王曉梅， 衛(wèi)　罡， 楊官娥， 王進(jìn)東(山西醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，太原　03000； 山西省醫(yī)藥與生命科學(xué)研究院；通訊作者，E-mail:8443838@qq.com)

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大孔樹脂純化黃刺玫果中總黃酮的工藝研究

王曉梅1， 衛(wèi)罡2， 楊官娥1， 王進(jìn)東2*(1山西醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，太原030001；2山西省醫(yī)藥與生命科學(xué)研究院；*通訊作者，E-mail:844381238@qq.com)

摘要：目的研究大孔樹脂分離純化黃刺玫果中總黃酮的工藝條件及參數(shù)。方法采用靜態(tài)吸附解吸法考察8種大孔樹脂對(duì)黃刺玫果中總黃酮的吸附和解吸性能，篩選樹脂型號(hào)；以總黃酮的含量為指標(biāo)考察各因素對(duì)D101大孔樹脂純化黃刺玫果中總黃酮的影響。結(jié)果選用D101型大孔吸附樹脂，最佳工藝條件為：上樣液料液比為1∶12，最大上樣量為2.6 g生藥/g樹脂，用3BV的 70%乙醇進(jìn)行洗脫，解吸率達(dá)95%，總黃酮回收率為72%。經(jīng)上述工藝純化后黃刺玫果提取物中總黃酮含量為24.87%。結(jié)論該方法簡(jiǎn)單可行，分離效果好，可為工業(yè)生產(chǎn)提供參考。

關(guān)鍵詞：黃刺玫果；總黃酮；大孔樹脂；純化工藝

黃刺玫(Rosaxanthinalindl)屬于薔薇科薔薇屬薔薇亞屬野生落葉直立灌木，其成熟果實(shí)呈紫褐色或黑褐色。王常青對(duì)小鼠經(jīng)口灌胃急性毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，黃刺玫果汁(DXG)安全無(wú)毒[1]?？顾ダ献饔脤?shí)驗(yàn)研究表明，黃刺玫果汁能明顯延長(zhǎng)果蠅壽命，降低大鼠血漿過氧化脂質(zhì)(LPO)含量，并使血液中超氧化物歧化酶[2](SOD)和谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)活力顯著提高[3]。黃刺玫果實(shí)除含有維生素B和維生素C及鐵、銅、鋅、錳等微量元素外[3]，還含有豐富的黃酮類化合物[4]。研究表明，多數(shù)植物藥中所含的黃酮類化合物有抗心腦血管疾病、抗癌抗腫瘤、抗炎鎮(zhèn)痛和免疫調(diào)節(jié)作用及抗氧化、抗衰老作用[5]。本實(shí)驗(yàn)選取8種大孔樹脂[6]，通過靜態(tài)吸附與解吸篩選出相對(duì)較優(yōu)的大孔樹脂；以總黃酮的含量為指標(biāo)，考察黃刺玫果提取液在大孔樹脂分離純化中的最佳上樣量和洗脫條件，優(yōu)選出大孔樹脂分離純化黃刺玫果中總黃酮的工藝條件，為黃刺玫果的進(jìn)一步開發(fā)利用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1材料、試劑與儀器

黃刺玫果采摘自山西左權(quán)縣。主要試劑：蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所，無(wú)水乙醇、氫氧化鈉、亞硝酸鈉、硝酸鋁等均為分析純，8種大孔吸附樹脂NKA-9、FL-1、FL-2、FL-3、DM130、AB-8、HPD100、D101均購(gòu)自天津歐瑞生物科技有限公司。

儀器設(shè)備：UV-6100S型紫外可見分光光度計(jì)(上海元析儀器有限公司)，RE52CS-1旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)，B-260型恒溫水浴鍋(上海亞榮生化儀器廠)，DLSB-低溫冷卻循環(huán)泵(杭州瑞佳精密科學(xué)儀器有限公司)。

2方法與結(jié)果

2.1黃刺玫提取液的制備

取黃刺玫干果50 g，粉碎，加500 ml 70%乙醇，在80 ℃下回流提取3次，每次1.5 h，過濾，合并濾液。用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至無(wú)醇味，用水補(bǔ)至600 ml (料液比1∶12)。離心15 min，轉(zhuǎn)速為4 000 r/min，得到料液比為1∶12的供試液，備用。

2.2黃刺玫果中總黃酮含量測(cè)定方法

2.2.1標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制精密稱取經(jīng)120 ℃干燥至恒重的蘆丁對(duì)照品20 mg，置于50 ml容量瓶中，加無(wú)水乙醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為對(duì)照品溶液備用。精密吸取蘆丁對(duì)照品溶液0.5，1，1.5，2，3，4 ml，分別置于25 ml容量瓶中，加無(wú)水乙醇至總體積為6.0 ml。分別加入5%亞硝酸鈉溶液1 ml，搖勻，放置6 min；分別再加入10%硝酸鋁溶液1 ml，搖勻，放置6 min；分別加入1 mol/L氫氧化鈉溶液10 ml，搖勻，加30%乙醇至刻度，放置15 min。在500 nm的波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，以吸光度為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)，得回歸方程A=12.523C+0.004 9，R2=0.999 8，在8.012-64.096 μg/ml范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.2.2樣品測(cè)定取2.1項(xiàng)下黃刺玫提取液1 ml按2.2.1中方法測(cè)定吸光度。按回歸方程計(jì)算得50 g黃刺玫果的乙醇提取液中總黃酮含量為768.82 mg。

2.3大孔樹脂的篩選

采用靜態(tài)吸附法，通過測(cè)定吸附殘液中總黃酮的含量來(lái)計(jì)算吸附量和解吸量以篩選合適的樹脂。取處理好的8種大孔樹脂NKA-9、FL-1、FL-2、FL-3、DM130、AB-8、HPD100、D101各3 g，放入250 ml的錐形瓶中，各加入144 ml(相當(dāng)于含12 g生藥)黃刺玫果提取液，每10 min振搖20 s，持續(xù)2 h，靜置24 h濾過，用蒸餾水沖洗樹脂，洗液合并到濾液中，于500 nm處測(cè)定吸附后濾液中總黃酮濃度。樹脂用95%乙醇洗脫，每10 min振搖20 s，持續(xù)2 h，靜置24 h濾過，測(cè)定解吸后濾液中總黃酮的濃度。按下列公式計(jì)算吸附率和解吸率:

吸附量=上樣液濃度×上樣液體積-流出液濃長(zhǎng)×流出液體體積;

吸附率=吸附量/上樣液中總黃酮量;

解吸率=洗脫液中總黃酮含量/吸附量。

由表1可知，不同類型的大孔樹脂對(duì)黃刺玫果中總黃酮的吸附解吸效果差異明顯，由吸附量和解吸量可以看出，吸附解吸效果最好的是NKA-9樹脂，其次為FL-3型，效果最差的是FL-2型，NKA-9、FL-3、HPD100、AB-8和D101五種弱極性或非極性樹脂最終解吸量差異不大，綜合考慮成本等多方面因素，最終選擇較為常用的D101型大孔吸附樹脂作為分離純化黃刺玫果總黃酮的適宜樹脂，做進(jìn)一步考察。

表1不同樹脂類型的篩選結(jié)果

Table 1Static adsorption and desorption performance of different resins for total flavonoids fromRosaxanthinalindl

樹脂類型 極性吸附量(mg)吸附率(%)解吸量(mg)解吸率(%)NKA-9極性 55.9747.4147.8585.50FL-1強(qiáng)極性63.9554.1828.6644.81FL-2中極性28.0623.7712.8645.84FL-3弱極性55.4146.9446.6584.20DM130弱極性47.7440.4441.6287.19AB-8弱極性55.2946.8444.8081.03HPD100非極性54.3346.0245.2883.34D101非極性53.7345.5244.7183.21

2.4純化工藝參數(shù)的考察

2.4.1上樣液濃度取4份黃刺玫果提取液，每份300 ml，減壓回收乙醇后加水至料液比分別為1∶6,1∶8,1∶10,1∶12，以4 000 r/min離心15 min，在500 nm處分別測(cè)4份上樣液中的總黃酮含量，與黃刺玫果提取液中總黃酮含量進(jìn)行比較，計(jì)算不同濃度的濃縮液中總黃酮的含量以及回收率。由表2可知，濃度為1∶12時(shí)，回收率達(dá)97.9%，損失較少。所以選取料液比1∶12。

2.4.2最大上樣量將處理好的D101大孔樹脂濾干，稱取8份，每份5 g，分別放入250 ml的具塞錐形瓶中，分別加入含有1，2，4，8，13，14，16，18 g生藥的刺玫果提取液，每10 min搖20 s，持續(xù)2 h靜置24 h，抽濾，用200 ml 95%的乙醇進(jìn)行解吸，每10 min搖20 s，持續(xù)2 h靜置24 h，抽濾，分別測(cè)定上樣液、水洗液和解析液中總黃酮的含量，進(jìn)而計(jì)算各溶液中總黃酮吸附率，結(jié)果見圖1。

表2不同料液比下的回收率

Table 2The recovery of total flavonoids fromRosaxanthinalindlunder different concentration ratio

圖1　D101樹脂的吸附率隨上樣量的變化曲線Figure 1　The adsorption rate of D101 resin under the different sample weight

由圖1可看出，吸附率隨著上樣量的增加而減小，超過13 g生藥量時(shí)，漸漸趨于穩(wěn)定，繼續(xù)增加上樣量，樹脂吸附飽和而不再吸附，因此確定13 g生藥量/5 g樹脂作為最大上樣量。

2.4.3洗脫液濃度取吸附好的樹脂4份，每份20 g，用1BV蒸餾水洗柱，再分別用6BV 30%，50%，70%，90%乙醇洗脫，收集洗脫液，測(cè)定上樣流出液和乙醇洗脫液中總黃酮含量，按下列公式計(jì)算回收率:回收率=洗脫液中總黃酮含量/上樣液中總黃酮含量。

由表3可知，洗脫率隨著乙醇濃度的增大而增加，70%時(shí)，洗脫率和回收率都達(dá)到最高。因此選用70%的乙醇作為洗脫液。

表3乙醇濃度對(duì)總黃酮含量的影響

Table 3Effect of different ethanol concentrations as elution fluid on adsorption

乙醇濃度吸附量(mg)洗脫率(%)回收率(%)30%215.861.147.950%238.275.665.570%209.895.172.590%216.061.248.1

2.4.4洗脫終點(diǎn)的確定取吸附好的樹脂20 g，先用1BV蒸餾水洗柱，再用70%的乙醇洗脫，按柱床體積收集，共收集6個(gè)洗脫份，測(cè)定每個(gè)洗脫份的總黃酮量。以洗脫液中總黃酮含量對(duì)洗脫體積做曲線，結(jié)果見圖2。

圖2　乙醇用量對(duì)總黃酮含量的影響Figure 2　The effect of dosage of ethanol on the content of total flavonoids

由圖2可知，3BV的70%乙醇幾乎把樹脂上吸附的總黃酮全洗脫下來(lái)，故確定3BV作為洗脫體積。

2.5驗(yàn)證試驗(yàn)

通過對(duì)樹脂純化黃刺玫果中總黃酮工藝參數(shù)的考察，最終得到最佳工藝條件為：提取液減壓回收乙醇，加水至料液比1∶12，4000 r/min離心15 min，棄去沉淀，取上清液按每克D101型大孔樹脂上樣2.6 g生藥的比例上樣，蒸餾水洗1BV后，以3BV的70%乙醇進(jìn)行洗脫，收集洗脫液。我們按照上述方法開展了驗(yàn)證試驗(yàn)，取含52 g生藥量的提取液上樣，測(cè)得上樣液、上樣流出液、洗脫液中總黃酮的含量分別為302.08 mg,76.38 mg,213.45 mg，計(jì)算解吸率為94.57%，回收率達(dá)70.66%，將洗脫液減壓濃縮得到浸膏，真空干燥后用70%乙醇溶解，并測(cè)定其中總黃酮的含量，最后所得浸膏中總黃酮含量為24.87%，表明大孔樹脂純化黃刺玫果總黃酮的方法可行。

3討論

不同類型的大孔吸附樹脂由于其本身極性、孔徑大小、比表面積的不同而使它們對(duì)于同一物質(zhì)的吸附能力和解吸能力不同，最終影響吸附效果。由表1可以看出，F(xiàn)L-1型大孔樹脂吸附能力最強(qiáng)，但吸附在樹脂上的成分不易洗脫而使解吸效果最差；DM130型大孔樹脂解吸能力相對(duì)較強(qiáng)，但其吸附能力較差；FL-2型樹脂吸附和解吸效果均較低；NKA-9、FL-3、HPD100和D101型樹脂的吸附、解吸效果效果均較好，吸附率相差在0.12%-1.89%之間，解吸率相差在0.13%-2.49%之間，差別不大；D101型大孔樹脂在分離純化總黃酮方面應(yīng)用廣泛，效果較好，綜合考慮最終選取D101大孔樹脂為分離純化黃刺玫果中總黃酮的最適宜樹脂。

上樣液濃度直接影響整個(gè)樹脂純化工藝的效果，上樣液濃度過大，易堵塞樹脂柱；上樣液濃度過小，在中試試驗(yàn)和工業(yè)生產(chǎn)中會(huì)大大增加時(shí)間成本，不實(shí)用。本文對(duì)不同濃度的上樣液進(jìn)行考察，由表2可知，料液比為1∶6，1∶8，1∶10時(shí)，上樣液中總黃酮的損失較大；料液比為1∶12時(shí)，總黃酮損失量為2.1%，且溶液無(wú)明顯沉淀；繼續(xù)減小料液比，總黃酮含量增加很少，上樣時(shí)間會(huì)大大增加，故沒有考察更小濃度的上樣液。

本文通過靜態(tài)試驗(yàn)，以吸附率和解吸率為考察指標(biāo)，綜合考慮降低成本及適合工業(yè)化生產(chǎn)等因素，從8種樹脂中篩選出D101大孔吸附樹脂作為分離純化黃刺玫果中總黃酮的最適宜樹脂。在此基礎(chǔ)上，通過總黃酮的損失量確定了上樣液的料液比，通過動(dòng)態(tài)試驗(yàn)對(duì)洗脫劑乙醇的濃度和用量進(jìn)行了考察。確定最佳純化工藝為：上樣液料液比為1∶12，最大上樣量為2.6 g生藥/g樹脂，乙醇洗脫濃度為70%，乙醇用量為3BV，解吸率平均達(dá)94.57%。未經(jīng)大孔樹脂純化的黃刺玫果中總黃酮含量是1.548%，經(jīng)D101大孔樹脂純化后的提取物中總黃酮含量可以達(dá)到24.87%。通過驗(yàn)證試驗(yàn)證明本試驗(yàn)優(yōu)化的大孔樹脂純化工藝簡(jiǎn)單可行，為黃刺玫果總黃酮的工業(yè)化生產(chǎn)提供了理論依據(jù)。

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Study on the separation and purification of flavonoids fromRosaxanthinalindlwith macroporous adsorption resin

WANG Xiaomei1, WEI Gang2, YANG Guane1, WANG Jindong2*

(1CollegeofPharmacy,ShanxiMedicalUniversity,Taiyuan030001,China；2ShanxiInstituteofMedicineandLifeScience;*Correspondingauthor,E-mail:844381238@qq.com)

Abstract：ObjectiveTo optimize the process conditions of separation and purification of total flavonoids from Rosa xanthina lindl with macroreticular adsorption resin.MethodsStatic adsorption and desorption performance of eight kinds of macroporous adsorption resins for total flavonoids from Rosa xanthina lindl were investigated to screen the optimal resin. The factors of D101 macroporous resin were investigated to purify the total flavonoids of Rosa xanthina lind, with the content of total flavonoids as the index.ResultsD101 macroporous adsorption resin was chosen as the optimal resin, and its optimized technology conditions were as following:the concentration of sample solution 1∶12, the largest sample weight of 2.6 g Rosa xanthina lindl/g resin, the volume of 70% ethanol(3BV)as the eluant. The desorption rate reached 95%, and the recovery rate of total flavonoids from Rosa xanthina lindl was 72%.After purified with D101 macroporous resin, the purity of total flavonoids was up to 24.87%. ConclusionThis procedure is good and simple, and could be used to separate and purify the total flavonoids from Rosa xanthina lindl.

Key words:fruit of Rosa xanthina lindl;total flavonoids;macroporous adsorption resins;purification technology

[收稿日期：2015-10-28]

作者簡(jiǎn)介：王曉梅,女，1990-04生，碩士,E-mail:SDxiaomeiwang@163.com.

中圖分類號(hào)：TQ460.6

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1007-6611(2016)01-0055-04

DOI：10.13753/j.issn.1007-6611.2016.01.013

基金項(xiàng)目：山西省國(guó)際科技合作項(xiàng)目(2014081049-2)