王俊雄　蔡習(xí)強(qiáng)　聶勇戰(zhàn)　郝建宇　樊代明*

(1. 第四軍醫(yī)大學(xué)西京消化病醫(yī)院， 西安 710032；2.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京友誼醫(yī)院醫(yī)療保健中心， 北京100050；3. 首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京朝陽(yáng)醫(yī)院消化內(nèi)科，北京 100431；4.國(guó)家消化系統(tǒng)疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心，北京 100050；5.首都醫(yī)科大學(xué)消化病學(xué)系，北京 100050)

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血清饑餓激活表皮生長(zhǎng)因子受體誘導(dǎo)胃癌耐藥

王俊雄1，2，3，4，5蔡習(xí)強(qiáng)1聶勇戰(zhàn)1郝建宇3，4，5*樊代明1*

(1. 第四軍醫(yī)大學(xué)西京消化病醫(yī)院， 西安 710032；2.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京友誼醫(yī)院醫(yī)療保健中心， 北京100050；3. 首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京朝陽(yáng)醫(yī)院消化內(nèi)科，北京 100431；4.國(guó)家消化系統(tǒng)疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心，北京 100050；5.首都醫(yī)科大學(xué)消化病學(xué)系，北京 100050)

【摘要】目的探討血清饑餓對(duì)表皮生長(zhǎng)因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)高表達(dá)胃癌細(xì)胞化學(xué)藥物治療(以下簡(jiǎn)稱化療)敏感性的影響及其作用機(jī)制。方法將胃癌細(xì)胞分為4組：正常對(duì)照組、饑餓組、化療藥處理組、饑餓+化療藥處理組。采用噻唑藍(lán)[3-(4，5-dimethyl-2-thiazolyl)-2，5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide，MTT]方法觀察腫瘤細(xì)胞的存活率，兩兩比較驗(yàn)證血清饑餓對(duì)化療藥敏感性的影響。采用Western blotting法觀察細(xì)胞EGFR及其下游靶分子細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases， ERK)，蛋白激酶B(RAC-alpha serine/threonine-protein kinase， Akt)的磷酸化水平變化；最后進(jìn)一步借助EGFR單克隆抗體西妥昔單抗抑制EGFR的磷酸化的活性，觀察其對(duì)胃癌細(xì)胞化療感性的影響。結(jié)果與對(duì)照組相比，胃癌細(xì)胞SGC7901血清饑餓時(shí)對(duì)多種化療藥物的敏感性下降，血清饑餓可促進(jìn)EGFR、ERK磷酸化，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。EGFR單克隆抗體可部分逆轉(zhuǎn)血清饑餓所導(dǎo)致的化療藥耐藥。 結(jié)論缺營(yíng)養(yǎng)饑餓可誘導(dǎo)EGFR高表達(dá)胃癌細(xì)胞化療耐藥，其誘導(dǎo)機(jī)制可能與激活EGFR/ERK信號(hào)通路有關(guān)。

【關(guān)鍵詞】胃癌；血清饑餓；表皮生長(zhǎng)因子受體；耐藥

大多數(shù)晚期腫瘤應(yīng)用最廣泛的治療策略是化學(xué)藥物治療(以下簡(jiǎn)稱化療)，但是并隨著藥物的使用出現(xiàn)腫瘤耐藥，導(dǎo)致僅有部分的腫瘤化療有效[1]。傳統(tǒng)研究[2]認(rèn)為進(jìn)行化療的腫瘤患者應(yīng)該高營(yíng)養(yǎng)飲食來(lái)抵抗化療帶來(lái)的不良反應(yīng)，近年研究[3]表明短期饑餓可以影響多種腫瘤對(duì)化療藥物的敏感性，不同種類的腫瘤化療藥物的敏感性的影響不盡相同。這樣針對(duì)不同腫瘤患者為其制定個(gè)體化的營(yíng)養(yǎng)方案就可以擴(kuò)大特定化療藥物對(duì)腫瘤的有效性，具有實(shí)際的臨床意義。胃癌是我國(guó)死亡人數(shù)最多的惡性腫瘤之一，因此進(jìn)一步深入研究血清饑餓對(duì)胃癌化療藥敏感性的作用，為胃癌患者臨床營(yíng)養(yǎng)支持治療提供新思路等具有重要意義。

1材料和方法

1.1 材料

人胃癌SGC7901、BGC823、MKN45細(xì)胞系(購(gòu)自中國(guó)軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院)，胎牛血清(美國(guó)Gibco公司)；RPMI-1640 培養(yǎng)基(美國(guó)Gibco公司)；MTT(美國(guó)Sigma公司)；表皮生長(zhǎng)因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)、phospho-EGFR、(extracellular regulated protein kinases， ERK)、phospho-ERK、Akt、phospho-Akt抗體(美國(guó)Cell Signaling公司)；辣根酶過(guò)氧化物標(biāo)記的二抗(美國(guó)Santa Cruz 公司)；西妥昔單抗(美國(guó)Merk公司)。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)及藥物處理

人胃癌SGC7901、BGC823、MKN45細(xì)胞系培養(yǎng)環(huán)境相似，為37 ℃、5% (體積分?jǐn)?shù))CO2的孵箱。培養(yǎng)液為含10%(體積分?jǐn)?shù))胎牛血清的RPMI1640，西妥昔單抗?jié)舛葹?00 μg/ mL。

1.2.2MTT法檢測(cè)細(xì)胞體外藥物敏感性

取5×103個(gè)細(xì)胞，均勻種植于Corning公司的96孔板中，分正常對(duì)照組、饑餓組、化療藥處理組、饑餓+化療藥處理組，24 h后將表柔比星(epirubicin，EPI)(0.5 μg/mL)和順鉑(cis-diaminedichloroplatinum，CDDP)(0.8 μg/mL)，五氟尿嘧啶[5-fluoro-2，4(1H，3H)pyrimidinedione，5-FU](0.8 μg/mL)等藥物或空白對(duì)照加入細(xì)胞中，每個(gè)濃度設(shè)置5個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)48 h后，向96孔板的每個(gè)孔小心加入5 mg/mL的預(yù)制MTT溶液20 μL，繼續(xù)孵育4 h。小心吸出96孔板孔內(nèi)液體，加入150 μL二甲基亞砜，振蕩器上震搖10 min，使用酶標(biāo)儀在490 nm波長(zhǎng)處讀出各孔的吸光度值。根據(jù)所得結(jié)果，以對(duì)照組的吸光度值為參照，計(jì)算與對(duì)照組的比值并繪制藥物濃度抑制曲線。

1.2.3Western blotting 法分析蛋白表達(dá)

不同條件處理胃癌細(xì)胞后，棄去培養(yǎng)液，PBS洗2次，把PBS 液吸取干凈后，加入蛋白酶抑制劑、磷酸酶抑制劑和細(xì)胞裂解液，冰上孵育15 min，用細(xì)胞刮將細(xì)胞刮下收集到1.5 mL的EP管中，4 ℃，12 000r/min離心10 min，吸取上清至另一EP管。檢測(cè)蛋白濃度，100 ℃煮沸10 min，冷凍保存?zhèn)溆?。各組樣品采取總蛋白30 μg，經(jīng)電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉，一抗過(guò)夜，次日加入辣根酶過(guò)氧化物標(biāo)記的二抗，室溫孵育1 h，加入發(fā)光底物，用Bio-Rad成像系統(tǒng)對(duì)化學(xué)發(fā)光信號(hào)進(jìn)行圖像采集，采用Quantity One 軟件比較樣本目的蛋白表達(dá)水平高低。

1.2.4熒光共聚焦顯微鏡檢測(cè)phospho-EGFR

取處于生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期的胃癌細(xì)胞SGC7901，于熒光小室中鋪細(xì)胞，分別正常培養(yǎng)和血清饑餓24 h，細(xì)胞孔中分別加入PBS洗3次，每次5 min；加入4%(體積分?jǐn)?shù))多聚甲醛在室溫下固定30 min，吸出多聚甲醛，PBS緩沖液漂洗；1 mL 0.1%(體積分?jǐn)?shù)) Triton 室溫下處理5 min；3%(體積分?jǐn)?shù))胎牛血清封閉液封閉35 min，接著PBS漂洗1次；加入一抗，37 ℃孵育1 h；加入二抗，37 ℃避光孵育2 h；加入DAPI，室溫下反應(yīng)10 min； 熒光共聚焦顯微鏡下觀察，拍照。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2結(jié)果

2.1永生化的胃正常細(xì)胞和胃癌細(xì)胞系中EGFR的表達(dá)情況

在永生化的胃正常細(xì)胞GES中EGFR相對(duì)低表達(dá)，而在胃癌細(xì)胞系A(chǔ)GS、MKN45、SGC7901中為相對(duì)高表達(dá)(圖1)。為了驗(yàn)證胃癌細(xì)胞系在缺營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)在對(duì)化療藥物敏感性，本研究選擇MKN45、SGC7901進(jìn)行下一步試驗(yàn)。

2.2血清饑餓導(dǎo)致胃癌細(xì)胞對(duì)化療藥物敏感性下降

在0.5%(體積分?jǐn)?shù))血清濃度下，胃癌腫瘤細(xì)胞可維持基本生長(zhǎng)，但生長(zhǎng)相對(duì)緩慢，所以設(shè)置血清濃度0.5%(體積分?jǐn)?shù))為血清饑餓條件。采用MTT法檢測(cè)血清饑餓時(shí)EGFR高表達(dá)的胃癌細(xì)胞MKN45和SGC7901對(duì)化療藥物的敏感性下降(圖2)實(shí)驗(yàn)分組分別為：Ctrl組(對(duì)照組)、血清饑餓組、化療藥組、血清饑餓+化療藥組。預(yù)先鋪于96孔板中的MKN45細(xì)胞和SGC7901細(xì)胞中，每組設(shè)5重復(fù)，48 h后按MTT法處理，觀察腫瘤細(xì)胞的存活率，提示血清饑餓時(shí)胃癌細(xì)胞在相同濃度的化療藥物(5-FU、CDDP、EPI)作用下，細(xì)胞存活率較對(duì)照組升高，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

圖1　EGFR在胃正常細(xì)胞及腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)

圖2　不同條件下胃癌細(xì)胞存活率

A：serum starvation reduces the role of 5-FU in MKN45 cells；B：serum starvation reduces the role of CDDP in MKN45 cells；C： serum starvation reduces the role of EPI in MKN45 cells；D:cetuximab could partially reverse 5-FU resistance induced by serum starvation. E：cetuximab could partially reverse CDDP resistance induced by serum starvation. F: cetuximab could partially reverse EPI resistance induced by serum starvation.*P<0. 05； Ctrl: control；S: serum starvation；C: cetuximab；S/C: serum starvation +Cetuximab；EPI：epirubicin； CDDP：cis-diaminedichloroplatinum; 5-FU：5-fluoro-2，4(1H，3H)pyrimidinedione.

2.3血清饑餓激活EGFR/ERK通路

胃癌細(xì)胞SGC7901隨著血清饑餓時(shí)間延長(zhǎng)，對(duì)EGFR/ERK通路的活化作用越強(qiáng)。在血清饑餓12 h EGFR的磷酸化水平明顯升高，同時(shí)下游的ERK分子磷酸化也隨之升高，但Akt的磷酸化水平明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖3)。同時(shí)進(jìn)行免疫熒光顯示，血清饑餓時(shí)EGFR的磷酸化水平明顯升高(圖4)。

圖3　血清饑餓激活EGFR/ERK通路

Expression of EGFR， p-EGFR， p-Akt， p-ERK protein of SGC7901 cells treated with serum starvation time-dependently analyzed by Western blotting，n=6.**P<0. 01vsgroup of 0 h；EGFR:epidermal growth factor receptor；ERK:extracellular regulated protein kinases.

圖4　免疫熒光檢測(cè)血清饑餓時(shí)EGFR的激活

2.4EGFR單克隆抗體可部分逆轉(zhuǎn)血清饑餓所致的胃癌細(xì)胞化療耐藥

在胃癌細(xì)胞SGC7901中，血清饑餓能促進(jìn)EGFR磷酸化，應(yīng)用西妥昔單抗能部分抑制EGFR的激活(圖5)。同時(shí)MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示西妥昔單抗使得化療藥的敏感性有所恢復(fù)。實(shí)驗(yàn)分組分別為：對(duì)照組，血清饑餓組，西妥昔單抗，血清饑餓+西妥昔單抗組。相同濃度的化療藥物，血清饑餓組的胃癌細(xì)胞存活率高于對(duì)照組，而血清饑餓同時(shí)聯(lián)用西妥昔單抗，能使得化療藥敏感性得到部分恢復(fù)(圖2D、E、F)。

2.5血清饑餓能拮抗化療藥物對(duì)EGFR/ERK通路的抑制

為了進(jìn)一步明確EGFR/ERK信號(hào)通路是否參與了血清饑餓誘導(dǎo)的化療耐藥的過(guò)程，本研究實(shí)驗(yàn)分組分別為：對(duì)照組，血清饑餓組，化療藥組，血清饑餓+化療藥組。Western blotting提示單純應(yīng)用化療藥物(EPI，5FU)可以顯著抑制EGFR和其下游的ERK的磷酸化，并顯著減少(P<0.05，圖6)。血清饑餓同時(shí)加用化療藥物時(shí)可部分恢復(fù)EGFR下游的ERK的磷酸化水平。

3討論

腫瘤化療藥耐藥目前成為腫瘤治療的最大難題之一。近年來(lái)大量研究[4-6]顯示EGFR異常活化與腫瘤的發(fā)生發(fā)展、增生與轉(zhuǎn)移、放化療敏感性、腫瘤耐藥性和不良預(yù)后顯著相關(guān)[4]。Yoon等[5]發(fā)現(xiàn)膽管上皮

圖5　西妥昔單抗抑制血清饑餓誘導(dǎo)的EGFR磷酸化

Expression of EGFR and p-EGFR protein in SGC7901cells treated with serum starvation and Cetuximab analyzed by Western blotting: β-actin was used as a loading control，n=6.**P<0. 01vscontrol；EGFR:epidermal growth factor receptor.

圖6　血清饑餓能拮抗化療藥物對(duì)EGFR/Erk通路的抑制

n=6.**P<0. 01vscontrol， Ctrl: control；S: serum starvation；D: drug；S/D: serum starvation + drug；EGFR:epidermal growth factor receptor；ERK:extracellular regulated protein kinases； EPI：epirubicin； CDDP: cis-diaminedichloroplatinum； 5-FU5-fluoro-2，4(1H，3H)pyrimidinedione.

細(xì)胞癌敏感細(xì)胞株中EGFR活性低于耐藥細(xì)胞株。另一研究[6]發(fā)現(xiàn)肝癌多藥耐藥與表皮因子激活一系列的酪氨酸激酶有關(guān)，而且EGFR抑制劑能恢復(fù)耐藥肝癌細(xì)胞的化療藥物敏感性。還有研究[7]報(bào)道在多藥耐藥的乳腺癌中EGFR通過(guò)調(diào)控細(xì)胞周期從而降低化療藥物敏感性。

近期的研究[2]表明在黑素瘤、膠質(zhì)瘤、乳腺癌細(xì)胞中，周期性饑餓可以有效地延緩腫瘤進(jìn)展并提高化療藥物的有效性。但是另有研究[3]發(fā)現(xiàn)缺營(yíng)養(yǎng)情況下肝癌細(xì)胞自噬增加，聯(lián)用自噬抑制劑后對(duì)肝癌細(xì)胞化療藥物的敏感性降低。研究[4]表明自噬不但是肝癌細(xì)胞在缺營(yíng)養(yǎng)情況下的生存機(jī)制之一，同時(shí)也有助于肝癌細(xì)胞抵抗化療的作用。本課題組研究發(fā)現(xiàn)高表達(dá)EGFR胃癌細(xì)胞血清饑餓后，與對(duì)照組相比，腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物敏感性顯著下降。同時(shí)發(fā)現(xiàn)隨著饑餓時(shí)間的延長(zhǎng)EGFR的磷酸化程度逐漸升高，而腫瘤細(xì)胞處于饑餓加EGFR單克隆抗體后化療敏感性有所恢復(fù)。提示EGFR的活化可能參與血清饑餓誘導(dǎo)的胃癌多藥耐藥。

ERK信號(hào)通路是EGFR重要的下游信號(hào)傳導(dǎo)通路，ERK是MAPK家族成員之一，包括ERK1及ERK2。ERK發(fā)揮抑制細(xì)胞凋亡，促進(jìn)細(xì)胞增生的作用[8-10]。在特定的癌癥中，ERK通路的激活情況可以調(diào)節(jié)藥物泵和抗凋亡的分子如Bcl-2的表達(dá)。Bcl-2抗凋亡分子和Mdr-1藥物泵蛋白轉(zhuǎn)錄表達(dá)增加的可能原因是ERK通路下游靶激酶磷酸一些轉(zhuǎn)錄因子，這些轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合Mdr-1和Bcl-2和的啟動(dòng)子區(qū)，刺激目的分子轉(zhuǎn)錄增加[11-13]。Mdr-1和Bcl-2表達(dá)的增加使得腫瘤細(xì)胞耐藥性增強(qiáng)[14-16]。本研究中發(fā)現(xiàn)血清饑餓可以促進(jìn)EGFR磷酸化，同時(shí)隨著血清饑餓時(shí)間的延長(zhǎng)下游的ERK的磷酸化水平也明顯升高。腫瘤細(xì)胞給予化療藥時(shí)，與正常對(duì)照相比ERK的磷酸化水平相對(duì)較低，但血清饑餓的同時(shí)給予化療藥物，ERK磷酸化水平處于相對(duì)高水平。因此，胃癌細(xì)胞正常情況下，EGFR活化處于相對(duì)低的狀態(tài)，而在饑餓狀態(tài)腫瘤細(xì)胞EGFR自身磷酸化，二聚體改變，通過(guò)EGFR/ERK大通路誘發(fā)化療藥耐藥，EGFR單克隆抗體使得化療藥物的敏感性有所恢復(fù)。

腫瘤細(xì)胞經(jīng)常處于饑餓或缺氧狀態(tài)，胃癌細(xì)胞血清饑餓有可能是其化療藥耐藥的原因之一[17-18]。血清饑餓誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞化療耐藥的機(jī)制可能與激活EGFR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路有關(guān)。以上結(jié)果僅是體外實(shí)驗(yàn)，還需要通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)以上結(jié)果。

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編輯慕萌

Serum starvation induces gastric carcinoma chemotherapy resistance through EGFR/ERK pathway

Wang Junxiong1，2，3，4，5，Cai Xiqiang1，Nie Yongzhan1，Hao Jianyu3，4，5*，F(xiàn)an Daiming1*

(1.XijingHospitalofDigestiveDiseases，XijingHospital，theFourthMilitaryMedicalUniversity，Xi’an710032，China；2MedicalandHealthCenter，BeijingFriendshipHospital，CapitalMedicalUniversity，Beijing100050，China; 3.DepartmentofGastroenterology，BeijingChaoyangHospital，CapitalMedicalUniversity，Beijing100043，China；4.NationalClinicalResearchCenterforDigestiveDiseases，Beijing100050，China; 5.FacultyofGastroenterology,CapitalMedicalUniversity，Beijing100050，China)

【Abstract】Objective To demonstrate drug resistance induced by serum starvation in gastric cancer and explore the possible mechanism.MethodsThe viability of SGC7901 cells was measured by MTT assay. The inhibition rates and IC50 values were then calculated. The phosphorylation level of EGFR and ERK induced by serum starvation were measured by Western blotting. ResultsSerum starvation could reduce the action of chemotherapeutic drug. EGFR signal activation acted as a protective factor against starvation by regulating downstream genes. Compared with the control group， the phosphorylation levels of EGFR and ERK were significantly increased in serum starvation treatment group (P<0. 05). EGFR monoclonal antibody could partially reverse multiple drug resistance as a result of serum starvation. ConclusionSerum starvation may induce drug resistance in gastric cancer cell and the mechanism may be related to the activation of EGFR/ERK signaling pathway.

【Key words】gastric cancer； serum starvation； epidermal growth factor receptor(EGFR)； drug resistance

(收稿日期：2015-12-25)

【中圖分類號(hào)】R 656.6

[doi：10.3969/j.issn.1006-7795.2016.01.005]

*Corresponding author， E-mail：daimingfan@fmmu.edu.cn， haojianyu@sina.com

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金(81120108005， 81172096)，國(guó)家消化系統(tǒng)疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心基金(2015BAI13B09)。This study was supported by National Natural Science Foundation of China (81120108005， 81172096), National Clinical Research Center for Digestive Diseases (2015BAI13B09).

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：2016-01-2716∶09網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/11.3662.R.20160127.1609.006.html

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