats, and an experiment group consisting of 54 rats, including a low intensity laser + exercise group （LE）, a high intensity laser + exercise group （HE）, and an exercise group （E）, each of which consisted of 18 rats, sampled the rats in the groups in weeks 2, 4 and 6 respectively, evaluated their heart coefficients, overall heart shapes, myocardial pathological scores, apoptosis of myocardial CD8+T lymphocytes and cardiocytes, and revealed the following findings: as compared with the rats in group C, the rats in group E in week 6 showed significant cardiocytes inflammatory infiltrating, myocardial fibers twisting, swelling and rupturing, a significantly different pathological score （P＜0.01）, increased serum TNF-α, myocardial CD8+T lymphocytes filtrating, and a very significantly increased cardiocyte apoptosis index; as compared with the rats in group E in the same period （week 2, 4 or 6）, the rats in group LE had slightly lighter myocardial inflammation; in week 6, the numbers of apoptosis of CD8+T lymphocytes and cardiocytes increased as compared with those of the rats in group C, yet decreased significantly as compared with those of the rats in group E （P＜0.01）. The saidbook=138,ebook=143findings indicate that laser therapy can, to a certain extent, alleviate myocardial inflammatory infiltration and inflammatory factors, reduce the degree of myocardial pathology, and restrain the process of apoptosis of cardiocytes.

Key words:sports medicine；myocardial inflammatory injury；exercising with an incremental load；low intensity laser；CD8+T lymphocyte；rats

作者簡(jiǎn)介：麻曉鴿（1984-），女，博士研究生，研究方向：運(yùn)動(dòng)與心血管健康。E-mail：mxg84@163.com 通訊作者：王松濤教授。

基金項(xiàng)目：廣東省體育局2014年科研項(xiàng)目（GDSS2014181）；華南師范大學(xué)2014年研究生創(chuàng)新基金（2014bsxm03）。

收稿日期：2015-08-20

中圖分類號(hào)：G804.5

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1006-7116（2016）03-0137-08