朱圣韜　孫秀靜　李　鵬　郭慶東　朱圣泉　張澍田*

(1.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京友誼醫(yī)院消化內(nèi)科，北京 100050；2.國家消化系統(tǒng)疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心， 北京 100050； 3.首都醫(yī)科大學(xué)消化病學(xué)系， 北京 100050；4.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京天壇醫(yī)院消化內(nèi)科， 北京 100050)

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PHF8基因?qū)κ彻荀[狀細(xì)胞癌裸鼠移植瘤生長的影響

朱圣韜1，2，3孫秀靜2，3，4李鵬1，2，3郭慶東1，2，3朱圣泉1，2，3張澍田1，2，3*

(1.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京友誼醫(yī)院消化內(nèi)科，北京 100050；2.國家消化系統(tǒng)疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心， 北京 100050； 3.首都醫(yī)科大學(xué)消化病學(xué)系， 北京 100050；4.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京天壇醫(yī)院消化內(nèi)科， 北京 100050)

【摘要】目的利用慢病毒(lentivirus)介導(dǎo)的短發(fā)卡RNA(short hairpin RNA，shRNA)建立人食管鱗狀細(xì)胞癌(esophageal squamous-cell carcinoma，ESCC，以下簡(jiǎn)稱食管鱗癌)裸鼠移植瘤模型，觀察鋅指蛋白8(plant homeodomain finger protein 8，PHF8)對(duì)移植瘤生長的影響。方法分別將未感染慢病毒(空白對(duì)照組)、感染Nonsilencing-shRNA慢病毒(陰性對(duì)照shRNA組)和PHF8 shRNA慢病毒(PHF8 shRNA組)的人食管鱗癌細(xì)胞系TE-1接種于裸鼠背部皮下，建立食管鱗癌裸鼠移植瘤模型。定期測(cè)量腫瘤體積，繪制腫瘤生長曲線。4周后處死裸鼠，定量PCR及Western blotting法檢測(cè)腫瘤組織中PHF8的表達(dá)。結(jié)果PHF8 shRNA組較陰性對(duì)照shRNA組、空白對(duì)照組的裸鼠致瘤能力明顯減弱，PHF8 mRNA和蛋白的表達(dá)水平顯著降低。結(jié)論慢病毒介導(dǎo)的shRNA干擾能有效減少食管鱗癌裸鼠移植瘤中PHF8的表達(dá)，而降低PHF8的表達(dá)能抑制食管鱗癌移植瘤的生長。

【關(guān)鍵詞】PHD鋅指蛋白8；慢病毒；食管鱗狀細(xì)胞癌；裸鼠移植瘤

我國是食管鱗狀細(xì)胞癌(esophageal squamous cell carcinoma， ESCC，以下簡(jiǎn)稱食管鱗癌)的高發(fā)國家。目前已知，表觀遺傳學(xué)參與包括食管鱗癌在內(nèi)的多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展，某些組蛋白去甲基化酶(histone demethylase， KDM)在腫瘤的發(fā)病過程中起關(guān)鍵作用。PHD鋅指蛋白8(plant homeodomain finger protein 8， PHF8)是近年來新發(fā)現(xiàn)的一種組蛋白去甲基化酶，在體內(nèi)通過對(duì)組蛋白的賴氨酸殘基進(jìn)行去甲基化修飾來調(diào)節(jié)基因的表達(dá)[1]。

筆者既往研究[2]以食管鱗癌細(xì)胞系為研究對(duì)象，通過慢病毒介導(dǎo)的shRNA技術(shù)建立了PHF8表達(dá)沉默的食管鱗癌穩(wěn)定細(xì)胞系，并且體外研究[3]證實(shí)PHF8影響食管鱗癌細(xì)胞的增生、凋亡、克隆形成、遷移和侵襲能力。本研究利用上述已建立的食管鱗癌細(xì)胞系，進(jìn)一步探討PHF8基因?qū)κ彻荀[癌裸鼠移植瘤生長的影響。

1材料與方法

1.1 材料

人食管鱗癌細(xì)胞系TE-1由美國MD Anderson Cancer Center徐曉春教授惠贈(zèng)。感染慢病毒Non-silencing shRNA和PHF8 shRNA的人食管鱗癌TE-1細(xì)胞系由本中心實(shí)驗(yàn)室保存。BALB/c 裸小鼠[實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)：SYXK(京)2012-0023]，SPF 級(jí)，鼠齡5周，體質(zhì)量(19.42±1.28)g，雌性。遵照國家實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)和使用指南，在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心無特殊病原菌條件下分籠飼養(yǎng)。RPMI 1640 培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶均購自美國Gibco公司，RNA提取試劑盒購自美國Qiagen公司，iScript反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自美國Bio-Rad公司，SYBR Green PCR Master Mix購自美國ABI公司，PHF8抗體購自英國Abcam公司，β-actin抗體購自美國Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)

各組食管鱗癌細(xì)胞TE-1系(PHF8 shRNA實(shí)驗(yàn)組，Non-silencing shRNA 陰性對(duì)照組和Control空白對(duì)照組)[2]，用含10%(體積分?jǐn)?shù))胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基，于37 ℃ 含5%(體積分?jǐn)?shù)) CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細(xì)胞生長達(dá)70%～80%融合時(shí)進(jìn)行傳代。

1.2.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型的制備及分組

將21只BALB/c 裸小鼠應(yīng)用隨機(jī)數(shù)字表進(jìn)行完全隨機(jī)化，分為3組，每組7只，分別注射PHF8 shRNA實(shí)驗(yàn)組、Non-silencing shRNA 陰性對(duì)照組和Control空白對(duì)照組的TE-1細(xì)胞。取對(duì)數(shù)生長期的各組食管鱗癌細(xì)胞，經(jīng)胰蛋白酶消化后，制備單細(xì)胞懸液，用1×PBS 洗滌細(xì)胞3 次，計(jì)數(shù)并用PBS 重懸、調(diào)整細(xì)胞密度為4×107/mL。用1 mL 注射器抽取瘤細(xì)胞懸液接種于裸鼠一側(cè)背部皮下，每個(gè)接種部位0.1 mL，含活細(xì)胞數(shù)4×106。

1.2.3觀察指標(biāo)與測(cè)定方法

在裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)期間，定期觀察裸鼠的精神、飲食、體質(zhì)量等及有無異常情況。每隔3 d測(cè)量裸鼠的體質(zhì)量、腫瘤結(jié)節(jié)的長度(L)和寬度(W)。繪制腫瘤生長曲線。腫瘤體積的計(jì)算公式為：V=0.5×L×W2。

1.2.4實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)目的基因表達(dá)

收集各組裸鼠移植瘤組織并勻漿，應(yīng)用Qiagen公司的RNA提取試劑盒提取組織總RNA，Bio-Rad公司的iScript反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，隨后應(yīng)用ABI公司的SYBR Green PCR Master Mix試劑盒，在7500 實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀上完成實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)。引物的序列如下：內(nèi)參照GAPDH：sense：5′-CCACATCGCTCAGACACCAT-3′，antisense：5′-GCGCCCAATACGACCAAAT-3′；目的基因PHF8：sense：5′-GACATGTGCCAGGACTGGTTT-3′，antisense：5′-CAGCAGCCTTCTCCTCTTCAA-3′。

1.2.5Western blotting法檢測(cè)目的蛋白表達(dá)

提取各組移植瘤組織總蛋白后BCA法蛋白定量，40 μg的蛋白樣品變性后進(jìn)行SDS-PAGE蛋白分離，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))牛血清白蛋白室溫封閉1 h，一抗4 ℃孵育搖床過夜，TBST洗膜，二抗室溫孵育1 h，TBST洗膜，ECL化學(xué)發(fā)光鑒定。β-actin為內(nèi)參。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2結(jié)果

2.1各組裸鼠的可比性

各組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均在皮下注射后1周左右成瘤，成瘤率100%。至實(shí)驗(yàn)結(jié)束，動(dòng)物生長良好，精神、飲食及活動(dòng)等方面均無異常。各組動(dòng)物體質(zhì)量隨周數(shù)增加而增加，重復(fù)測(cè)量數(shù)據(jù)的方差分析結(jié)果顯示，各組間體質(zhì)量隨時(shí)間的變化差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (F=0.003，P>0.05)，具有可比性，詳見表1。

2.2各組裸鼠移植瘤體積的比較

各組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的移植瘤的體積隨時(shí)間增加而增大。重復(fù)測(cè)量數(shù)據(jù)方差分析結(jié)果顯示，不同組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=7.78，P<0.01)。與陰性對(duì)照shRNA組和空白對(duì)照組比較，PHF8 shRNA實(shí)驗(yàn)組的瘤體增長速度慢、體積小(P<0.05)，兩對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(表2)。進(jìn)一步繪制腫瘤生長曲線(圖1)，表明PHF8的表達(dá)沉默可使人食管鱗癌裸鼠移植瘤的瘤體生長明顯受抑制。

2.3各組裸鼠移植瘤PHF8的表達(dá)

應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR和Western blotting方法檢測(cè)各組移植瘤組織PHF8 mRNA和蛋白的表達(dá)水平，可見實(shí)驗(yàn)組PHF8的表達(dá)量明顯低于陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組，兩對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖2)，這表明在裸鼠移植瘤實(shí)驗(yàn)中PHF8的表達(dá)沉默持續(xù)有效。

圖1　各組裸鼠移植瘤的生長曲線

GroupNumberofcasesWeek0Week1Week2Week3Week4PHF8shRNA719.23±1.8621.10±1.7022.50±1.5623.43±1.9524.33±1.91Non-silencingshRNA719.21±1.2720.91±1.1822.63±1.0023.61±1.0424.44±1.15Control719.24±1.4421.00±1.4022.47±1.5623.57±1.4924.51±1.60

PHF8: plant homeodomain finger protein 8.

表2各組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的腫瘤體積

Tab2. Tumor volume of each group

GroupNumberofcasesWeek1Week2Week3Week4PHF8shRNA755.12±23.53251.00±67.04704.56±159.541367.93±281.05Non-silencingshRNA767.70±33.43337.76±55.751013.29±183.792025.99±479.75Control772.70±34.71364.70±61.691134.20±231.842197.86±453.57

The tumor volume of each group was increased as times went on. As compared with non-silencing shRNA group and control group， the tumor growth of PHF8 shRNA group was slow and the tumor volume decreased significantly (P<0.05). However， no significant weight differences were observed in mice between non-silencing shRNA group and control group (P>0.05)； PHF8: plant homeodomain finger protein 8.

圖2　裸鼠移植瘤中PHF8的表達(dá)

A: expression levels of PHF8 mRNA determined by quantitative real-time PCR (n=5). B: Western blotting analysis of PHF8 protein levels. β-actin served as the internal reference；1 and 2 are the representative picture of different treat groups；*P<0.05； PHF8: plant homeodomain finger protein 8.

3討論

近年來，表觀遺傳學(xué)(epigenetics)與腫瘤形成之間的關(guān)系越來越受到重視，其研究為腫瘤的發(fā)生和發(fā)展提供了新的理論基礎(chǔ)，并為腫瘤的診斷和治療提供了新的手段[4]。表觀遺傳是指沒有DNA序列變化的、可遺傳的基因表達(dá)改變[5]。它有3個(gè)特點(diǎn)：(1)可遺傳的，即這類改變能夠通過有絲分裂或減數(shù)分裂，在細(xì)胞或個(gè)體世代間傳遞；(2)可逆性的基因表達(dá)調(diào)控；(3)沒有DNA序列變化或者不能用DNA序列的變化解釋。異常的表觀遺傳修飾會(huì)使基因錯(cuò)誤地表達(dá)，引起發(fā)育異常、代謝紊亂和疾病，甚至腫瘤的發(fā)生，因此表觀遺傳修飾對(duì)于研究個(gè)體發(fā)育以及腫瘤的發(fā)生、診斷和治療等方面具有重大意義[6]。

當(dāng)前表觀遺傳學(xué)的研究內(nèi)容主要集中在3個(gè)方面：DNA 甲基化修飾(DNA methylation)、組蛋白共價(jià)修飾(covalent histone modification)和非編碼RNA(non-coding RNAs)。其中組蛋白修飾是表觀遺傳調(diào)控的重要組成部分，包括甲基化、乙?；?、磷酸化、泛素化、SUMO化和ADP核糖基化等，它們分別由不同的組蛋白修飾酶催化，通過改變?nèi)旧|(zhì)的結(jié)構(gòu)以及與其他調(diào)控蛋白相互作用，調(diào)節(jié)真核基因的表達(dá)[7]。

組蛋白甲基化(histone methylation)是表觀遺傳學(xué)的研究內(nèi)容之一。同大多數(shù)表觀遺傳改變一樣，它是一個(gè)可逆的過程。組蛋白甲基化與組蛋白去甲基化(histone demethylation)分別由組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶(histone methyltransferase)和組蛋白去甲基化酶(histone demethylase)催化[8]。組蛋白去甲基化酶是催化甲基化的組蛋白發(fā)生去甲基化的組蛋白修飾酶。自2004年第1個(gè)組蛋白賴氨酸去甲基化酶被發(fā)現(xiàn)以來，目前已發(fā)現(xiàn)30多種，而其中的大部分已經(jīng)被證實(shí)與乳腺癌、前列腺癌、肺癌、結(jié)腸癌、白血病、淋巴瘤等多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān)[9-11]。

PHD鋅指蛋白8(PHF8)是近年來新發(fā)現(xiàn)的一種組蛋白去甲基化酶。有研究[12-14]顯示，PHF8參與調(diào)節(jié)細(xì)胞的增生、凋亡、分化及運(yùn)動(dòng)等生物學(xué)行為。但是關(guān)于PHF8是否參與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展，目前研究仍處于起始階段。Bj?rkman等[15]的研究表明PHF8在前列腺癌中有過表達(dá)，敲除PHF8抑制前列腺癌細(xì)胞的增生、遷移和侵襲，這與筆者在食管鱗癌細(xì)胞的體外研究[3]結(jié)果一致，但關(guān)于PHF8功能的體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)壳皣鴥?nèi)外尚無報(bào)道。筆者利用裸鼠移植瘤模型研究PHF8表達(dá)沉默對(duì)食管鱗癌細(xì)胞體內(nèi)腫瘤生長的影響。將不同處理組的TE-1細(xì)胞分別給裸鼠皮下注射，每只裸鼠注射一種細(xì)胞。各組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均在皮下注射后1周左右成瘤，成瘤率100%。至實(shí)驗(yàn)結(jié)束，動(dòng)物生長良好，精神、飲食及活動(dòng)等方面均無異常。各組動(dòng)物體質(zhì)量隨周數(shù)增加而增加，各組間體質(zhì)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，具有可比性。隨著時(shí)間的增加，各組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的移植瘤逐漸增大，與陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組比較，實(shí)驗(yàn)組的瘤體增長速度慢、體積小，表明PHF8基因表達(dá)沉默抑制食管鱗癌細(xì)胞的體內(nèi)致瘤能力。

本研究結(jié)果證實(shí)，慢病毒介導(dǎo)的shRNA干擾能夠有效、持續(xù)地沉默食管鱗癌細(xì)胞移植瘤中組蛋白去甲基化酶PHF8的mRNA和蛋白表達(dá)。并且，PHF8的表達(dá)沉默能夠抑制食管鱗癌裸鼠移植瘤的生長，提示PHF8可能參與了食管鱗癌的發(fā)病。但腫瘤的病因及發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，單一組蛋白的修飾往往不能獨(dú)立地發(fā)揮作用，關(guān)于組蛋白去甲基化酶的機(jī)制，特別是與其他組蛋白修飾間相互作用的具體機(jī)制尚不太清楚，因此，組蛋白去甲基化酶雖然與腫瘤有關(guān)，但要從分子水平來闡明兩者之間的關(guān)系尚需進(jìn)一步的研究。令人鼓舞的是腫瘤表觀遺傳治療的有效性已經(jīng)得到認(rèn)可，另一類組蛋白修飾酶——去乙?；敢殉蔀榕R床腫瘤治療的靶點(diǎn)，調(diào)節(jié)組蛋白去甲基化酶的活性將成為防治腫瘤的新思路和藥物開發(fā)的新方向[16-18]。

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編輯陳瑞芳

Effect ofPHF8 gene on the growth of transplanted tumor of esophageal squamous-cell carcinoma in nude mice

Zhu Shengtao1，2，3， Sun Xiujing2，3，4， Li Peng1，2，3， Guo Qingdong1，2，3， Zhu Shengquan1，2，3， Zhang Shutian1，2，3*

(1.DepartmentofGastroenterology，BeijingFriendshipHospital，CapitalMedicalUniversity，Beijing100050，China； 2.NationalClinicalResearchCenterforDigestiveDiseases，Beijing100050，China； 3.FacultyofGastroenterology，CapitalMedicalUniversity，Beijing100050，China； 4.DepartmentofGastroenterology，BeijingTiantanHospital，CapitalMedicalUniversity，Beijing100050，China)

【Abstract】ObjectiveTo establish nude mice models with implanted tumor of esophageal squamous-cell carcinoma cells， and to observe the effects of PHF8 gene on the growth of implanted tumor. MethodsNude mice were injected subcutaneously into their right posterior flank with human TE-1 esophageal squamous-cell carcinoma cells (control group)， lentivirus mediated Non-silencing shRNA TE-1 cells (Non-silencing shRNA group)， or lentivirus mediated PHF8 shRNA TE-1 cells (PHF8 shRNA group)， respectively. The size of implanted tumor was measured at regular intervals and the growth curve of tumor was portrayed. Animals were sacrificed at 4 weeks， and the silencing of PHF8 in tumor tissues was confirmed by real-time PCR and Western blotting.ResultsThe tumorigenic effect on nude mice was weaker and lower in PHF8 shRNA group， as compared to those in Non-silencing shRNA group and control group. The expression of PHF8 mRNA and protein in PHF8 shRNA group was significantly decreased. ConclusionLentivirus mediated shRNA effectively inhibited the expression of PHF8 in transplanted tumor of nude mice with human esophageal squamous-cell carcinoma cell lines， and the tumorigenic ability was significantly reduced.

【Key words】PHD finger protein 8; lentivirus; esophageal squamous cell carcinoma; transplanted tumor in nude mice

(收稿日期：2015-12-25)

【中圖分類號(hào)】R 735.1

[doi：10.3969/j.issn.1006-7795.2016.01.003]

*Corresponding author， E-mail：zhangshutian@ccmu.edu.cn

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金(81302160， 81272447)，國家消化系統(tǒng)疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心基金(2015BAI13B09)，北京市醫(yī)院管理局青苗人才計(jì)劃(QML20150507)。This study was supported by National Natural Science Foundation of China (81302160， 81272447)， National Clinical Research Center for Digestive Diseases (2015BAI13B09)， Beijing Municipal Administration of Hospitals’ Youth Programme (QML20150507).

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