郭　睿, 楊　軍, 蘇寶山, 康安靜, 馬　莉, 肖　嬌(西安交通大學第二附屬醫(yī)院病理科,西安　710004, 通訊作者, E-mail: yangjundr@163.com)

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全自動DNA定量技術(shù)能提高支氣管鏡刷片中腫瘤細胞的陽性檢出率

郭睿, 楊軍*, 蘇寶山, 康安靜, 馬莉, 肖嬌(西安交通大學第二附屬醫(yī)院病理科,西安710004,*通訊作者, E-mail: yangjundr@163.com)

摘要：目的探討DNA定量技術(shù)肺癌篩查和早期診斷中的應(yīng)用價值。方法 對181例肺部疾病患者進行纖維支氣管鏡取活檢并刷檢。活檢組織經(jīng)常規(guī)固定、石蠟包埋、HE染色后進行病理檢查；留取部分刷取物制作刷片，常規(guī)固定、HE染色后進行常規(guī)細胞學檢查，剩余刷取物放入麥克奧迪DNA倍體樣本處理試劑中固定，懸滴法制作涂片，經(jīng)Feulgen染色，采用Motic全自動細胞DNA定量分析系統(tǒng)進行細胞DNA定量分析。對比分析細胞DNA定量分析與傳統(tǒng)支氣管刷片的敏感度和特異度。結(jié)果采用全自動DNA定量技術(shù)檢測纖維支氣管鏡刷檢物中腫瘤細胞的靈敏度為87.30%、顯著高于傳統(tǒng)纖維支氣管鏡刷片的靈敏度52.38%,但特異度(80.5%)較其低。結(jié)論全自動DNA定量技術(shù)是一種敏感而特異的肺癌篩查和早期診斷技術(shù)，能提高纖維支氣管鏡刷檢物中腫瘤細胞檢出率。

關(guān)鍵詞：DNA定量分析;DNA含量;肺腫瘤

肺癌是我國乃至世界范圍內(nèi)最常見的惡性腫瘤之一。近50年來，其發(fā)病率、死亡率呈現(xiàn)逐年增高趨勢[1-3]。胸部X線檢查、痰細胞學檢查和纖維支氣管鏡刷檢是肺癌普查和診斷的有效方法，其中，通過纖維支氣管鏡檢查并進行刷檢、鉗夾活檢、支氣管肺泡灌洗是最為可靠的肺癌診斷方法。但其低敏感性并不能滿足肺癌臨床診斷的需要，特別是對于早期病變和周圍性病變而言，假陰性率更高。因此，提高纖維支氣管鏡的陽性檢出率具有重要的臨床價值。近年來，一種基于顯微分光光度與圖像處理分析技術(shù)的全自動細胞DNA定量技術(shù)(automatic DNA quantitative analysis technology)的全自動細胞DNA圖像分析技術(shù)(automatic DNA image cytometry,DNA-ICM)以其敏感性高、重復性強、結(jié)果客觀等特點為細胞病理學檢測提供了一種可靠的方法，已用于包括宮頸細胞學篩選在內(nèi)的多種脫落細胞學樣本和組織學樣本的檢測中[4-9]。本文對部分肺部疾病患者的DNA定量診斷結(jié)果與病理結(jié)果進行了對照研究，探討了全自動 DNA定量分析技術(shù)在肺癌診斷中的價值。

1資料與方法

1.1臨床資料

收集西安交通大學第二附屬醫(yī)院病理科2012-10～2014-03纖維支氣管鏡刷檢病例共181例(其中男性125例，女性56例，年齡21-81歲)，所有病例均經(jīng)活檢組織學診斷和/或臨床確診。63例肺癌患者，本院活檢確診57例，余6例臨床經(jīng)外院活檢或其他檢查最終確診。良性病變患者118例，本院活檢確診50例，余68例經(jīng)其他檢查最終確診。所有病例均同時進行常規(guī)支氣管刷片和全自動細胞DNA分析。

1.2方法

1.2.1樣本取材及制片采用Olympus BF-1T260型電子纖維支氣管鏡進行常規(guī)刷檢和活檢，刷取物常規(guī)涂片4-6張用95%酒精+5%冰乙酸常規(guī)固定、其余刷取物加入麥克奧迪DNA分析樣本處理瓶中固定，活檢組織、經(jīng)皮肺穿活檢或術(shù)后標本組織樣本采用10%福爾馬林固定、常規(guī)制片。

1.2.2診斷支氣管刷片和活檢組織均經(jīng)HE染色，由具有臨床資質(zhì)的病理醫(yī)師閱片并按照WHO標準進行病理診斷，其中刷片診斷根據(jù)Papanicolaou細胞學分級評價標準：①Ⅰ級(正常)，無不典型或異常細胞；②Ⅱ級(不典型增生)，有不典型細胞，但無惡性證據(jù)；③Ⅲ級(疑癌細胞)，細胞學提示可能惡性，但無惡性證據(jù)；④Ⅳ級(高度可疑癌細胞)，細胞學強烈提示可能惡性；⑤Ⅴ級(癌細胞)，細胞學為惡性。以Ⅲ-Ⅴ級判定為細胞學檢查陽性。

1.2.3細胞DNA定量分析所有的含保存液的181例DNA檢測樣本均經(jīng)離心、取沉淀，重懸滴片、自然風干、固定，F(xiàn)eulgen染色，質(zhì)控片采用大鼠肝細胞片作對照。按照麥克奧迪全自動細胞DNA定量分析系統(tǒng)操作說明進行參數(shù)設(shè)定、玻片掃描和分析。以DNA指數(shù)(DNA Index，DI)表示DNA含量，以DI>2.5判讀為異倍體細胞(aneuploidy)。①陽性病例：異倍體細胞數(shù)≥3個、或可見細胞異倍體峰(在1.05

1.3統(tǒng)計學分析

采用SPSS19.0軟件進行χ2檢驗，以P<0.05判斷為差異有統(tǒng)計學意義，同時計算靈敏度和特異度。

2結(jié)果

2.1活檢、常規(guī)支氣管刷片、全自動DNA定量分析結(jié)果

在該組病例中，活檢和臨床證實良性病變患者118例(包括支氣管黏膜炎113例、肺結(jié)核3例、真菌感染1例、氣管異物1例)，肺癌患者共63例(包括鱗癌24例、腺癌11例、小細胞未分化癌9例和其他類型癌19例)；支氣管刷片陰性者占76.80%(139/181)、不典型增生者占14.92%(27/181)、陽性者(診斷為Ⅲ-Ⅴ級，包括癌疑細胞、高度癌疑細胞和癌細胞)占8.28%(15/181)。181例支氣管刷檢樣本中DNA定量分析檢測，良性病變組絕大部分細胞為二倍體, 肺癌組可見大量異倍體細胞,DI≥3者占30.39%(55/181)、DI為1-2者占12.71%(23/181)、DI為0者占56.90%(103/181)(見圖1)。統(tǒng)計學分析結(jié)果顯示：全自動細胞DNA定量分析結(jié)果與組織學檢測和傳統(tǒng)細胞學檢測方法結(jié)果之間差異有統(tǒng)計學意義(P<0.001，見表1，2)。

2.2常規(guī)支氣管刷片與全自動DNA定量技術(shù)敏感度和特異度分析

以活檢和臨床診斷為標準，以DI≥1作為陽性界值計算全自動細胞DNA定量分析技術(shù)的靈敏度為87.30%、特異度為80.51%(見表3)。而在常規(guī)纖維支氣管刷片中，以不典型細胞、癌疑細胞、高度癌疑細胞和癌細胞合計作為陽性細胞計算的常規(guī)纖維支氣管鏡刷片的靈敏度為52.38%、特異度為92.37%(見表4)。結(jié)果顯示全自動細胞DNA定量技術(shù)的靈敏度顯著高于常規(guī)支氣管刷片，但其特異度較常規(guī)支氣管刷片低。

3討論

眾所周知，細胞DNA含量是比較恒定的細胞物理參數(shù)，正常人體細胞多為二倍體細胞，DNA含量恒定，大約為7 pg。致癌因素引起的基因突變、丟失、異常擴增或染色體移位、融合等被認為是腫瘤發(fā)生的早期分子事件，并導致細胞DNA含量的增加。因此，準確測定細胞DNA含量的微小異常變化，發(fā)現(xiàn)異常細胞，成為使用DNA-ICM技術(shù)進行腫瘤極早期診斷的理論基礎(chǔ)[12,13]。

采用白光顯微分光光度與自動細胞圖像分析技術(shù)的DNA-ICM技術(shù)通過對Feulgen染色的細胞涂片進行掃描，并快速直觀地進行逐個細胞核積分吸光度(IOD)的檢測，計算細胞核DNA含量，并常用DNA指數(shù)(DNA index，DI)來表示DNA含量：DI=被測細胞IOD值/正常細胞DNA(G0/G1期)IOD平均值。一般認為，一旦檢測到DI>2.5的異倍體細胞，或出現(xiàn)較多DI值為1.1-1.9的異倍體細胞，且聚集成峰，提示存在惡性瘤細胞。因此，多種全自動細胞DNA定量分析相關(guān)設(shè)備已被廣泛應(yīng)用，主要有德國Leitz MPVⅢ型光度計掃描系統(tǒng)、加拿大的AeCell系統(tǒng)和MOTIC系統(tǒng)等。目前，DNA-ICM技術(shù)以其較高的敏感性和特異性已被用于包括宮頸在內(nèi)的多種類型脫落細胞學標本的檢測和惡性實體腫瘤惡性程度的評估，并已證實，DI和異倍體細胞數(shù)與細胞增殖、惡性程度及不良預后呈正相關(guān)[14-16]。

圖1　三組患者支氣管刷取物細胞DNA圖像分析比較Figure 1　Analysis and comparison of the DNA images by bronchial brush from three kinds of patients

表1DNA定量分析檢測結(jié)果例(%)

Table 1Quantitative analysis of DNA of bronchial brush extractcases(%)

組織學診斷n異倍體細胞數(shù)01-2≥3χ2P 良性病變組118(65.19)95(52.49)13(7.18) 10(5.52)87.5180.000 肺癌組 鱗癌24(13.26)4(2.21) 2(1.10)18(9.94) 腺癌11(6.08) 2(1.10)1(0.55)8(4.42) 小細胞癌9(4.97) 0(0) 6(3.31)3(1.66) 其他類型癌19(10.50)2(1.10) 1(0.55)16(8.84) 合計181(100.0) 103(56.91) 23(12.71)55(30.39)

表2常規(guī)支氣管刷片檢測結(jié)果例(%)

Table 2Results of conventional bronchial brush extract cases(%)

細胞學診斷n異倍體細胞數(shù)01-2≥3χ2P陰性(Ⅰ級)139(76.80) 96(53.04)19(10.50)24(13.26) 50.9050.000不典型增生(Ⅱ級)27(14.92)6(3.31)2(1.10)19(10.50)陽性(Ⅲ-Ⅴ級)15(8.28)1(0.55)2(1.10)12(6.63) 合計181(100.0)103(56.91)23(12.71)55(30.39)

表3DNA定量分析靈敏度和特異度

Table 3DNA quantitative analysis of sensitivity and specificitycases(%)

活檢全自動DNA定量分析陽性陰性合計靈敏度特異度陽性5586387.30%80.51%陰性2395118合計78113181

表4常規(guī)支氣管刷片靈敏度和特異度分析

Table 4Sensitivity and specificity of conventional bronchial brushcases(%)

活檢全自動DNA定量分析陽性陰性合計靈敏度特異度陽性33306352.38%92.37%陰性9109118合計42139181

該研究應(yīng)用麥克奧迪生產(chǎn)的MotiCytometer全自動細胞DNA圖像定量分析系統(tǒng)對181例纖維支氣管鏡刷檢細胞樣本進行細胞DNA含量檢測，發(fā)現(xiàn)全自動細胞DNA定量分析技術(shù)與常規(guī)活檢和常規(guī)纖維支氣管鏡刷片檢測之間有統(tǒng)計學差異。以活檢和臨床最終診斷作為標準，結(jié)果提示全自動細胞DNA定量分析技術(shù)具有很好的靈敏度(87.30%)和一定的特異度(80.51%)，且其靈敏度顯著高于常規(guī)纖維支氣管刷片的靈敏度(52.38%)。而其特異度(80.51%)較常規(guī)纖維支氣管刷片的特異度(92.37%)低，可能與以下因素有關(guān)：首先，在細胞癌變過程中，由于細胞DNA含量的變化早于細胞形態(tài)學的變化，當DNA定量分析發(fā)現(xiàn)的異倍體細胞在細胞學水平上并未顯示出足以判斷為異常細胞的形態(tài)學異型性，因而，活檢和細胞學檢查時并不能發(fā)現(xiàn)異常。同時，該組病例均經(jīng)單次活檢和臨床診斷作為標準，進行全自動細胞DNA定量技術(shù)敏感性和特異度分析，不排除部分患者存在由于腫瘤部位或活檢取材不當導致的活檢假陰性的可能。

總之，作為一項肺癌篩查和早期診斷方法，全自動細胞DNA定量分析技術(shù)以其87.30%的靈敏度和80.51%的特異度，能顯著提高纖維支氣管鏡刷檢的陽性檢出率，是一種敏感而特異的肺癌篩查和早期診斷技術(shù)，盡管價格較高，但由于其具有操作簡單、結(jié)果客觀準確、重復性的特點，仍適于大范圍推廣應(yīng)用。

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Automatic DNA image cytometry can improve the positive detectable rate of cancer by fiberobronchoscopy

GUO Rui, YANG Jun*, SU Baoshan, KANG Anjing, MA Li, XIAO Jiao

(DepartmentofPathology,SecondHospitalofXi’anJiaotongUniversityCollegeofMedicine,Xi’an710004,China；*Correspondingauthor，E-mail:yangjundr@163.com)

Abstract：ObjectiveTo investigate the application value of automatic DNA image cytometry(DNA-ICM) in screening and early diagnosis of lung cancer. MethodsFresh cytology and biopsy specimens were taken by fiberobronchoscopy from 181 cases of pulmonary disease. Biopsy samples were conventionally fixed, paraffin embedded and stained with HE for pathological examination. Some of brush extract was used to prepare bronchial smear for cytological examination. The rest brush extract was fixed in MotiC?TMcell preservation liquid for making a thin smear by hanging drop. After stained with Feulgen, the thin smear was measured for DNA index(DI) using MotiC Automatic DNA image cytometry(Motic Xiamen Co.,Ltd.).Finally, the sensitivity and specificity of DNA-ICM and traditional bronchial brush smear were analyzed.ResultsThe sensitivity and the specificity of DNA-ICM in fiberobronchoscopy were 87.30% and 80.51% respectively. The sensitivity of DNA-ICM was significantly higher than that of traditional bronchial brush smear(52.38%,P<0.01). ConclusionDNA-ICM is a sensitive cytological technology for screening and early diagnosing lung cancer, and it can improve the positive detectable rate of tumor cells in fibrobronchoscopy.

Key words:automatic DNA image cytometry(DNA-ICM);DNA content;lung carcinoma

[收稿日期：2015-09-21]

作者簡介：郭睿，女，1981-07生，碩士，醫(yī)師，E-mail:25815166@qq.com.

中圖分類號：R734.2

文獻標志碼：A

文章編號：1007-6611(2016)01-00102-05

DOI：10.13753/j.issn.1007-6611.2016.01.025

基金項目：衛(wèi)生部醫(yī)藥衛(wèi)生科技發(fā)展研究中心(W2012GJ03)