龍海波　孫燕芳　曾凡云　彭軍　白成

摘 要 利用EST結(jié)合RACE方法從象耳豆根結(jié)線蟲（Meloidogyne enterolobii）中克隆一個新的果膠酸裂解酶基因Me-pel2（GenBank登錄號KP987180）。Me-pel2 cDNA開放閱讀框全長834 bp，推導(dǎo)編碼277個氨基酸殘基的蛋白，屬于多糖裂解酶第III家族新成員。Me-PEL2與南方根結(jié)線蟲果膠酸裂解酶Mi-PEL3氨基酸具有較高的一致性，為54%。發(fā)育表達結(jié)果顯示，Me-pel2在2齡幼蟲和雄蟲期高豐度表達，而在固著期寄生階段轉(zhuǎn)錄水平急劇下降，推測Me-pel2主要在象耳豆根結(jié)線蟲遷移性階段起重要作用，通過降解寄主細胞壁果膠質(zhì)成分，協(xié)助幼蟲侵入寄主以及在寄主體內(nèi)遷移。

關(guān)鍵詞 象耳豆根結(jié)線蟲；果膠酸裂解酶；基因克??；發(fā)育表達類型

中圖分類號 S436.3 文獻標(biāo)識碼 A

Abstract Cloning and identifying parasitism genes are the keys to understand the molecular basis on nematode parasitism of plants. In this study， a new pectate lyase gene Me-pel2（GenBank accession no. KP987180）was cloned from the root-knot nematode Meloidogyne enterolobii by EST analysis and RACE technology. The open reading frame of Me-pel2 cDNA was 834 bp long and encoded a deduced 277 amino acid sequnce belonging to polysaccharide lyases famlily III. The deduced protein Me-PEL2 shared high identity（54%）with pectate lyase Mi-PEL3 from M. incognita. Semiquantitive RT-PCR analysis confirmed that Me-pel2 transcripts were strongly detected in motile stages（second stage juveniles and adult males）and were weak in sedentary stages. These results indicated that Me-PEL2 may play a role in plant cell wall-degrading during the penetration and migration of M. enterolobii in plant tissues.

Key words Meloidogyne enterolobii； Pectate lyase； Gene clone； Developmental expression pattern

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2016.01.017

象耳豆根結(jié)線蟲（Meloidogyne enterolobii）屬于熱帶根結(jié)線蟲種類，在亞洲、非洲和歐美等地區(qū)均有發(fā)生分布，具有寄主范圍廣、毒性強和危害大的特點，并且能在攜帶Mi抗原基因的辣椒和番茄上寄生繁殖[1-5]。象耳豆根結(jié)線蟲是中國華南地區(qū)最為重要的根結(jié)線蟲種類之一，在廣東和海南為害多種蔬菜和熱帶水果作物并造成重大損失，然而目前依然缺乏有效的防治措施[6-10]。分離和鑒定象耳豆根結(jié)線蟲致病因子是了解其分子寄生致病機制和提出新防治策略的重要基礎(chǔ)。植物線蟲在寄生過程中，一方面利用其特有的口針猛烈穿刺破壞細胞壁物理結(jié)構(gòu)，另一方面通過分泌一系列的細胞壁降解酶，打斷或消除細胞壁化學(xué)作用力達到松弛和降解細胞壁成分的目的，從而協(xié)助線蟲侵入寄主以及在寄主體內(nèi)遷移[11]。果膠酸裂解酶（Pectate Lyase，PEL）是細胞壁降解酶的一種，通過β-消除法裂解脫甲基或低甲酯的同型聚半乳糖醛羧（果膠酸）之間的α-1，4糖苷鍵，起降解細胞壁主要成分果膠質(zhì)的作用[12]。果膠酸裂解酶可由細菌、真菌、線蟲和植物等有機體產(chǎn)生，分布在多糖裂解酶家族Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅸ和Ⅹ等5個家族，目前已鑒定的植物線蟲源果膠酸裂解酶均屬于多糖裂解酶第Ⅲ家族成員。2000年P(guān)opeijus等[13]從馬鈴薯金線蟲（Globodera rostochiensis）中分離克隆了第一個植物寄生線蟲果膠酸裂解酶基因Gr-pel1，其編碼的蛋白具有酶活性功能，這也是首個動物非共生降解果膠質(zhì)的實例。Doyle等[14]利用免疫定位證實了爪哇根結(jié)線蟲（Meloidoyne javanica）中克隆的果膠酸裂解酶Mj-pel1的編碼產(chǎn)物能夠被分泌到體外起作用。近10年來，國內(nèi)外又先后從大豆孢囊線蟲（Heterodera glycines）、南方根結(jié)線蟲（M. incognita）、松材線蟲（Bursaphelenchus xylophilus）、甜菜孢囊線蟲（H. Schachtii）和象耳豆根結(jié)線蟲（M. enterolobii）等一些重要植物線蟲中分離克隆了多個果膠酸裂解酶基因[15-20]。Vanholme等[18]利用RNA干擾技術(shù)（RNA interference， RNAi）將甜菜孢囊線蟲Hs-pel2沉默后，導(dǎo)致線蟲的侵染率下降了50%以上。Bakhetia等[21]和Sukno等[22]先后對大豆孢囊線蟲果膠酸裂解酶基因Hg-pel1利用RNAi沉默，結(jié)果顯示，大豆孢囊線蟲雌蟲數(shù)量大幅度減少，而雄蟲數(shù)量增多。卓侃等[20]用RNAi使象耳豆根結(jié)線蟲果膠酸裂解基因Me-pel1沉默下調(diào)表達，引起侵染性2齡幼蟲對攜帶Mi抗性基因和不攜帶Mi的番茄栽培品種的侵染率顯著下降。一系列研究結(jié)果表明，果膠酸裂解酶是植物線蟲侵染寄生過程中分泌的一類重要致病因子。

本研究通過克隆果膠酸裂解酶Me-pel2基因全長并分析其發(fā)育表達類型，了解Me-pel2在象耳豆根結(jié)線蟲寄生過程中的作用特點和功能地位，為闡明線蟲-寄主互作提供新的分子數(shù)據(jù)，同時為防治象耳豆根結(jié)線蟲提供候選靶標(biāo)基因。

1 材料與方法

1.1 材料

供試象耳豆根結(jié)線蟲種群源于海南樂東佛羅鎮(zhèn)的辣椒病根，并經(jīng)溫室內(nèi)單卵囊純化培養(yǎng)，接種寄主為番茄（cv. 特級大明星）。

1.2 方法

1.2.1 線蟲分離與收集 取象耳豆根結(jié)線蟲單卵囊接種90 d左右的番茄病根，經(jīng)1%的食用色素亮藍染色后于解剖鏡下挑取根表面的卵囊，并在室溫25 ℃條件下孵化獲得，2齡幼蟲。取接種2齡幼蟲（約100 000頭）第2天、第7天和第13天的番茄病根，參照Ding等[23]描述的方法分離收集根內(nèi)不同發(fā)育階段的幼蟲蟲體。取接種2齡幼蟲35 d的番茄病根，解剖鏡下用挑針直接從根內(nèi)分離獲得雌成蟲。獲得的各蟲體經(jīng)無菌的PBS緩沖液清洗，進行后續(xù)實驗或保存于液氮中備用。

1.2.2 核酸提取與合成 采用TRIzol法提取象耳豆根結(jié)線蟲2齡幼蟲及各蟲態(tài)的總RNA，具體操作步驟按照說明書進行（Invitrogen）。利用FastQuant RT（with gDNase）試劑盒反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈，操作步驟按照說明書進行（TIANGEN）。利用GeneRacerTM RACE 試劑盒（Invitrogen）反轉(zhuǎn)錄合成含5′及3′末端接頭的RACE模板，具體步驟參照說明書進行。

1.2.3 Me-pel2 cDNA全長克隆 根據(jù)實驗室已獲得的象耳豆根結(jié)線蟲cDNA文庫序列信息，設(shè)計Me-pel2基因末端擴增特異引物Me-E1（AGCGCCT

CCTCCATCTACGATATATG）和Me-E2（TCAACACAA

TATACATATATCGTAG）。利用RACE技術(shù)擴增獲得Me-pel2基因5′及3′末端序列，其中5′RACE-PCR所用引物為Me-E1和GeneRacerTM 5′primer（CGACTGGAGCACGAGGACACTGA），反應(yīng)體系：10×PCR Buffer 5 μL，dNTPs 4 μL，Mg2+ 4 μL，上下游引物各2 μL，Ex taq酶0.5 μL， RACE模板1 μL，滅菌雙蒸水31.5 μL。褪火溫度為56 ℃，共35個循環(huán)。3′RACE-PCR所用引物為Me-E2和GeneRacerTM 3′primer（GCTGTCAACGATACGCTACG

TAACG），反應(yīng)體系與5′RACE-PCR一致。褪火溫度為58 ℃，35個循環(huán)。根據(jù)所獲的末端序列，設(shè)計Me-pel2 cDNA全長特異引物MeP2-F（ATGCTTA

ATATATTAATTTTAATTATTT）和MeP2-R（TCAATT

GACCACTTTAAAT），擴增Me-pel2 cDNA全長。反應(yīng)體系：10×PCR Buffer 5 μL，dNTPs 4 μL，Mg2+ 4 μL，上下游引物各2 μL，Ex taq酶0.5 μL，cDNA模板1 μL，滅菌雙蒸水31.5 μL。褪火溫度為55 ℃，35個循環(huán)。PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測后，純化連接至pGM-T載體（TIANGEN），送華大基因公司測序。

1.2.4 半定量RT-PCR 應(yīng)用Oligotex mRNA Mini（QIAGEN）試劑盒，參照說明書對提取的象耳豆根結(jié)線蟲各蟲態(tài)總RNA進行純化，獲得mRNA。取各蟲態(tài)等量mRNA（200 ng）反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈。以第一鏈為模板，結(jié)合Me-pel2特異引物RT-F（GGTTCAGTCATTAGTGGCTACAA）和RT-R（AACA

ATCGTTAAATCTCGTTGAT）進行PCR擴增。同時利用引物ActinF（AACCTCTGCCCCTTCTTGTGCTG）和ActinR（AACGTTCAACGCCCAATGAAAGT）擴增β-actin基因作為陽性對照。PCR反應(yīng)體系參照3′RACE-PCR，褪火溫度為58 ℃，設(shè)置28和35兩個循環(huán)數(shù)，擴增產(chǎn)物經(jīng)2.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.5 序列分析 序列比對和同源性搜索在NCBI網(wǎng)上進行（http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）。應(yīng)用Signal P v 4.0進行信號肽及切割位點預(yù)測。蛋白分子量和等電點由在線軟件PROTEIN MACHINE預(yù)測（http：//us.expasy.org/tools/）。利用MEGA 6.0 軟件的鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，建樹步長重復(fù)數(shù)為1 000次[24]。

2 結(jié)果與分析

2.1 Me-pel2 cDNA克隆與序列分析

通過5′和3′RACE-PCR反應(yīng)分別獲得了長度為463 bp的5′末端及長度為525 bp的3′末端序列，而根據(jù)末端序列所設(shè)計的Me-pel2基因全長特異引物擴增獲得了一個長度為800 bp左右的條帶（圖1）。測序結(jié)果證實該序列實際長度為834 bp，為一個完整的開放閱讀框，起始密碼子ATG，終止密碼子為TGA，推導(dǎo)編碼長度為277個氨基酸的蛋白序列。相似性搜索比對（Blastx）顯示，該cDNA與NCBI數(shù)據(jù)庫中根結(jié)線蟲、孢囊線蟲等植物寄生線蟲以及一些真菌和細菌的果膠酸裂解酶基因同源，一致性在16%～54%之間。同時，該cDNA編碼的氨基酸序列含有一個果膠酸裂解酶保守結(jié)構(gòu)域，位于亮氨酸Leu73至纈氨酸Val244之間。因此，從象耳豆根結(jié)線蟲中克隆獲得的cDNA全長序列為一個新的果膠酸裂解酶基因，筆者將其命名為Me-pel2，并在NCBI GenBank提交注冊，登錄號為KP987180。

2.2 Me-PEL2蛋白特征及系統(tǒng)進化分析

象耳豆根結(jié)線蟲果膠酸裂解酶Me-PEL2蛋白序列由277個氨基酸殘基組成，預(yù)測分子量為29.86 ku，等電點pI為8.67。Signal P軟件預(yù)測Me-PEL2蛋白N端含有一個起分泌功能的信號肽前體序列，長度為16個氨基酸殘基，剪切位點位于丙氨酸Ala16與異亮氨酸Ile17之間（圖2）。BlastP 搜索結(jié)果顯示，Me-PEL2與南方根結(jié)線蟲（M. incognita）果膠酸裂解酶Mi-pel3（GenBank No： AY861685）具有較高的一致性，為54%。Me-PEL2與植物線蟲的其它果膠酸裂解酶一致性均較低，其中與孢囊線蟲果膠酸裂解酶一致性在30%～33%之間，而與象耳豆根結(jié)線蟲果膠酸裂解酶Me-pel1（HQ180169）的一致性僅為23%。保守結(jié)構(gòu)域搜索及多序列比對結(jié)果表明，象耳豆根結(jié)線蟲果膠酸裂解酶Me-PEL2屬于多糖裂解酶第Ⅲ家族，具有第Ⅲ家族典型特征的4個高度保守區(qū)域，且含多個保守的半胱氨酸殘基和帶正電荷殘基，為果膠酸裂解酶的活性位點（圖2）。

從GenBank中選取與Me-PEL2具有同源性的30個植物寄生線蟲、細菌和真菌的果膠酸裂解酶氨基酸序列，運用MEGA6.0軟件鄰接法進行系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建。結(jié)果顯示，植物寄生線蟲的果膠酸裂解酶聚為4個進化分支，分別為NematodeⅠ、NematodeⅡ、NematodeⅢ和NematodeⅣ（圖3）。象耳豆根結(jié)線蟲Me-PEL1和Me-PEL2屬于不同分支，其中Me-PEL1與南方根結(jié)線蟲Mi-PEL1、爪哇根結(jié)線蟲Mj-PEL1形成一個小的分支（NematodeⅠ），并且與來自細菌和真菌的果膠酸裂解酶聚為一個較大的分支。Me-PEL2與南方根結(jié)線蟲Mi-PEL2和Mi-PEL3，以及擬禾本科根結(jié)線蟲Mg-PEL1聚為一個小的獨立分支（NematodeⅢ）。多個孢囊線蟲果膠酸裂解酶基因包括大豆孢囊線蟲Hg-PEL1，Hg-PEL2和Hg-PEL5、甜菜孢囊線蟲Hs-PEL1、馬鈴薯白線蟲Gp-PEL、馬鈴薯金線蟲Gr-PEL1以及煙草孢囊線蟲Gts-PEL1和Gv-PEL1聚為一個大的分支（NematodeⅣ）。其余植物線蟲果膠酸裂解酶包括甜菜孢囊線蟲Hs-PEL2、馬鈴薯金線蟲Gr-PEL2、燕麥真滑刃線蟲Aa-PEL1和Aa-PEL2、松材線蟲Bx-PEL1和Bx-PEL2以及擬松材線蟲Bm-PEL1和Bm-PEL2則構(gòu)成另外一個較大的分支Nematode PEL3-II。

2.3 Me-pel2在根結(jié)線蟲各蟲態(tài)的表達

通過運用RT-PCR分析象耳豆根結(jié)線蟲果膠酸裂解酶基因Me-pel2在卵期，侵染前2齡幼蟲，侵染期2齡幼蟲、3齡幼蟲、4齡幼蟲、雌成蟲及雄蟲等蟲態(tài)的發(fā)育表達特征。電泳檢測結(jié)果顯示，Me-pel2在象耳豆根結(jié)線蟲各蟲態(tài)均有轉(zhuǎn)錄表達，但表達豐度不同（圖4）。以象耳豆根結(jié)線蟲在各蟲態(tài)穩(wěn)定表達的持家基因β-actin為對照，Me-pel2 在侵染前和侵染期2齡幼蟲中以及雄蟲階段表達量相對最高，電泳條帶清晰明顯，而在卵期表達量次之。在3齡、4齡幼蟲以及雌成蟲期，Me-pel2轉(zhuǎn)錄豐度顯著降低，電泳檢測信號微弱。

3 討論與結(jié)論

克隆和鑒定植物線蟲寄生致病相關(guān)基因是解析其分子寄生機制的關(guān)鍵途徑，也是當(dāng)今國際植物線蟲學(xué)研究的熱點方向。果膠酸裂解酶作為關(guān)鍵植物細胞壁降解酶類之一，在植物寄生線蟲成功侵染寄生過程中具有重要地位，參與到植物線蟲侵入寄主、在寄主體內(nèi)遷移以及誘導(dǎo)取食位點形成等過程[21，25-27]。本研究從象耳豆根結(jié)線蟲中克隆了一個新的果膠酸裂解酶基因Me-pel2，編碼蛋白Me-PEL2的N端含有16個氨基酸殘基的信號肽，同時內(nèi)部有4個保守肽段和多個半胱氨酸殘基，符合多糖裂解酶第Ⅲ家族特征[13，28]，確定Me-PEL2為多糖裂解酶第Ⅲ家族新成員。

象耳豆根結(jié)線蟲Me-PEL2與其它植物寄生線蟲果膠酸裂解酶一致性在20%～54%之間，與真菌和細菌的果膠酸裂解酶進行聚類分析的結(jié)果中，植物線蟲果膠酸裂解酶并沒有形成一個共同的進化分支，而是分散在4個獨立的分支，該結(jié)果與一些文獻所報道相似[17，29]。半定量PCR研究結(jié)果表明，象耳豆根結(jié)線蟲果膠酸裂解酶基因Me-pel2在遷移性幼蟲和雄蟲期表達豐度最高，而在固著期寄生階段轉(zhuǎn)錄水平急劇下降，該結(jié)果與南方根結(jié)線蟲3個果膠酸裂解酶基因的發(fā)育表達類型一致[16]。結(jié)果說明，果膠酸裂解酶基因的表達及其產(chǎn)物的分泌與植物線蟲寄生行為密切相關(guān)。象耳豆根結(jié)線蟲屬于專性固著性內(nèi)寄生，僅在侵染性2齡幼蟲和雄蟲期具有遷移能力，Me-pel2在2齡幼蟲和雄蟲期高豐度表達，表明其蛋白產(chǎn)物主要在遷移性寄生階段起作用，通過降解寄主細胞壁果膠質(zhì)成分，協(xié)助線蟲侵入寄主（2齡幼蟲）以及在寄主體內(nèi)遷移（侵染期2齡幼蟲和雄蟲）。在3齡幼蟲、4齡幼蟲和雌成蟲期，象耳豆根結(jié)線蟲呈固著態(tài)從取食位點攫取營養(yǎng)物質(zhì)，這些發(fā)育階段Me-pel2表達量顯著降低，表明其蛋白產(chǎn)物在寄生階段后期的發(fā)育過程不具有重要作用。此外，Me-pel2在卵期表達量也相對較高，推測可能是已有卵塊即將蛻皮發(fā)育成侵染性，2齡幼蟲，Me-pel2開始誘導(dǎo)表達有助于孵化后能夠立即侵染寄主植物。

象耳豆根結(jié)線蟲能夠突破Mi介導(dǎo)的抗性反應(yīng)，在對南方根結(jié)線蟲、爪哇根結(jié)線蟲等多種根結(jié)線蟲具有抗性的作物上寄生繁殖，表明其與寄主植物建立親和互作關(guān)系，具有獨特的分子機制。然而，目前有關(guān)象耳豆根結(jié)分子致病機理的研究還處于初始階段，有關(guān)象耳豆根結(jié)線蟲寄生致病相關(guān)基因的報道很少。本研究克隆鑒定了一個新的果膠酸裂解酶基因Me-pel2，通過研究Me-pel2序列特征和發(fā)育表達類型，為解析Me-pel在象耳豆根結(jié)線蟲寄生過程中的作用特點奠定了基礎(chǔ)，同時為了解象耳豆根結(jié)線蟲的分子寄生致病機理提供，新的分子證據(jù)，后續(xù)研究中可結(jié)合利用RNAi技術(shù)進一步對Me-pel2進行功能驗證。

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責(zé)任編輯：趙軍明