徐 鳳，李春蓮，李 揚(yáng)，柴乖強(qiáng)，王中華

(西北農(nóng)林科技大學(xué)農(nóng)學(xué)院，陜西楊凌 712100)

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節(jié)節(jié)麥幼胚再生體系的建立

徐 鳳，李春蓮，李 揚(yáng)，柴乖強(qiáng)，王中華

(西北農(nóng)林科技大學(xué)農(nóng)學(xué)院，陜西楊凌 712100)

摘要：為建立高效的節(jié)節(jié)麥幼胚再生體系，以節(jié)節(jié)麥幼胚為外植體，通過(guò)正交設(shè)計(jì)，探索基本培養(yǎng)基、2,4-D、碳源、KT等因素對(duì)幼胚愈傷組織誘導(dǎo)、分化及植株再生效果的影響。結(jié)果表明，4 種因素中，基本培養(yǎng)基對(duì)節(jié)節(jié)麥幼胚愈傷組織誘導(dǎo)的影響最顯著(P<0.05)，2,4-D濃度對(duì)節(jié)節(jié)麥幼胚愈傷組織誘導(dǎo)也有顯著影響(P<0.05)，添加3.0 mg·L-12,4-D的培養(yǎng)基誘導(dǎo)出的愈傷組織質(zhì)量高，淡黃色，表面呈不規(guī)則顆粒狀，質(zhì)地致密，再生頻率可以達(dá)到17.62%。KT濃度對(duì)節(jié)節(jié)麥愈傷分化影響最顯著，基本培養(yǎng)基、2,4-D和碳源對(duì)節(jié)節(jié)麥幼胚愈傷分化均無(wú)顯著影響。不同碳源對(duì)節(jié)節(jié)麥幼胚愈傷組織誘導(dǎo)和分化的影響均不顯著，為節(jié)約成本可直接選用30 g·L-1蔗糖作為碳源。節(jié)節(jié)麥幼胚組織培養(yǎng)的最佳組合是：愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基+3 mg·L-12,4-D+ 15 g·L-1蔗糖+15 g·L-1甘露醇，愈傷分化培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基+15 g·L-1蔗糖+15 g·L-1甘露醇+1.0 mg·L-1KT。

關(guān)鍵詞：節(jié)節(jié)麥；幼胚；胚性愈傷；愈傷分化

采用現(xiàn)代基因工程方法將優(yōu)良基因?qū)胄←湆?duì)其進(jìn)行遺傳改良是當(dāng)前小麥育種的一個(gè)新方向。目前小麥基因工程育種進(jìn)展緩慢，這一方面是由于普通小麥基因組序列龐大，它含有A、B、D三個(gè)同源染色體組，基因組約包含170億個(gè)堿基，這一數(shù)值是玉米的7倍和水稻的35倍，約有124 000個(gè)基因[1]，而且基因之間存在冗余、干擾等現(xiàn)象，使其功能基因的研究十分困難；另一方面由于小麥的遺傳轉(zhuǎn)化效率很低，使得基因工程育種無(wú)法得到廣泛應(yīng)用。節(jié)節(jié)麥(Aegilopstauschii)作為小麥D基因組的供體，其基因組小、遺傳背景簡(jiǎn)單。節(jié)節(jié)麥的D基因組對(duì)小麥基因組的研究具有重要的參考價(jià)值，它的序列已經(jīng)廣泛應(yīng)用到小麥基因序列分析中，因而節(jié)節(jié)麥成為小麥育種的重要資源[2]。節(jié)節(jié)麥具有較高的遺傳多樣性和較強(qiáng)的抵抗各種生物和非生物脅迫的能力，這些性狀都有助于小麥品種的改良[3-4]。此外，D基因組提供了許多與小麥品質(zhì)相關(guān)的基因，節(jié)節(jié)麥可以為小麥品質(zhì)改良及小麥D基因組功能研究提供參考。

要研究節(jié)節(jié)麥的基因功能，首先要建立一個(gè)高效而穩(wěn)定的遺傳轉(zhuǎn)化體系，而遺傳轉(zhuǎn)化效率的高低主要取決于組織培養(yǎng)中植株再生頻率的高低。目前，小麥組織培養(yǎng)技術(shù)已十分成熟，在研究過(guò)程中積累了豐富的經(jīng)驗(yàn)，這為節(jié)節(jié)麥組織培養(yǎng)體系的建立提供了重要參考。前人研究表明，影響小麥組織培養(yǎng)的主要因素有基因型、外植體、外源激素、培養(yǎng)基類型等[5-10]。另外，還有研究者通過(guò)調(diào)整碳源的種類和比例來(lái)改善愈傷組織的質(zhì)量[11]。但到目前為止，關(guān)于節(jié)節(jié)麥幼胚再生體系的研究尚未見報(bào)道?；谇叭岁P(guān)于小麥組織培養(yǎng)的研究成果，筆者選擇節(jié)節(jié)麥幼胚為外植體，通過(guò)4因素16水平的正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)，探索基本培養(yǎng)基、2,4-D、碳源、KT等因素對(duì)節(jié)節(jié)麥幼胚愈傷組織誘導(dǎo)、分化及植株再生的影響，旨在篩選適合節(jié)節(jié)麥幼胚組織培養(yǎng)的體系，為節(jié)節(jié)麥遺傳轉(zhuǎn)化研究奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

試驗(yàn)所用節(jié)節(jié)麥的種子由西北農(nóng)林科技大學(xué)標(biāo)本區(qū)提供。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

采用SPSS 18.0軟件進(jìn)行4因素不同水平正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，各因素水平如下：基本培養(yǎng)基分為3個(gè)水平，分別為MS培養(yǎng)基(Ⅰ)、N6培養(yǎng)基(Ⅱ)、B5培養(yǎng)基(Ⅲ)；2,4-D濃度分為4個(gè)水平，分別為1.0、2.0、3.0、4.0 mg·L-1；碳源分為4個(gè)水平，分別為30 g·L-1蔗糖(A)、30 g·L-1麥芽糖(B)、15 g·L-1蔗糖+15 g·L-1甘露醇(C)、15 g·L-1蔗糖+15 g·L-1山梨醇(D)；KT濃度分為3個(gè)水平，分別為1.0、1.5、2.0 mg·L-1，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)如表1所示，共16個(gè)組合。

表1　4因素不同水平的正交設(shè)計(jì)

以上培養(yǎng)基pH值均為5.8，121 ℃高壓滅菌20 min后備用。

1.2.2幼胚的選擇及消毒

節(jié)節(jié)麥抽穗揚(yáng)花時(shí)進(jìn)行掛牌標(biāo)記，揚(yáng)花后10～12 d取標(biāo)記穗子帶回實(shí)驗(yàn)室，插入水中以免失水幼胚活性降低，置于4 ℃冰箱中低溫處理1～2 d，然后用鑷子剝出籽粒，75%酒精表面消毒約 1 min，無(wú)菌水沖洗2～3遍，15%NaClO消毒20 min，無(wú)菌水沖洗3～5遍。

1.2.3愈傷組織誘導(dǎo)及分化

消毒后的節(jié)節(jié)麥未成熟種子用鑷子固定，用手術(shù)刀挑出幼胚(大小約為0.5～1.5 mm)，盾片朝上接種在相應(yīng)的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，每一皿培養(yǎng)基上接種大約80枚幼胚，每個(gè)處理重復(fù)3次，25 ± 1 ℃黑暗條件下培養(yǎng),每?jī)芍芨鼡Q一次培養(yǎng)基。將誘導(dǎo)30 d的愈傷組織轉(zhuǎn)至相應(yīng)的分化培養(yǎng)基上進(jìn)行分化培養(yǎng)，此時(shí)應(yīng)轉(zhuǎn)入光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，光強(qiáng)為2 500～3 000 lx，每天光照16 h，溫度為25 ± 1 ℃，每?jī)芍芨鼡Q一次培養(yǎng)基。

1.2.4生根和壯苗

將愈傷組織表面出現(xiàn)綠點(diǎn)、綠色芽苗及葉狀結(jié)構(gòu)的愈傷塊轉(zhuǎn)接于新鮮的分化培養(yǎng)基上進(jìn)行芽苗誘導(dǎo)。待芽苗長(zhǎng)至3～5 cm高時(shí)將這些芽苗或分蘗基部的愈傷塊切除，再將芽苗轉(zhuǎn)至生根培養(yǎng)基上進(jìn)行生根培養(yǎng)。

1.2.5組培苗的移栽

準(zhǔn)備好育苗基質(zhì)，用水浸透。挑選根的長(zhǎng)度為3～5 cm的組培苗進(jìn)行移栽，移栽過(guò)程中盡可能清除多余的培養(yǎng)基。在移栽后的花缽上覆蓋一層保鮮袋，防止植株失水，同時(shí)將移栽苗放在弱光條件下2 d，再除去保鮮袋，轉(zhuǎn)在正常光照下培養(yǎng)。

1.3愈傷組織的觀察和記錄

幼胚接種到愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基15 d后，觀察愈傷組織出愈質(zhì)量，并記錄質(zhì)量等級(jí)?！?”表示愈傷組織質(zhì)量差，水浸狀，質(zhì)軟，蒼白色或者褐變，甚至死亡，或者愈傷塊長(zhǎng)有大量毛狀根；“+ +”表示愈傷組織質(zhì)量中等，淡黃色，比較干燥，有顆粒狀胚性愈傷出現(xiàn)； “+++ ”表示愈傷組織質(zhì)量高，黃色或淡黃色，表面呈不規(guī)則顆粒狀，質(zhì)地致密。

1.4數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

接種幼胚后7d統(tǒng)計(jì)誘導(dǎo)出的愈傷數(shù)，計(jì)算出愈率；轉(zhuǎn)移至分化培養(yǎng)基之前,統(tǒng)計(jì)胚性愈傷數(shù)，計(jì)算胚性愈傷率；分化培養(yǎng)40 d后，統(tǒng)計(jì)愈傷組織分化率；分化出的綠芽轉(zhuǎn)至生根培養(yǎng)基，計(jì)算成苗率。所有數(shù)據(jù)通過(guò)SPSS 18.0軟件方進(jìn)行差分析，顯著性水平為P=0.05。

出愈率= 形成愈傷組織的幼胚數(shù)/接種幼胚數(shù)×100%；

胚性愈傷率= 形成胚性愈傷組織的幼胚數(shù)/ 接種幼胚數(shù)×100%；

愈傷分化率= 分化出綠芽原基或綠芽的愈傷組織塊數(shù)/接種的愈傷組織數(shù)×100%；

成苗率=成苗數(shù)/接種愈傷組織數(shù)×100%。

2結(jié)果與分析

2.1不同處理對(duì)節(jié)節(jié)麥幼胚的誘導(dǎo)、分化及再生的影響

從圖1和表2 可以看出，第3、8、9、16處理下節(jié)節(jié)麥的愈傷組織質(zhì)量最高，第2、7、11、12、15處理的愈傷組織質(zhì)量較差；出愈率較高的處理有3、5、15、16(分別為94.76%、93.62%、93.30%、94.38%)，出愈率較低的處理有2、7、12、13(分別為83.41%、84.68%、85.77%、85.50%)；胚性愈傷率較高的處理有3、8、9、16(分別為85.02%、78.10%、80.22%、82.40%)，胚性愈傷率較低的處理有2、7、11、12(分別為50.22%、46.77%、44.84%、55.65%)；愈傷分化率較高的處理有3、5、9、10(分別為59.29%、34.47%、63.12%、38.66%)，愈傷分化率較低的處理有6、11、12、16(愈傷分化率分別為2.94%、3.59%、2.92%、3.97%)；成苗率較高的處理有3、8、9、10(分別為16.21%、6.35%、17.62%、10.92%)，成苗率較低的處理有6、12、13、16(分別為0、0、1.34%、0)。節(jié)節(jié)麥再生體系的建立最重要的是要得到組培再生苗，本實(shí)驗(yàn)16個(gè)處理中處理9的成苗率最高，因此這16個(gè)組合中處理9為最佳組合。

2.2試驗(yàn)因素重要性比較

綜合分析影響節(jié)節(jié)麥幼胚愈傷組織誘導(dǎo)的各個(gè)因素，從表3可以看出，各因素的重要性依次為基本培養(yǎng)基> 2,4-D > 碳源，根據(jù)各因素的最佳水平，初步可以推斷節(jié)節(jié)麥幼胚胚性愈傷率最高的組合為：MS培養(yǎng)基，2,4-D濃度為2 mg·L-1，碳源為麥芽糖。對(duì)試驗(yàn)各個(gè)因素進(jìn)行方差分析，表3結(jié)果顯示，基本培養(yǎng)基和2，4-D各水平間胚性愈傷率差異達(dá)顯著水平(P<0.05)，而碳源各水平間的胚性愈傷率差異不顯著(P>0.05)。說(shuō)明基本培養(yǎng)基和2,4-D對(duì)節(jié)節(jié)麥幼胚胚性愈傷組織誘導(dǎo)有很大影響，而碳源的作用并不明顯。

A、B、C分別為處理9、10、11誘導(dǎo)30 d的愈傷組織，D、E、F分別為處理9、10、11分化培養(yǎng)45 d的分化情況

The fig.A,B,C are the callus of treatment 9,10,11 induced for 30 days,respectively;The fig.D,E,F are the callus of treatment 9,10,11 induced for 45 days,respectively

圖1節(jié)節(jié)麥幼胚部分處理的胚性愈傷及愈傷分化

Fig.1Images of embryonic callus and callus differentiation ofAegilopstauschiiimmature embryo for part of treatment

綜合分析影響節(jié)節(jié)麥幼胚愈傷組織分化的各個(gè)因素，從表4可以看出，各因素的重要性依次為 KT>2,4-D>基本培養(yǎng)基>碳源。根據(jù)各因素的最佳水平，初步可以推斷節(jié)節(jié)麥幼胚愈傷分化率最高的組合為：KT濃度為1.0 mg·L-1，2,4-D濃度為3 mg·L-1，MS培養(yǎng)基，碳源是15 mg·L-1蔗糖+15 mg·L-1甘露醇。對(duì)各個(gè)因素進(jìn)行方差分析，結(jié)果顯示KT各水平間愈傷分化率差異達(dá)顯著水平(P<0.05),而2，4-D濃度、基本培養(yǎng)基和碳源的各水平間的愈傷分化率差異不顯著(表4)。表明KT濃度對(duì)節(jié)節(jié)麥幼胚愈傷的分化有很大影響，而2，4-D濃度、基本培養(yǎng)基和碳源的作用不明顯。為尋找各因素相應(yīng)的最佳水平，還需進(jìn)一步對(duì)試驗(yàn)各因素的不同水平進(jìn)行多重比較。

表2　不同處理對(duì)節(jié)節(jié)麥幼胚誘導(dǎo)、分化及再生的影響

“+”表示愈傷組織質(zhì)量差；“+ +”表示愈傷組織質(zhì)量中等；“+++ ”表示愈傷組織質(zhì)量高

“+” shows poor quality of callus; “+ +” shows medium quality of callus; “+++” shows high quality of callus

2.3各試驗(yàn)因素對(duì)節(jié)節(jié)麥幼胚胚性愈傷率的影響

2.3.1基本培養(yǎng)基對(duì)胚性愈傷率的影響

表3結(jié)果表明，在本試驗(yàn)的3個(gè)因素中，基本培養(yǎng)基對(duì)胚性愈傷率影響最顯著。3種培養(yǎng)基中，胚性愈傷率最高的是MS培養(yǎng)基，為74.41%；其次為N6培養(yǎng)基，為63.11%；最后是B5培養(yǎng)基，為54.41%。MS培養(yǎng)基與N6培養(yǎng)基對(duì)應(yīng)的胚性愈傷率之間差異不顯著，但與B5培養(yǎng)基對(duì)應(yīng)的胚性愈傷率之間差異顯著。就愈傷組織質(zhì)量而言，MS培養(yǎng)基的愈傷組織質(zhì)量最高，B5培養(yǎng)基培養(yǎng)基的愈傷組織易長(zhǎng)出毛狀根，質(zhì)量最差。上述結(jié)果表明，在節(jié)節(jié)麥胚性愈傷組織誘導(dǎo)中MS培養(yǎng)基明顯優(yōu)于B5培養(yǎng)基，MS和N6兩種基本培養(yǎng)基均可選用。

2.3.22,4-D濃度對(duì)胚性愈傷率的影響

從表3中可以看出，胚性愈傷率隨2,4-D濃度的升高呈先升高后下降的趨勢(shì)，當(dāng)濃度達(dá)到2 mg·L-1時(shí)，胚性愈傷率達(dá)到最高(75.26%)，而后明顯下降。2,4-D濃度為2 mg·L-1時(shí)，所對(duì)應(yīng)的胚性愈傷率顯著高于濃度為1 mg·L-1和 4 mg·L-1的，但與濃度為3 mg·L-1時(shí)所對(duì)應(yīng)的胚性愈傷率(74.81%)差異不顯著。2,4-D濃度為1 mg·L-1時(shí)，愈傷組織易向分化方向發(fā)展，易長(zhǎng)出毛狀根和實(shí)生芽，導(dǎo)致愈傷組織質(zhì)量下降，而當(dāng)2,4-D濃度達(dá)到4 mg·L-1時(shí)，又會(huì)抑制胚性愈傷組織的形成，并導(dǎo)致所形成的愈傷組織生長(zhǎng)較慢。據(jù)此推斷，節(jié)節(jié)麥幼胚誘導(dǎo)愈傷組織2,4-D的最佳濃度為2 mg·L-1。

2.3.3碳源對(duì)胚性愈傷率的影響

由表3可知，碳源各水平所對(duì)應(yīng)的胚性愈傷率之間的差異未達(dá)到顯著水平。碳源各水平中，胚性愈傷率最高的是30 g·L-1麥芽糖(67.43%)，最低的是15 mg·L-1蔗糖+15 mg·L-1山梨醇(65.73%)。由于四種碳源對(duì)節(jié)節(jié)麥胚性愈傷的誘導(dǎo)差異不顯著，因此四種碳源均可選用。在實(shí)際操作中，為節(jié)省成本，可以直接選用蔗糖作為碳源。

表3　不同因素水平下的胚性愈傷率及水平間的差異顯著性

同行數(shù)據(jù)后不同小寫字母表示0.05水平上差異顯著，不同大寫字母表示0.01水平上差異顯著。表4同

Different lower-case letters in the same line mean differences significant at 0.05 levels,and different upper-case letters mean difference significant at 0.01 levels,respectively.The same as in the table 4

2.4各試驗(yàn)因素對(duì)節(jié)節(jié)麥幼胚愈傷分化率的影響

2.4.1KT濃度對(duì)愈傷分化率的影響

表4結(jié)果表明，本研究的4個(gè)因素中，KT濃度對(duì)節(jié)節(jié)麥愈傷分化率影響最顯著。愈傷分化率隨KT濃度增加而減小，KT濃度為1 mg·L-1時(shí)愈傷分化率最高(33.71%)，當(dāng)濃度增加為1.5 mg·L-1和2 mg·L-1時(shí)愈傷分化率下降為9.27%和6.40%。KT濃度為1 mg·L-1時(shí)與濃度為1.5 mg·L-1和2.0 mg·L-1時(shí)愈傷分化率差異均達(dá)到顯著水平，而KT濃度為1.5 mg·L-1時(shí)與2.0 mg·L-1時(shí)愈傷分化率差異不顯著。因此，分化培養(yǎng)基中KT濃度選用1.0 mg·L-1時(shí)最好。

2.4.22,4-D濃度對(duì)愈傷分化率的影響

從表4中可以看出，愈傷分化率隨2,4-D濃度的升高呈先升高后下降的趨勢(shì)，當(dāng)濃度達(dá)到3 mg·L-1時(shí)，愈傷分化率達(dá)到最高(33.35%)，但2,4-D濃度的四個(gè)水平所對(duì)應(yīng)的愈傷分化率之間并無(wú)顯著差異，結(jié)合2,4-D對(duì)胚性愈傷率的影響，故應(yīng)選用2,4-D的濃度為3 mg·L-1。

2.4.3基本培養(yǎng)基對(duì)愈傷分化率的影響

從表4可知，3種培養(yǎng)基中，愈傷分化率最高的是MS培養(yǎng)基(26.28%)，其次為N6和B5培養(yǎng)基(分別為16.91%和13.62%)，但MS培養(yǎng)基與N6和B5培養(yǎng)基對(duì)應(yīng)的愈傷分化率之間的差異并不顯著，表明在節(jié)節(jié)麥愈傷分化過(guò)程中三種培養(yǎng)基均可選用，結(jié)合基本培養(yǎng)基對(duì)胚性愈傷率的影響，應(yīng)選用MS培養(yǎng)基。

2.4.4碳源對(duì)愈傷分化率的影響

四種碳源對(duì)應(yīng)的愈傷分化率間的差異均未達(dá)到顯著水平，四種碳源中愈傷分化率最高的是15 g·L-1蔗糖+15 g·L-1甘露醇(24.45%)，其次為30 g·L-1蔗糖和30 g·L-1麥芽糖，愈傷分化率最低的是蔗糖+15 g·L-1山梨醇(16.73%)。因此，四種碳源均可選用，為節(jié)約成本，可選用蔗糖作為碳源。

表4　不同因素水平下的愈傷分化率及水平間的差異顯著性

3討 論

多數(shù)研究者認(rèn)為，幼胚具有較高的愈傷組織誘導(dǎo)能力和較強(qiáng)的植株再生能力，是一種最有效最理想的外植體來(lái)源[12]。小麥幼胚高效再生體系的研究主要集中在幼胚基因型選取、培養(yǎng)基類型以及培養(yǎng)基中添加的激素種類和濃度等方面，并取得了一定的進(jìn)展[5-10]。在基本培養(yǎng)基的選擇上，大多數(shù)研究者認(rèn)為MS培養(yǎng)基是適合小麥幼胚愈傷組織誘導(dǎo)的培養(yǎng)基，但王新國(guó)等[13]對(duì)小麥幼胚離體培養(yǎng)的研究發(fā)現(xiàn),在MS、N6B5MS、B5和L3 這4 種培養(yǎng)基中，L3 培養(yǎng)基的出愈率及分化率最高。本研究選用MS、N6和B5三種基本培養(yǎng)基，發(fā)現(xiàn)在節(jié)節(jié)麥幼胚誘導(dǎo)愈傷過(guò)程中不同基本培養(yǎng)基對(duì)胚性愈傷率的影響程度最大，MS培養(yǎng)基不但愈傷質(zhì)量最高而且出愈率和胚性愈傷率均最高，其次為N6培養(yǎng)基， B5培養(yǎng)基在愈傷誘導(dǎo)過(guò)程中愈傷塊易長(zhǎng)出一些毛狀根，從而降低了愈傷質(zhì)量，因此節(jié)節(jié)麥幼胚培養(yǎng)適宜選用MS培養(yǎng)基。本研究結(jié)果與大部分同類研究相似。在節(jié)節(jié)麥愈傷分化過(guò)程中，MS培養(yǎng)基對(duì)應(yīng)的愈傷分化率最高，但不同基本培養(yǎng)基對(duì)應(yīng)的愈傷分化率之間差異并不顯著。

植物激素是培養(yǎng)基中的關(guān)鍵成分之一，其中，2,4-D和KT分別是小麥幼胚愈傷組織誘導(dǎo)和分化階段常用的激素。多數(shù)研究者認(rèn)為，在幼胚培養(yǎng)中2,4-D的適宜用量為2.0 mg·L-1[14-15]。KT的作用是促使細(xì)胞分裂，同時(shí)使得分裂朝著器官分化的方向進(jìn)行，不同濃度的KT對(duì)小麥幼胚分化有較大影響。本研究結(jié)果表明，2,4-D對(duì)節(jié)節(jié)麥胚性愈傷的誘導(dǎo)影響十分顯著，但不同濃度2,4-D對(duì)愈傷分化率影響并不顯著。胚性愈傷率和愈傷分化率隨2,4-D濃度的增加呈單峰曲線變化，胚性愈傷率最高時(shí)的2,4-D濃度為2 mg·L-1，愈傷分化率最高的2,4-D濃度為3 mg·L-1，這與在普通小麥中的研究結(jié)果相似[16-18]。最高的胚性愈傷率和愈傷分化率所對(duì)應(yīng)的2,4-D濃度不同，其原因可能是由于節(jié)節(jié)麥幼胚在愈傷誘導(dǎo)過(guò)程中易長(zhǎng)實(shí)生芽，適當(dāng)提高2,4-D濃度有利于抑制實(shí)生芽的生成，提高愈傷組織的質(zhì)量，從而提高愈傷分化率。因此，為提高節(jié)節(jié)麥幼胚再生率2,4-D濃度宜選用3 mg·L-1。在節(jié)節(jié)麥愈傷分化的研究中，KT對(duì)節(jié)節(jié)麥愈傷分化率影響最顯著，愈傷分化率隨KT濃度增加而減小，KT濃度為1 mg·L-1時(shí)愈傷分化率最高，且與濃度為1.5 mg·L-1和2.0 mg·L-1時(shí)愈傷分化率差異均達(dá)到顯著水平。因此，分化培養(yǎng)基中KT濃度宜選用1.0 mg·L-1。

碳源不僅提供愈傷組織生長(zhǎng)所需的能量，還起到調(diào)節(jié)培養(yǎng)基滲透壓的作用。范學(xué)科等[12]在小麥幼胚愈傷組織誘導(dǎo)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，將蔗糖濃度從30 g·L-1降為15 g·L-1，同時(shí)加入15 g·L-1的甘露醇或山梨醇，能明顯改善愈傷組織生長(zhǎng)狀態(tài)。本試驗(yàn)以30 g·L-1麥芽糖為碳源，胚性愈傷率要高于另外3種碳源，這與Francisco[19]的研究結(jié)果相同；以15 g·L-1蔗糖+15 g·L-1甘露醇為碳源時(shí)，愈傷分化率高于另外3種碳源，但四種碳源之間不論是胚性愈傷率還是愈傷分化率差異都不顯著。因此在碳源的選擇上可以直接選用30 g·L-1蔗糖。

本試驗(yàn)所研究的16個(gè)處理中，節(jié)節(jié)麥幼胚培養(yǎng)最佳體系為第9個(gè)處理，即誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基+ 3.0 mg·L-12,4-D+30 g·L-1麥芽糖，分化培養(yǎng)基為：MS培養(yǎng)基+30 g·L-1麥芽糖+1.0 mg·L-1KT 。而通過(guò)正交設(shè)計(jì)的計(jì)算結(jié)果，推算出的最佳組合為誘導(dǎo)培養(yǎng)基：MS培養(yǎng)基+3.0 mg·L-12,4-D+15 g·L-1蔗糖+15 g·L-1甘露醇；分化培養(yǎng)基：MS培養(yǎng)基+15 g·L-1蔗糖+15 g·L-1甘露醇+ 1.0 mg·L-1KT。兩個(gè)培養(yǎng)體系之所以有差異是因?yàn)楸驹囼?yàn)所研究的16個(gè)處理是4因素完全正交所對(duì)應(yīng)的144個(gè)處理中的一小部分，因此，經(jīng)推論所得出的結(jié)果才是理論上所有處理中最優(yōu)的節(jié)節(jié)麥再生體系。

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Establishment of Regeneration System for Immature Embryo ofAegilopstauschii

XU Feng,LI Chunlian,LI Yang,CHAI Guaiqiang,WANG Zhonghua

(Northwest A&F University,College of Agronomy,Yangling,Shaanxi 712100,China)

Abstract:Establishment of a high efficient regeneration system for immature embryo (IEs) of Aegilops tauschii will provide a convenient tool for tissue culture and transformation,thereby facilitating the transformation of foreign genes into wheat. By using the IEs derived from an elite Ae.tauschii ssp. strangulata accession AW1,the effects of some factors,including basal medium,carbon sources,two auxins,2,4-Dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D) and 6-Furfurylaminopurine (KT),on callus induction and plant regeneration were evaluated. The results indicated that MS basal medium significantly affects the callus induction and differentiation of Ae.tauschii IEs. The concentration of 2,4-D has a significant effect on the capacity of embryogenic callus. The media supplemented with 3.0 mg·L-12,4-D led to the induction of most high-quality embryogenic calli with pale,smooth,and compact nodules. KT played an important role in IEs differentiation. There is no significant difference among the basal medium,2,4-D and carbon source for IEs differentiation. The differences of the effects of carbon source on embryogenic callus induction and differentiation of IEs are not significant and 30 g·L-1sucrose is optimal in practice for cost saving. Overall,culture system of MS+15 g·L-1sucrose+15 g·L-1mannitol +3.0 mg·L-12,4-D is optimal for embryogenic callus induction and culture system of MS+15 g·L-1sucrose+15 g·L-1mannitol is optimal for plant regeneration of Ae.tauschii IEs.

Key words:Aegilops tauschii; Immature embryo culture; Callus induction; Plant regeneration

中圖分類號(hào)：S512.1；S330

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1009-1041(2016)02-0150-07

通訊作者：王中華(E-mail：zhonghuawang@nwsuaf.edu.cn)

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31271794)

收稿日期：2015-10-30修回日期：2015-11-15

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：2016-01-26

網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1359.S.20160126.1944.008.html

第一作者E-mail：xufeng100201@163.com