朱 琳，王佳真，師令智，任志寬，李 星，劉大群

(河北省農(nóng)作物病蟲(chóng)害生物防治工程技術(shù)研究中心,河北農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院,河北保定 071001)

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小麥品種濰麥8號(hào)2AS染色體上的抗葉銹病QTL定位

朱 琳，王佳真，師令智，任志寬，李 星，劉大群

(河北省農(nóng)作物病蟲(chóng)害生物防治工程技術(shù)研究中心,河北農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院,河北保定 071001)

摘要：為了解小麥品種濰麥8號(hào)抗葉銹基因在染色體上的位置，利用EST標(biāo)記對(duì)濰麥8號(hào)2AS染色體上的抗葉銹病QTL進(jìn)行檢測(cè)和分子作圖。2011-2013年，對(duì)抗病品種濰麥8號(hào)×感病品種鄭州5389雜交得到的179個(gè)F2:3家系及其親本進(jìn)行成株期抗葉銹病鑒定，得到表型數(shù)據(jù)。前期研究已利用SSR標(biāo)記在濰麥8號(hào)2AS染色體上檢測(cè)到一個(gè)主效QTL，為了尋找與該QTL距離更近的標(biāo)記，本試驗(yàn)通過(guò)35個(gè)位于2AS染色體上的EST標(biāo)記檢測(cè)親本及其F2:3家系，結(jié)果表明，4個(gè)EST標(biāo)記與抗葉銹病QTL連鎖，該QTL位點(diǎn)被定位在BE444541和CD452782之間，區(qū)間距離為11.3 cM，3年解釋的遺傳變異分別為63.59%、62.48%和62.43%。

關(guān)鍵詞：小麥；葉銹病；EST標(biāo)記；QTL作圖

小麥葉銹病是由葉銹菌(Puccinia triticina)侵染引起的真菌性病害，對(duì)我國(guó)小麥生產(chǎn)具有嚴(yán)重危害。該病害直接為害小麥葉片，通過(guò)影響其光合作用，導(dǎo)致小麥產(chǎn)量和品質(zhì)下降，造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。應(yīng)用抗病品種和提高小麥品種的抗病性是防治小麥葉銹病最重要的途徑。

表達(dá)序列標(biāo)簽(Expression sequenee tag，EST)，是將mRNA轉(zhuǎn)錄為cDNA并克隆到載體構(gòu)建cDNA文庫(kù)，然后大規(guī)模隨機(jī)挑選cDNA克隆，對(duì)其5′或3′端進(jìn)行一步法測(cè)序，通過(guò)將所獲序列與已知基因庫(kù)序列進(jìn)行比較，獲得對(duì)生物體生長(zhǎng)發(fā)育、繁殖分化、遺傳變異和衰老死亡等生命過(guò)程認(rèn)識(shí)的技術(shù)[1]。由于EST序列是基因的一部分，因此其多態(tài)性與功能直接相關(guān)。其次，EST標(biāo)記資源豐富，成本低廉，可用于進(jìn)行大量目的基因的篩選，特別適合數(shù)量性狀位點(diǎn)的比較[2]。

小麥數(shù)量性狀位點(diǎn)(Quantitative trait loci，QTL)控制數(shù)量性狀基因，一般在小麥成株期對(duì)葉銹病表現(xiàn)非小種專(zhuān)化抗性，因此又叫成株抗性(adult-plant resistance，APR)或慢病性。慢病性受多基因控制[3-5]，表現(xiàn)為數(shù)量性狀和持久抗病性。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的慢葉銹性基因有 Lr34[6]、 Lr46[7]、 Lr67[8]、 Lr68[9]，在田間均表現(xiàn)出良好的抗性。但目前發(fā)現(xiàn)的小麥抗葉銹QTL僅有80多個(gè)，主要集中在1BS、1BL、2BS、6BS、7BL上[10]，所以有必要開(kāi)發(fā)更多更有效的QTL及其相關(guān)分子標(biāo)記。

濰麥8號(hào)是由山東濰坊市農(nóng)科院作物所以88-3149為母本、以Aus621108為父本經(jīng)過(guò)有性雜交選育成的小麥新品種。該品種綜合農(nóng)藝性狀良好，同時(shí)高抗白粉病和葉銹病，是一個(gè)良好的小麥抗葉銹性資源[11]。本實(shí)驗(yàn)室前期研究中利用SSR引物對(duì)淮麥8號(hào)抗葉銹QTL進(jìn)行了定位，發(fā)現(xiàn)在2AS染色體上存在一個(gè)主效QTL[12]。為了篩選與該位點(diǎn)距離更近的標(biāo)記，本研究通過(guò)EST標(biāo)記對(duì)濰麥8號(hào)品種2AS染色體上的抗葉銹QTL進(jìn)行分子作圖，以期為利用濰麥8號(hào)培育抗葉銹病小麥新品種提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1小麥材料和葉銹菌菌種

供試小麥材料為抗病親本濰麥8號(hào)和感病親本鄭州5389及其雜交獲得的179個(gè)F2:3家系。供試葉銹菌生理小種為T(mén)HTT、THTS和THTQ，用于小麥成株期田間的接種鑒定。以上材料均由河北農(nóng)業(yè)大學(xué)植物免疫研究室提供。

1.2小麥成株期葉銹病田間嚴(yán)重度調(diào)查

2010-2012年連續(xù)3年11月初在河北農(nóng)業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)田采用條播法種植，行長(zhǎng)1.5 m，每行種50粒，行距25 cm。每10行種植1行對(duì)照(感病品種鄭州5389)，在與試驗(yàn)材料垂直的方向種植誘發(fā)行(感病品種鄭州5389)。在每年的小麥分蘗階段(保定地區(qū)每年在四月中旬)將等量葉銹菌生理小種THTT、THTS和THTQ混合，配置成0.05%吐溫20孢子懸浮液，噴施于誘發(fā)行。接種后用塑料薄膜覆蓋，隔夜保濕15 h左右后去除薄膜。在進(jìn)行田間鑒定前要注意澆水，保證田間微氣候濕潤(rùn)，為發(fā)病創(chuàng)造適宜條件。待鄭州5389發(fā)病嚴(yán)重度達(dá)到50%以上時(shí)(即葉銹菌面積占葉片面積比例50%以上)，進(jìn)行田間第一次鑒定，之后每周鑒定一次，直到鄭州5389發(fā)病嚴(yán)重度達(dá)到100%、群體發(fā)病嚴(yán)重度達(dá)到最大，此時(shí)所達(dá)到的嚴(yán)重度稱(chēng)為最終嚴(yán)重度(Final disease severity，F(xiàn)DS)，用作最終QTL分析的表型數(shù)據(jù)。

1.3抗感小群體的建立

選取最終嚴(yán)重度最低及最高的家系各5個(gè)，分別作為抗病和感病小群體，用于后續(xù)篩選EST標(biāo)記。

1.4小麥DNA的提取及PCR擴(kuò)增

參照Sharp等[13]的CTAB法提取小麥幼嫩葉片的DNA，略作改進(jìn)。10 μL PCR反應(yīng)體系中分別加入模板DNA (30 ng·μL-1) 1 μL，10× PCR buffer (含MgCl2) 1 μL，dNTP (10 mmol·L-1) 0.2 μL，引物(4 μmol·L-1)1 μL，10 U·μL-1TaqDNA聚合酶0.1 μL，超純水6.7 μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性5 min；然后94 ℃變性45 s，55 ℃(根據(jù)不同引物略有變化)退火45 s，72 ℃延伸1 min，共進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min。4 ℃保存PCR產(chǎn)物。10%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)。電泳后的凝膠參照Bassam等[14]的方法銀染檢測(cè)，記錄結(jié)果。

1.5EST分子標(biāo)記的篩選

本實(shí)驗(yàn)室前期研究已利用SSR標(biāo)記在濰麥8號(hào)2AS染色體檢測(cè)到一個(gè)主效QTL[12]，為了尋找與此QTL距離更近的分子標(biāo)記，因此用分布在2AS染色體上的35對(duì)EST引物進(jìn)一步篩選親本和抗感小群體是否存在多態(tài)性，并利用多態(tài)性引物對(duì)群體進(jìn)行篩選。EST引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.6QTL連鎖圖譜構(gòu)建

用篩選出來(lái)的分子標(biāo)記檢測(cè)179個(gè)F2:3家系，PCR擴(kuò)增帶型結(jié)合表型數(shù)據(jù)進(jìn)行連鎖分析，通過(guò)Map Manager QTXb20軟件構(gòu)建遺傳連鎖圖譜。用QTL Icimapping 3.2做QTL檢測(cè)，LOD閾值設(shè)為2.5。

2結(jié)果與分析

2.1濰麥8號(hào)田間抗病性鑒定結(jié)果

2011-2013連續(xù)3年在田間對(duì)濰麥8號(hào)和鄭州5389及其F2:3代家系抗葉銹病表型數(shù)據(jù)進(jìn)行鑒定，得出3年的最終嚴(yán)重度分布數(shù)據(jù)(圖1)。在感病親本鄭州5389發(fā)病嚴(yán)重度達(dá)到100%時(shí)，濰麥8號(hào)連續(xù)3年的最終嚴(yán)重度均為10%。F2:3代家系的最終嚴(yán)重度呈連續(xù)分布，符合數(shù)量性狀遺傳特點(diǎn)，說(shuō)明濰麥8號(hào)中可能存在若干控制小麥抗葉銹病的QTL位點(diǎn)。由于小麥成株抗性與環(huán)境相關(guān)，田間調(diào)查數(shù)據(jù)顯示，在2011年和2013年，各家系最終嚴(yán)重度的分布趨勢(shì)相近，而與2012年各家系最終嚴(yán)重度的分布趨勢(shì)不同；比較各年份間田間表型數(shù)據(jù)可知，2012年整體發(fā)病較嚴(yán)重。

圖1　濰麥8號(hào)×鄭州5389及其179個(gè)F2:3家系葉銹病三年最終嚴(yán)重度的分布

2.2標(biāo)記篩選結(jié)果

用小麥2AS染色體上的35對(duì)EST引物對(duì)抗感親本和抗感小群體進(jìn)行篩選，其中有4對(duì)引物可以擴(kuò)增出多態(tài)性片段，可以推斷這4對(duì)引物可能與位于2AS染色體上的數(shù)量性狀位點(diǎn)相關(guān)聯(lián)。4對(duì)EST引物分別為：BE444659_cp (上游5′-TAA GGAGGCAATTGACAGGG-3′,下游5′-GCA AACTCCACAGCCTCTTC-3′)、BE444541_cp(上游5′-CTTAGGAGTACCCCTTGGGC-3′,下游5′-GCAAATGAAGAAGCGTGTGA-3′)、CD452782_cp (上游5′-TCACACCTTCCCCAAGTTTC-3′,下游5′-TCACACGCTTCTTCATTTGC-3′)、BE405597_cp (上游5′-GTGTTTTCACTGGC AAGCAA-3′,下游5′-GCCTATTAGTCGCAGC AAGG-3′)。它們均在抗病親本與感病親本中擴(kuò)增出特異性帶(圖2)。用這4對(duì)引物繼續(xù)對(duì)179個(gè)F2:3代家系進(jìn)行篩選，發(fā)現(xiàn)引物BE405597_cp在群體中多態(tài)性不穩(wěn)定，個(gè)別家系出現(xiàn)帶型與表型不吻合的現(xiàn)象，其余三對(duì)引物在群體中多態(tài)性表現(xiàn)較穩(wěn)定。

M：DL 2000 Marker；P1：抗病親本濰麥8號(hào)；P2：感病親本鄭州5389；R:抗病單株；S：感病單株；箭頭指示特異性條帶

M: DL 2000 Marker; P1: Resistant parent Weimai 8; P2: Susceptible parent Zhengzhou 5389; R: Resistant individual; S: Susceptible individual;Arrows indicate specific bands

圖2引物BE444659_cp在抗感小群體中的PCR擴(kuò)增

Fig.2PCR amplification with primer BE444659_cp

in resistant and susceptible plants

2.3QTL連鎖圖譜

根據(jù)濰麥8號(hào)和鄭州5389雜交所得的179個(gè)F2:3家系連續(xù)三年的田間鑒定表型數(shù)據(jù)進(jìn)行EST標(biāo)記篩選，利用分析軟件Map Manager QTXb20和QTL Icimapping 3.2進(jìn)行結(jié)果分析，最終在小麥2AS染色體上檢測(cè)到1個(gè)控制成株抗葉銹的QTL位點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)3個(gè)分子標(biāo)記與濰麥8號(hào)抗葉銹QTL連鎖，分別為BE444659、BE444541和CD452782(圖3)。三個(gè)標(biāo)記的區(qū)間距離為11.3 cM，該位點(diǎn)在連續(xù)三年的田間鑒定中解釋的遺傳變異分別為63.59%、62.48%和62.43%(表1)。距離該QTL最近的兩個(gè)位點(diǎn)為CD452782和BE444659，距離為7.1 cM。

圖3　2AS染色體上控制小麥成株抗葉銹QTL的位置

年份Year染色體Chromosome左標(biāo)記Lefemarker右標(biāo)記RightmarkerLOD值LODscore加性效應(yīng)Additive顯性效應(yīng)Dominate貢獻(xiàn)率Var./%20112ASCD452782BE44465925.2934.010.0063.5920122ASCD452782BE44465928.9835.660.0062.4820132ASCD452782BE44465927.0434.830.0062.43

3討 論

本研究通過(guò)EST標(biāo)記對(duì)小麥品種濰麥8號(hào)2AS染色體上一個(gè)QTL進(jìn)行了定位，但在結(jié)果中發(fā)現(xiàn)個(gè)別EST引物在F2:3代家系中多態(tài)性不穩(wěn)定。為了提高EST標(biāo)記的多態(tài)性，可以對(duì)無(wú)多態(tài)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行酶切，以揭示剪切擴(kuò)增多態(tài)性(Cleavage Amplified Polymorphism，CAP)；或改進(jìn)對(duì)PCR產(chǎn)物的分析手段，如采用分辨率較高的變性梯度膠分離PCR產(chǎn)物，提高多態(tài)檢測(cè)率[15]。

通過(guò)Map Manager QTXb20軟件構(gòu)建遺傳連鎖圖譜，用QTL Icimapping 3.2進(jìn)行結(jié)果分析，QTL被定位在BE444659和CD452782之間,區(qū)間距離為7.1 cM，三年解釋的遺傳變異分別為63.59%、62.48%和62.43%，從而證實(shí)此QTL位點(diǎn)可信度較高，并且效應(yīng)較大。

成株抗病性由多個(gè)數(shù)量性狀位點(diǎn)控制，相對(duì)于小種專(zhuān)化抗性具有抗病持久的優(yōu)點(diǎn)，此外由于成株抗病性QTL具有一因多效的特點(diǎn)，加強(qiáng)對(duì)慢病性基因的合理利用有利于同時(shí)防治小麥白粉、條銹等多種病害[16]。本實(shí)驗(yàn)在2AS染色體上檢測(cè)出一個(gè)QTL，且具有較大效應(yīng)，對(duì)存在于其他染色體上的QTL還需要通過(guò)SSR、EST等進(jìn)行進(jìn)一步檢測(cè)。目前，位于2AS染色體上已知的小麥抗葉銹基因有 Lr37[17]，該基因來(lái)源于偏凸山羊草(Aegilopsventricosa)2N染色體，表現(xiàn)出優(yōu)異的成株抗性。 Lr37基因與抗條銹基因 Yr17和抗桿銹基因 Sr38緊密連鎖， Lr37-Yr17-Sr38連鎖群被Helguera等[18]運(yùn)用RFLP標(biāo)記 cmwg682定位在2AS上10 cM左右。根據(jù)2004年Somers等[19]繪制的得到國(guó)際公認(rèn)的面包小麥高密度SSR標(biāo)記圖譜可知，本實(shí)驗(yàn)在淮麥8號(hào)中發(fā)現(xiàn)的QTL位點(diǎn)被定位在2A染色體短臂末端，與 Lr37存在一定距離。 Lr37與本實(shí)驗(yàn)標(biāo)記的QTL之間的關(guān)系還需要進(jìn)一步通過(guò)高通量SNP分子標(biāo)記進(jìn)行驗(yàn)證。

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QTL Mapping of Leaf Rust Resistance in 2AS Chromosomal of the Wheat Cultivar Weimai 8

ZHU Lin,WANG Jiazhen,SHI Lingzhi,REN Zhikuan,LI Xing,LIU Daqun

(Biological Control Center of Plant Diseases and Pests of Hebei Province,College of Plant Protection,Agricultural University of Hebei,Baoding，Hebei 071001,China)

Abstract:To understand the chromosomal position of leaf rust resistance genes in Chinese wheat cultivar Weimai 8,molecular mapping of the leaf rust resistance loci was conducted using EST markers in this study. In 2011-2013,179 F2:3lines derived from the cross of Weimai 8 × Zhengzhou 5389 and the parents to obtain the phenotypic data on their reactions to leaf rust at the adult plant stage. A major effective QTL on chromosome 2AS of Weimai 8 has been found using SSR markers.In order to find closer markers of the QTL,thirty-five EST markers located on chromosome 2AS were screened between the parents and F2:3lines. The results indicated that four EST markers linked to the QTL for leaf rust resistance were identified,which was located between markers BE444541 and CD452782,with an interval distance of 11.3 cM. This QTL explained 63.59%,62.48% and 62.43% of the phenotypic variations in the three years tests,respectively.

Key words:Wheat; Leaf rust; EST marker; QTL mapping

中圖分類(lèi)號(hào)：S512.1；S330

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1009-1041(2016)02-0145-05

通訊作者：李 星(E-mail: lixing@hebau.edu.cn)；劉大群(E-mail: ldq@hebau.edu.cn)

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金國(guó)際(地區(qū))合作與交流項(xiàng)目(31361140367)；高等學(xué)校博士學(xué)科點(diǎn)專(zhuān)項(xiàng)科研基金聯(lián)合資助課題(20131302120004)；植物病蟲(chóng)害生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開(kāi)放基金資助課題(SKLOF201513)；河北省引進(jìn)留學(xué)人員資助項(xiàng)目(C2015003033)

收稿日期：2015-09-14修回日期：2015-11-25

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：2016-01-26

網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1359.S.20160126.1944.006.html

第一作者E-mail: ezzhulin@sina.com(朱 琳)；858189486@qq.com(王佳真,并列第一作者)