王欣慧，許可欣

(南京醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，江蘇南京 210011)

?

產(chǎn)AmpC酶大腸埃希菌的檢測(cè)及耐藥分析

王欣慧，許可欣△

(南京醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，江蘇南京 210011)

摘要:目的檢測(cè)臨床分離細(xì)菌中大腸埃希菌的AmpC β-內(nèi)酰胺酶(簡(jiǎn)稱AmpC酶)及其耐藥情況。方法收集臨床上藥敏試驗(yàn)頭孢西丁抑菌圈直徑≤18 mm的大腸埃希菌299株，三維試驗(yàn)篩選產(chǎn)AmpC酶大腸埃希菌，多重PCR擴(kuò)增產(chǎn)AmpC酶的基因。最低抑菌濃度法檢測(cè)抗菌藥物的敏感性。結(jié)果AmpC酶初篩試驗(yàn)陽(yáng)性的299株大腸埃希菌中，56株(18.73%)三維試驗(yàn)篩選陽(yáng)性，多重PCR試驗(yàn)陽(yáng)性共34株，其中DHA群的有14株，CIT群的有20株。結(jié)論大腸埃希菌臨床菌株中AmpC酶仍有較高的分離率，本研究中以DHA群和CIT群為主，并且耐藥情況越來(lái)越嚴(yán)重。

關(guān)鍵詞:大腸埃希菌;AmpC β-內(nèi)酰胺酶;ampC

大腸埃希菌的分離率始終最高，從近年我國(guó)發(fā)布的耐藥監(jiān)控?cái)?shù)據(jù)分析來(lái)看，其耐藥率也逐年增加[1-3]。細(xì)菌因產(chǎn)生各種β-內(nèi)酰胺酶導(dǎo)致的耐藥現(xiàn)象隨著β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物的廣泛應(yīng)用日趨嚴(yán)重，酶的水解作用已成為耐藥增加的一個(gè)重要原因，尤其以產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(ESBLs)、AmpC酶β-內(nèi)酰胺酶(AmpC酶)最為常見(jiàn)。其中AmpC酶已是腸桿菌科細(xì)菌對(duì)β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物產(chǎn)生多重耐藥的重要原因之一[4]。AmpC酶的產(chǎn)生使細(xì)菌對(duì)包括青霉素和除頭孢匹羅和頭孢吡肟以外幾乎全部的頭孢菌素類藥物產(chǎn)生耐藥，另有報(bào)道，由于伴有ESBLs，產(chǎn)AmpC酶的大腸埃希菌出現(xiàn)了對(duì)廣譜頭孢菌素的耐藥性[5]。種間傳播性是質(zhì)粒介導(dǎo)的AmpC酶具有的特征，不論其在細(xì)菌耐藥機(jī)制還是在院內(nèi)感染方面都有重要的意義。目前，對(duì)于AmpC酶產(chǎn)生耐藥的檢測(cè)仍然沒(méi)有方法學(xué)的臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)(CLSI)指導(dǎo)標(biāo)準(zhǔn)[6]，臨床常規(guī)檢測(cè)項(xiàng)目中也沒(méi)有對(duì)產(chǎn)AmpC酶的大腸埃希菌檢測(cè)。因此，筆者對(duì)臨床菌株產(chǎn)AmpC酶的情況及其耐藥情況用進(jìn)行了調(diào)查和分析，旨在為相關(guān)研究提供參考。

1材料與方法

1.1菌株從臨床痰、尿等標(biāo)本中分離得到且篩選出頭孢西丁抑菌圈直徑小于等于18 mm 299株，無(wú)重復(fù)的菌株。用大腸埃希菌ATCC 25922作為產(chǎn)AmpC酶的陰性對(duì)照株，以產(chǎn)AmpC酶陰溝腸桿菌(029M)作為產(chǎn)AmpC酶的陽(yáng)性對(duì)照株。

1.2儀器與試劑試驗(yàn)藥敏紙片購(gòu)自O(shè)xoid公司；藥敏試驗(yàn)板購(gòu)自上海復(fù)星佰珞生物技術(shù)有限公司，PCR擴(kuò)增試劑盒購(gòu)自大連寶生物工程有限公司；引物合成于上海生工生物公司。使用的儀器包括微生物鑒定藥敏系統(tǒng)、Mastercycle梯度PCR儀、 Tanon Eps100電泳儀、凝膠成像儀、高速離心機(jī)、加熱儀器、37 ℃孵箱。

1.3方法

1.3.1AmpC酶的初篩試驗(yàn)用微生物鑒定藥敏系統(tǒng)對(duì)菌株進(jìn)行鑒定，篩選出頭孢西丁抑菌圈直徑≤18 mm的大腸埃希菌。

1.3.2三維試驗(yàn)篩選反復(fù)凍融提取酶粗提物，大腸埃希菌 ATCC 25922菌液涂布M-H瓊脂培養(yǎng)基，將頭孢西丁紙片貼在培養(yǎng)基中心，沿紙片邊緣向外劃線加入酶粗提物，35 ℃孵育16～18 h[7]。

1.3.3多重PCR方法檢測(cè)AmpC酶加熱裂解方法提取細(xì)菌DNA，配制PCR的反應(yīng)體系共50ul，分群特異性的引物6對(duì)[8]，見(jiàn)表1。多重PCR的反應(yīng)條件是94 ℃ 3 min，94 ℃ 30 s，64 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，72 ℃ 7 min。

表1　　PCR引物序列及擴(kuò)增片段長(zhǎng)度

1.3.4微量肉湯稀釋法按照CLSI推薦使用MIC法檢測(cè)待檢大腸埃希菌對(duì)抗菌藥物的敏感性。稀釋后菌液順次加入含有不同濃度藥物的96孔板中，設(shè)有陽(yáng)性和陰性對(duì)照孔。37 ℃培養(yǎng)20～22 h進(jìn)行結(jié)果觀察。

2結(jié)果

2.1三維試驗(yàn)對(duì)初篩試驗(yàn)陽(yáng)性的菌株進(jìn)行三維試驗(yàn)，得到三維試驗(yàn)陽(yáng)性共56株，其陽(yáng)性率為18.73%(56/299),見(jiàn)圖1。

1、2:三維試驗(yàn)陰性；3:為三維試驗(yàn)陽(yáng)性。

圖1三維試驗(yàn)結(jié)果

2.2多重PCR試驗(yàn)對(duì)三維試驗(yàn)陽(yáng)性的大腸埃希菌進(jìn)行多重PCR試驗(yàn)，多重PCR試驗(yàn)陽(yáng)性共34株，其中DHA群的有14株，CIT群的有20株，見(jiàn)圖2。

1、2、5:DHA群；3、4:CIT群。

圖2多重PCR試驗(yàn)結(jié)果圖

2.3MIC法藥物敏感試驗(yàn)篩選出的34株大腸埃希菌的MIC法藥物敏感試驗(yàn)結(jié)果，見(jiàn)圖3(見(jiàn)《國(guó)際檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志》網(wǎng)站主頁(yè)“論文附件”)，這些大腸埃希菌對(duì)AMP、KZ、CXM、CTX的耐藥率均為100%，對(duì)FEP的耐藥率高達(dá)58.8%,另外對(duì)CIP、PRL和CAZ的耐藥率分別高達(dá)91.2%、94.1%和97.1%和，對(duì)AK的耐藥率為23.5%，而對(duì)碳青霉烯類抗菌藥物如MEM和IPM耐藥率相對(duì)較低分別為8.8%和11.8%。

3討論

大腸埃希菌為臨床分離革蘭陰性桿菌引起感染中最常見(jiàn)，可見(jiàn)于泌尿道、傷口、呼吸道、膽道和腦膜等部位，隨著抗菌藥物在臨床的廣泛應(yīng)用耐藥現(xiàn)象不斷增加[9]。各種因β-內(nèi)酰胺酶引起的耐藥中AmpC酶已成為腸桿菌科細(xì)菌對(duì)β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物產(chǎn)生多重耐藥的重要原因之一。

目前國(guó)際上檢測(cè)AmpC酶的方法有很多，三維試驗(yàn)是公認(rèn)可以使用的方法，本研究三維試驗(yàn)陽(yáng)性率為18.73%(56/299)。質(zhì)粒介導(dǎo)的AmpC酶至少被歸為CIT、DHA、MOX、EBC、FOX和ACC六個(gè)主要群，本研究中以DHA群和CIT群為主，可見(jiàn)DHA群和CIT群是臨床中產(chǎn)AmpC酶大腸埃希菌的常見(jiàn)基因型。

通過(guò)對(duì)篩選出的34株產(chǎn)AmpC酶大腸埃希菌進(jìn)行藥物敏感試驗(yàn)，得出一、二、三代頭孢中這些產(chǎn)AmpC酶大腸埃希菌均有高的耐藥率，這也與AmpC酶可水解第一、二、三代頭孢菌素的報(bào)道一致[10]。另外，對(duì)AMP、PRL和CIP的耐藥率也分別高達(dá)100%、94.1%和91.2%。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示一直對(duì)產(chǎn)AmpC酶的大腸埃希菌有高敏感率的四代頭孢如FEP的耐藥率竟然高達(dá)58.8%。當(dāng)前因產(chǎn)生AmpC酶而出現(xiàn)對(duì)一代、二代和三代頭孢耐藥的感染性疾病治療最為有效的抗菌藥物是碳青霉烯類抗菌藥物如IPM和MEM，耐藥率相對(duì)較低分別為11.8%和8.8%?？梢?jiàn)，治療因產(chǎn)AmpC酶的細(xì)菌引起的感染性疾病中可用抗菌藥物的選擇范圍變得非常小，要控制抗生素使用和加強(qiáng)產(chǎn)酶菌監(jiān)測(cè)，否則一旦繼續(xù)濫用抗菌藥物就會(huì)出現(xiàn)無(wú)藥可用。

伴著細(xì)菌出現(xiàn)高耐藥率，一方面揭示了細(xì)菌的耐藥性正在增強(qiáng)，這樣發(fā)展下去，對(duì)感染性疾病的治療極可能無(wú)藥可用；另一方面，雖然AmpC酶被認(rèn)為是革蘭陰性細(xì)菌尤其是腸桿菌科細(xì)菌產(chǎn)生耐藥的重要機(jī)制，但隨著更深入的研究發(fā)現(xiàn)膜通透性降低、泵外排作用和青霉素結(jié)合蛋白的改變等機(jī)制在細(xì)菌產(chǎn)生耐藥過(guò)程中也起著至關(guān)重要的作用，同時(shí)，也正是存在各種機(jī)制的協(xié)同作用導(dǎo)致了耐藥現(xiàn)象更為嚴(yán)重。

參考文獻(xiàn)

[1]梅亞寧,童明慶.2011年度衛(wèi)生部全國(guó)細(xì)菌耐藥監(jiān)測(cè)網(wǎng)報(bào)告:成年患者分離菌的耐藥監(jiān)測(cè)[J].中國(guó)臨床藥理學(xué)雜志,2014,2(30):94-99.

[2]汪復(fù),朱德妹,胡付品,等.2012年中國(guó)CHINET細(xì)菌耐藥性監(jiān)測(cè)[J].中國(guó)感染與化療雜志,2013,5(13):321-330.

[3]胡付品,朱德妹,汪復(fù),等.2013年中國(guó)CHINET細(xì)菌耐藥性監(jiān)測(cè)[J].中國(guó)感染與化療雜志,2014,5(14):365-374.

[4]Nedbalcova K,Nechvatalova K,Pokludova L,et al.Resistance to selected beta-lactam antibiotics[J].Cell Mol Life Sci,2014,171 (3/4):328-336.

[5]Mammeri H,Nazic H,Naas T,et al.AmpC beta-lactamase in an Escherichia coli clinical isolate confers resistance to expanded-spectrum cephalosporins[J].Antimicrob Agents Chemother,2004,48(10):4050-4053.

[6]Roche C,Boo TW,Walsh F,et al.Detection and molecular characterisation of plasmidic AmpC beta-lactamases in Klebsiella pneumoniae isolates from a tertiary-care hospital in Dublin,Ireland[J].Clin Microbiol Infect,2008,14(6):616-618.

[7]Coudron PE,Moland ES,Thomson KS.Occurrence and detection of AmpC beta-lactamases among Escherichia coli,Klebsiella pneumoniae,and Proteus mirabilis isolates at a veterans medical center[J].J Clin Microbiol,2000,38(5):1791-1796.

[8] Hussain M,Hasan F,Shah AA,et al.Prevalence of class A and AmpC beta-lactamases in clinical Escherichia coli isolates from Pakistan Institute of Medical Science,Islamabad,Pakistan[J].Jpn J Infect Dis,2011,64(3):249-252.

[9]Yamasaki K,Komatsu M,Abe N,et al.Laboratory surveillance for prospective plasmid-mediated AmpC beta-lactamases in the Kinki region of Japan[J].J Clin Microbiol,2010,48(9):3267-3273.

[10]Upadhyay S,Sen MR,Bhattacharjee A.Diagnostic utility of boronic acid inhibition with different cephalosporins against Escherichia coli producing AmpC β-lactamases[J].J Med Microbiol,2011,60(Pt 5):691-693.

(收稿日期：2016-01-10)

DOI:10.3969/j.issn.1673-4130.2016.08.041

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1673-4130(2016)08-1112-03

△通訊作者,E-mail：sunshinexu1988@163.com。

·臨床研究·