王　軍，劉妮妮，趙　權(quán)，葉琳琳，劉　婧，劉玉琳，徐　菲

兩種化學(xué)發(fā)光法測定乙肝五項性能評估

王軍，劉妮妮，趙權(quán)，葉琳琳，劉婧，劉玉琳，徐菲

［關(guān)鍵詞］光激化學(xué)發(fā)光法；乙型肝炎；定量分析

光激化學(xué)發(fā)光法（light initiated chemiluminescence assay，LICA）是以納米級高分子微粒為載體的免疫化學(xué)發(fā)光技術(shù)，本研究對該方法與化學(xué)發(fā)光微粒免疫分析法（chemiluminescent microparticle immunoassay，CMIA）檢測乙型肝炎病毒（HBV）感染的血清學(xué)標(biāo)志物的結(jié)果做比較，以分析該方法檢測性能與CMIA的符合程度及對臨床診斷的影響。

1　材料和方法

1.1儀器、試劑及檢測樣本收集1015例疑似HBV感染者靜脈血，分離血清待測；收集乙肝五項同時為陰性（經(jīng)CMIA篩查）的一個血清盤。光激化學(xué)發(fā)光法的儀器（LiCA HT高通量免疫分析儀和LiCA SP全自動移液器）和試劑，均為上海博陽生物科技有限公司產(chǎn)品；化學(xué)發(fā)光微粒免疫分析法的儀器（ARCHITECT i2000SR）和試劑，均為美國雅培公司產(chǎn)品；相關(guān)試劑批號如下：

雅培試劑批號：HBsAg（26057LF00）；HBsAb （27235LF00）；HBeAg（24065LI00）；HBeAb（24512L I00）；HBcAb（22362LI00）。

博陽試劑批號：HBsAg（A1019）；HBsAb（A1020）；HBeAg（A1021）；HBeAb（A1021）；HBcAb（A1021）。

1.2結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)（1）雅培結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)：HBsAg＞0.05 IU/mL；HBsAb＞10 mIU/mL；HBeAg＞1 S/CO；HBeAb＜1 S/CO；HBcAb＞1 S/CO。（2）博陽結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)：HBsAg＞0.2 ng/ml；HBsAb＞10 mIU/ml；HBeAg＞1 PEIU/ml；HBeAb＞2 PEIU/ml；HBcAb＞5.3 PEIU/ml。

1.3評價方法

1.3.1精密度根據(jù)EP5-A文件中關(guān)于實驗方案的要求，應(yīng)對標(biāo)本每天做2批實驗，批間相隔的時間不少于2 h，每批對樣品進(jìn)行雙份測定，20 d后得到80個結(jié)果，共40對。每次檢測前，分別取出HBsAg、HBsAb、HBeAg、HBeAb、HBcAb的陰性血清盤、低值質(zhì)控品QL和高值質(zhì)控品QH，室溫放置30 min后再上機(jī)檢測。按EP5-A文件的要求對檢測結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計分析，計算CV值。

1.3.2回收率測定分別取上海博陽生物科技有限公司提供的HBsAg、HBsAb 6點定標(biāo)液各200 μl，按濃度梯度分別加入5個試管中，0濃度管為空白，不加定標(biāo)液；隨機(jī)取一份HBsAg陽性血清和HBsAb陽性血清，通過光激化學(xué)發(fā)光法分別測其濃度，然后將兩份血清各200 μl分別加入已知濃度的試管中，每管重復(fù)測量2次，取其均值，以各濃度點的實測平均值占其理論期望值的百分?jǐn)?shù)計算其回收率。

1.3.3檢測結(jié)果比較通過兩種方法對1015例HBV感染者臨床樣本的平行檢測，以雅培CMIA為參考對象來評估博陽LICA方法檢測的乙型肝炎病毒5項血清學(xué)指標(biāo)與CMIA檢測結(jié)果的符合率。

1.4統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件，曲線擬合采用3次樣條曲線擬合，對兩種方法檢測結(jié)果差異的顯著性比較采用配對χ2檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)　果

2.1工作曲線對不同檢測項，取同一批號不同靶值的定標(biāo)品連續(xù)檢測5 d，2次/d。曲線擬合采用3次樣條曲線擬合，根據(jù)各自的均值繪制工作曲線，r2＝0.998。

2.2試驗性能評價

2.2.1精密度檢測LICA五項血清學(xué)標(biāo)志精密度結(jié)果見表1、2。

表1　LICA乙肝五項低值質(zhì)控品精密度

表2　LICA乙肝五項高值質(zhì)控品精密度

2.2.2回收率測定不同濃度HBsAg、HBsAb的回收率見表3、4，HBsAg平均回收率為100.16% （96.81%～102.69%）；HBsAb平均回收率為99.7% （95.85%～104.55%）。

表3　不同濃度的HBsAg回收率

表4　不同濃度的HBsAb回收率

2.2.3兩種方法檢測結(jié)果比較見表5。

表5　LICA與CMIA檢測HBV感染5項血清學(xué)標(biāo)志結(jié)果比較

3　討　論

LICA檢測原理源于90年代問世的單線態(tài)氧分子能量傳遞發(fā)光免疫分析技術(shù)［2-4］，該技術(shù)采用了納米級顆粒，大大增加了生物分子的包被面積，同時借助鏈霉親和素-生物素放大系統(tǒng)，使單位體積反應(yīng)體系中含有更高濃度的生物分子，為實現(xiàn)超高敏感性，減少樣本和試劑用量奠定了基礎(chǔ)。另外，這種納米顆粒在液相中保持穩(wěn)定的懸浮狀態(tài)，并借助于結(jié)合則發(fā)光原理，實現(xiàn)了均相免清洗檢測，和其他化學(xué)發(fā)光法相比具有如下特點：（1）LICA反應(yīng)體系為均相反應(yīng)，傳統(tǒng)免疫檢測技術(shù)多為非均相反應(yīng)，非均相反應(yīng)具有反應(yīng)不充分、反應(yīng)時間長、反應(yīng)體系溫度均一性差的缺點，而LICA整個反應(yīng)是在均相中進(jìn)行的，均相具有反應(yīng)充分、反應(yīng)時間短、反應(yīng)體系溫度均一性好的優(yōu)點，顯示出該方法具有很高的精密度；（2）LICA另一個特點是免清洗，由于在均相中反應(yīng)，加上其獨特的檢測原理結(jié)合則發(fā)光，所以檢測過程無須進(jìn)行清洗分離，則能有效降低檢測過程中的隨機(jī)誤差和交叉污染，最大限度地提高了檢測的準(zhǔn)確度；（3）LICA樣本及試劑用量微量化，每項樣本及試劑用量僅25 μL，隨著樣本用量地大幅減少，使得檢測小型化芯片化和高通量成為可能；（4）LICA超敏感性，由于采用了納米級微粒，增加了反應(yīng)表面積，縮短了反應(yīng)時間，使檢測的敏感性大大提高。有文獻(xiàn)報道，該方法對可能存在的干擾物質(zhì)，如單線態(tài)氧淬滅物質(zhì)（抗氧化劑、血紅蛋白、維生素C等）生物素結(jié)構(gòu)類似物如總膽紅素、三酰甘油等具有較好的耐受能力，少數(shù)物質(zhì)在較高的濃度時的確存在干擾，但在常規(guī)濃度情況下，這些干擾作用可以忽略不計，表現(xiàn)出較高的特異性［5-7］以CMIA為參照，LICA對1015例臨床樣本檢測結(jié)果顯示，2種檢測方法對檢測結(jié)果的符合率分別為99.9%、99.7%、99.8%、99.51%、99.7%，具有很高的一致性，而作為輔助指標(biāo)的抗HBe和HBeAg存在一定差異，其中兩者不符的樣本多處于灰區(qū)弱陽或弱陰范圍，導(dǎo)致差異的原因是由于2種方法在抗HBe和HBeAg的原材料和溯源選擇上存在一定差異［8］；當(dāng)2種方法檢測結(jié)果發(fā)生分歧時，可尋求第三方驗證，本次試驗，由于樣本剩余量不足，未能將所有與CMIA不符的結(jié)果進(jìn)行第三方驗證。總體上，LICA與CMIA在HBV感染的血清學(xué)標(biāo)志項目上符合率很高，而在個別項目上存在一定的差異，但這并不影響本評價試驗得出的結(jié)論?？傊?，LICA以其獨特的檢測技術(shù)實現(xiàn)了微量敏感快速均相免清洗檢測，與CMIA相比，具有相近的檢測性能。

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［2015-08-18收稿，2015-09-16修回］［本文編輯：吳蓉］

［中圖分類號］R512.62

［文獻(xiàn)標(biāo)志碼］B

［作者單位］266071山東青島，解放軍401醫(yī)院檢驗科（王軍，劉妮妮，趙權(quán)，葉琳琳，劉婧，劉玉琳，徐菲）

DOI：10.14172/j.issn1671-4008.2016.02.010