高菱悅，張　楠，陳波水，歐益希，洛桑銀巴

(1.后勤工程學院軍事油料應用與管理工程系，重慶 401311；2.后勤工程學院國防建筑規(guī)劃與環(huán)境工程系，重慶 401311；3.后勤工程學院軍事土木工程系，重慶401311；4.95526部隊，拉薩850000)

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月桂?；劝彼徕c促進油污染生物修復的作用機制

高菱悅1，張楠2，陳波水1，歐益希3，洛桑銀巴4

(1.后勤工程學院軍事油料應用與管理工程系，重慶 401311；2.后勤工程學院國防建筑規(guī)劃與環(huán)境工程系，重慶 401311；3.后勤工程學院軍事土木工程系，重慶401311；4.95526部隊，拉薩850000)

摘要：以十二烷基環(huán)己烷模擬礦物潤滑油、以混合菌群為降解微生物，采用氣相色譜法考察月桂酰基谷氨酸鈉對十二烷基環(huán)己烷生物降解性的影響；采用氣質(zhì)聯(lián)用儀、紫外可見分光光度計和表面張力儀分別對降解產(chǎn)物、降解過程中微生物生長情況以及月桂?；劝彼徕c對培養(yǎng)基油/水界面張力的影響進行分析，解析了月桂?；劝彼徕c促進十二烷基環(huán)己烷生物降解的作用機制。結果表明，生物降解過程中，月桂?；劝彼徕c先降解；月桂?；劝彼徕c可減小油/水界面張力，還可為微生物提供營養(yǎng)，加速微生物生長，兩方面作用共同促進十二烷基環(huán)己烷生物降解。

關鍵詞：月桂?；劝彼徕c；礦物潤滑油；十二烷基環(huán)己烷；生物降解；生物修復；作用機制

隨著合成潤滑油的不斷發(fā)展，以礦物潤滑油為代表的潤滑油逐漸取代了動植物潤滑油成為最重要的潤滑油品種。石油煉制技術及添加劑工業(yè)的不斷發(fā)展，使?jié)櫥托阅苡辛撕艽蟮奶岣?，滿足了人類社會不斷發(fā)展的需要。然而，在提高潤滑油使用性能的同時，對其生態(tài)效能有所忽視，如以礦物潤滑油為代表的生物難降解潤滑油及大量有毒添加劑的使用對生態(tài)系統(tǒng)造成了較大的破壞[1]。

近年來，世界范圍內(nèi)潤滑油環(huán)境友好化的呼聲日益高漲，提出了“潤滑、環(huán)保、節(jié)能”的現(xiàn)代潤滑新理念。研究改善礦物潤滑油生物降解性的新方法，對減少礦物潤滑油對生態(tài)環(huán)境的危害具有重要的理論意義和應用價值[2]。課題組[3-4]前期研究發(fā)現(xiàn)，將月桂?；劝彼?、油酸二乙醇酰胺磷酸酯等含N和(或)P元素的化合物以適當比例加到礦物潤滑油中，不僅能改善潤滑油的某些使用性能，還可在一定程度上提高其生物降解性，但有關含N和(或)P化合物促進礦物潤滑油生物降解的作用機制尚缺乏深入研究。為了提高月桂酰基谷氨酸在水基培養(yǎng)基中的溶解性，同時也為了規(guī)避多組分礦物潤滑油引起的化學解析復雜性，作者在此以月桂?；劝彼徕c為生物降解促進劑、以十二烷基環(huán)己烷為礦物潤滑油模擬物，研究了月桂?；劝彼徕c促進礦物潤滑油生物降解的作用機制。

1實驗

1.1菌種、試劑與儀器

混合降解菌：由課題組從石油污染土壤中分離、鑒定的5株菌(假單胞菌屬、蒼白桿菌屬、博德特氏菌屬、戈登氏菌屬和銅綠假單胞菌[5])經(jīng)人工馴化后組成。

正己烷，色譜純，成都科龍化工試劑廠；十二烷基環(huán)己烷(C18)，日本東京化成工業(yè)株式會社；月桂?；劝彼徕c(SLG)，上海中獅科技發(fā)展有限公司。其它試劑均為市售分析純。

7890A型氣相色譜儀(GC)、7890A/5975C型氣質(zhì)聯(lián)用儀(GC-MS)，美國Agilent公司；JYW-200C型全自動表/界面張力儀，承德鼎盛試驗機檢測設備有限公司；Alpha-1506型紫外可見分光光度計，上海譜元儀器有限公司。

1.2方法

1.2.1培養(yǎng)基及菌懸液的配制

無機鹽培養(yǎng)基：NaCl 0.1 g，NH4NO30.1 g，MgSO4·7H2O 0.05 g，KCl 0.01 g，CaCl20.05 g，KH2PO4-K2HPO4緩沖溶液調(diào)節(jié)pH=7.0，蒸餾水定容至100 mL，121 ℃蒸汽滅菌20 min。

C18富集培養(yǎng)基：在100 mL無機鹽培養(yǎng)基中加入0.4 g C18。

LB培養(yǎng)基：胰蛋白胨1 g，酵母粉0.5 g，NaCl 1 g，蒸餾水定容至100 mL，5 mol·L-1的NaOH調(diào)節(jié)pH=7.0，121 ℃蒸汽滅菌20 min；固體培養(yǎng)基需加瓊脂粉2 g。

菌懸液：采用濕重法配制菌懸液作為生物降解實驗的接種微生物。將上述5株菌分別復活于LB瓊脂平板上，挑單菌落至LB液體培養(yǎng)基中，于(30±2) ℃、200 r·min-1搖床中振蕩培養(yǎng)24 h，8 000 r·min-1高速離心8 min，去上層清液，稱菌體濕重。用無菌生理鹽水配制質(zhì)量分數(shù)為10%的菌懸液。將5株菌的菌懸液混合即得混合菌懸液，其中，每株菌占混合菌懸液體積的1/5[5]。

1.2.2降解菌的馴化

為提高菌株對C18的降解率，對5株降解菌進行人工馴化[6]。將5株菌分別接種于LB瓊脂平板上，32 ℃培養(yǎng)3 d，取平板上單菌落至C18富集培養(yǎng)基中，于(30±2) ℃、200 r·min-1搖床中振蕩培養(yǎng)10 d后，取2 mL培養(yǎng)液于新鮮的C18富集培養(yǎng)基中，再重復培養(yǎng)2次，每次10 d。用接種環(huán)取末次培養(yǎng)的C18富集培養(yǎng)液于LB瓊脂平板上分區(qū)劃線，用含甘油培養(yǎng)物保藏法于-70 ℃保存菌種，備用。

1.2.3生物降解性實驗

采用氣相色譜儀測定SLG對C18生物降解性的影響。

(1)C18標準曲線的繪制

采用外標法[7]繪制C18標準曲線：分別配制濃度(g·mL-1)為0.02、0.06、0.08、0.13的C18標準溶液，正己烷標定，混合后進樣，采用氣相色譜測定峰面積，Excel軟件繪制C18標準曲線并擬合回歸方程。色譜條件為：HP-5色譜柱，載氣(N2)流速30 cm·s-1，進樣口溫度280 ℃，F(xiàn)ID檢測器溫度300 ℃，進樣口分流比10∶1，進樣量2 μL，初始柱溫60 ℃保留1 min，再以15 ℃·min-1的速度升溫至240 ℃，最后以10 ℃·min-1的速度升溫至300 ℃保留1 min。

(2)樣品預處理

在100 mL無機鹽培養(yǎng)基中，依次加入0.1 g C18、0.1 g SLG和1 mL混合菌懸液，于(30±2) ℃、200 r·min-1搖床中振蕩培養(yǎng)。取出樣品，依次加入15 g NaCl、10 mL正己烷和100 μL 6 mol·L-1的HCl，于(30±2) ℃、200 r·min-1搖床中振蕩30 min，靜置于分液漏斗，分層后取上層溶液置于25 mL消解管中，加入2 g無水Na2SO4，搖勻，放入5 ℃冰箱中靜置1 d。

(3)C18生物降解率的測定

采用氣相色譜測定C18生物降解率：分別在培養(yǎng)1 d、2 d、3 d、4 d、5 d、6 d、7 d、8 d時取樣，按(2)制備待測樣品，進樣測定，色譜條件同(1)，計算C18生物降解率。

1.2.4降解產(chǎn)物分析

采用氣質(zhì)聯(lián)用儀分析降解產(chǎn)物：分別在培養(yǎng)4 h、8 h、12 h時取樣，按(2)制備待測樣品，進樣測定。氣相色譜條件：HP-5色譜柱，初始柱溫60 ℃保留1 min，再以15 ℃·min-1的速度升溫至240 ℃，最后以10 ℃·min-1的速度升溫至300 ℃保留1 min；質(zhì)譜條件：接口溫度260 ℃，電子能量70 eV，電離方式EI，離子源溫度230 ℃，四級桿溫度150 ℃，掃描范圍50～400 amu。

1.2.5微生物生長特性考察

采用紫外可見分光光度計考察微生物生長情況：將0.1 g C18、0.1 g SLG和1 mL混合菌懸液加到100 mL無機鹽培養(yǎng)基中，以不添加SLG的無機鹽培養(yǎng)基作為空白樣，于(30±2) ℃、200 r·min-1搖床中振蕩培養(yǎng)12 d。每隔2 d取樣，用紫外可見分光光度計在600 nm處測定培養(yǎng)基的吸光度(OD600)，重復測定3次取平均值。

1.2.6油/水界面張力測定

按1.2.5培養(yǎng)微生物，每隔2 d取樣，4 000 r·min-1離心10 min后取上層清液，采用表/界面張力儀測定其油/水界面張力[8]，重復測定3次取平均值。

2結果與討論

2.1C18標準曲線(圖1)

由圖1可知，擬合線性方程為y=428 096x-419.38，相關系數(shù)R2=0.9867，表明C18濃度與峰面積呈良好的線性關系。通過回歸方程可計算不同峰面積對應的C18濃度。

2.2SLG對C18生物降解率的影響(圖2)

由圖2可知，降解8 d，C18及添加SLG的C18的生物降解率均達到65%以上，表明馴化后的混合菌群對C18有較好的降解效果。降解第1 d，添加SLG的C18降解率即達到25.27%，而未添加SLG的C18降解率僅為2.82%；降解前3 d，未添加SLG的C18降解率升速緩慢，且降解率明顯低于添加者；降解第3 d時，未添加SLG的C18降解率僅為9.37%，而添加SLG的C18降解率已達55.58%；降解第8 d時，添加SLG的C18降解率為79.68%，未添加SLG的C18降解率為69.45%。表明，SLG能提高C18的生物降解率，促進C18的生物降解。

圖1C18標準曲線

Fig.1Standard curve of dodecylcyclohexane

圖2　SLG對C18生物降解率的影響

2.3SLG促進C18生物降解的作用機制

2.3.1降解產(chǎn)物分析

在C18培養(yǎng)基中添加SLG后，降解4 h、8 h和12 h時的GC-MS圖譜如圖3所示。

圖3　降解產(chǎn)物的GC-MS圖譜

由圖3可知，培養(yǎng)4 h時檢測到月桂酸(C12H24O2)，而培養(yǎng)8 h、12 h時均未檢測到月桂酸，由此推斷SLG 8 h即可完全降解。因SLG具有中度耐鹽及耐水性，降解過程處于緩沖溶液體系中，維持pH值接近中性不會導致SLG的自身水解。由此推斷，在生物降解初期，SLG含有與蛋白質(zhì)相似的酰胺鍵，可作為微生物的營養(yǎng)物質(zhì)，易被微生物降解利用，因此在降解初期微生物先與SLG作用，直至微生物將其完全降解，且降解速度快。由圖3還可看出，降解12 h內(nèi)，C18的GC-MS圖譜信號均較強，表明培養(yǎng)基中C18含量較高。結合圖2結果可知，混合菌群先降解SLG，待SLG降解完畢再降解C18。

2.3.2微生物生長情況

C18及添加SLG的C18培養(yǎng)基溶液在600 nm處的吸光度(OD600)隨降解時間(t)的變化如圖4所示。

圖4　培養(yǎng)基的吸光度隨降解時間的變化

OD值可直觀地反映微生物的生長情況，OD值越大，表明微生物數(shù)量越多，生長情況越好。由圖4可知，微生物在添加SLG的C18培養(yǎng)基中前4 d處于指數(shù)生長期，在未添加SLG的C18培養(yǎng)基中前6 d處于指數(shù)生長期，而后均進入穩(wěn)定期；添加SLG的C18培養(yǎng)基的最大OD值明顯高于未添加者并提前達到最大值。這是因為，SLG先于C18降解，SLG可為微生物生長提供營養(yǎng)，促進微生物生長，提前進入指數(shù)生長期，從而加速對C18的降解[3，9]。

2.3.3油/水界面張力的變化

C18及添加SLG的C18培養(yǎng)基溶液的油/水界面張力(σ)隨降解時間(t)的變化如圖5所示。

由圖5可知，隨著降解的進行，2種培養(yǎng)基的油/水界面張力均不斷下降，6 d后降幅趨緩；添加SLG的C18培養(yǎng)基溶液的油/水界面張力明顯低于未添加者。表明，SLG與模擬油C18中界面活性組分產(chǎn)生了協(xié)同效應，SLG為陰離子表面活性劑，可有效降低油/水界面張力，增大難溶底物C18的溶解度，使油狀物的大顆粒分散為小顆粒，增大了微生物與C18的接觸面積，從而促進C18的生物降解[10-11]。

圖5　培養(yǎng)基的油/水界面張力隨降解時間的變化

烴類化合物(如長碳鏈的環(huán)烷烴)在降解過程中，其憎水性是微生物進行代謝、降解的主要障礙，而SLG作為一種表面活性劑，可促進烴類乳化并被動擴散進入細胞內(nèi)，加速烴類物質(zhì)降解。同時，SLG含有N、P元素，還可在微生物降解C18的過程中為其提供養(yǎng)分，促進微生物生長，提高難降解底物的生物降解性能[12-13]。

3結論

以十二烷基環(huán)己烷模擬礦物潤滑油、以混合菌群為降解微生物，采用氣相色譜法考察月桂?；劝彼徕c對十二烷基環(huán)己烷生物降解性的影響。結果表明，馴化后的混合菌群可有效降解C18，降解率可達79.68%；在添加SLG的C18培養(yǎng)基中，混合菌群先降解SLG，待SLG降解完畢再降解C18；SLG可提高混合菌群對C18的生物降解率，主要歸因于兩方面：一是SLG可為微生物提供營養(yǎng)，使微生物大量繁殖，提前進入指數(shù)生長期，提高C18的降解率；二是具有表面活性的SLG可降低培養(yǎng)基溶液的油/水界面張力，增大微生物與C18的接觸面積，促進C18的生物降解。

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Mechanism of Enhanced Bioremediation of Oil Pollution by Sodium Lauroyl Glutamate

GAO Ling-yue1，ZHANG Nan2，CHEN Bo-shui1，OU Yi-xi3，LUOSANG Yin-ba4

(1.DepartmentofOilApplication&ManagementEngineering,LogisticalEngineeringUniversity,Chongqing401311,China;2.DepartmentofMilitaryArchitecturalPlanning&EnvironmentalEngineering,LogisticalEngineeringUniversity,Chongqing401311,China;3.DepartmentofCivilEngineering,LogisticalEngineeringUniversity,Chongqing401311,China;4.Unit95526,Lhasa850000,China)

Abstract：Using dodecylcyclohexane as a model mineral lubricating oil,mixed microflora as degradation microorganisms,the effects of sodium lauroylg lutamate(SLG) on biodegradation of dodecylcyclohexane were investigated by gas chromatography.Furthermore,the biodegradation products,the growth of microorganisms in degradation process and the oil/water interfacial tension of the culture media were analyzed by gas chromatography-mass spectrometry(GC-MS),UV-visible spectrophotometer and surface tensionmeter.The mechanism of enhanced biodegradation of dodecylcyclohexane by SLG was also analyzed.Results indicated that,SLG primarily decomposed during biodegradation process,then SLG could enhance biodegradation of dodecylcyclohexane by reducing the oil/water interfacial tension and promoting growth of microorganisms as nutrient.

Keywords：sodium lauroyl glutamate;mineral lubricating oil;dodecylcyclohexane;biodegradation;bioremediation;mechanism

中圖分類號：X 506

文獻標識碼：A

文章編號：1672-5425(2016)04-0022-04

doi：10.3969/j.issn.1672-5425.2016.04.006

作者簡介：高菱悅(1991-)，女，遼寧沈陽人，碩士研究生，研究方向：環(huán)境友好潤滑劑，E-mail：18611989249@163.com；通訊作者：陳波水，教授，博士生導師，E-mail：boshuichen@163.com。

收稿日期：2015-12-15

基金項目：國家自然科學基金資助項目(50975282)，重慶市自然科學基金資助項目(OSTC，2014JCYJAA50021)