王茂淋，程萬里，余　晨，張吉斌

(華中農業(yè)大學生命科學技術學院 農業(yè)微生物學國家重點實驗室，湖北 武漢 430070)

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抗恥垢分枝桿菌菌株的篩選及活性物質的初步研究

王茂淋，程萬里，余晨，張吉斌

(華中農業(yè)大學生命科學技術學院 農業(yè)微生物學國家重點實驗室，湖北 武漢 430070)

摘要：從80株深海細菌和425株植物根際細菌中分離得到2株對恥垢分枝桿菌有穩(wěn)定拮抗作用的細菌，其中多粘類芽胞桿菌KM2501-1的拮抗效果最佳；對其活性物質的理化性質進行研究，發(fā)現(xiàn)該活性物質能被硫酸銨沉淀、耐高溫、對部分蛋白酶敏感、在pH值2.0～8.0范圍內和紫外環(huán)境下穩(wěn)定，分子量在10～30 kDa之間，初步判斷該活性物質可能是蛋白類物質；對該活性物質進行初步分離純化，SDS-PAGE電泳結果顯示，該活性物質中有蛋白存在；初步純化的蛋白類活性物質的最小抑菌濃度在125～250 μg·mL-1之間，具有深入研究的價值。

關鍵詞：多粘類芽胞桿菌；恥垢分枝桿菌；理化特性；最小抑菌濃度；耐高溫蛋白

恥垢分枝桿菌常作為研究結核分枝桿菌的模式菌株。結核分枝桿菌引起的結核病是一種導致人類死亡的第二大類傳染性疾病，嚴重威脅人類健康[1]。結核病缺乏相關有效的疫苗且新藥開發(fā)較慢，使得結核和廣泛耐藥結核在我國流行，目前，我國已是耐多藥結核負擔最重的國家。耐多藥結核是結核病防治的重大難題[2-4]，所以開發(fā)新的抗結核藥物迫在眉睫。

多粘類芽胞桿菌(Paenibacillus polymyxa)是一種產芽胞的革蘭氏陽性細菌。1993年，Ash等[5]將其從芽胞桿菌屬中獨立出來，成立類芽胞桿菌屬。多粘類芽胞桿菌的代謝產物非常豐富，如抗菌物質、植物激素類、酶類以及絮凝劑等，大多為蛋白質、多糖、多肽等[6]。Rastogi等[7]發(fā)現(xiàn)，多粘類芽胞桿菌產生的多粘菌素E對結核分枝桿菌有很好的防治作用；Khan等[8]發(fā)現(xiàn)，從多粘類芽胞桿菌發(fā)酵上清液中提取的物質具有防治根結線蟲的作用。但是多粘類芽胞桿菌中對分枝桿菌有抑制作用的蛋白類代謝產物還未見報道。

鑒于此，作者從80株深海細菌和425株植物根際細菌中篩選出抗恥垢分枝桿菌菌珠，研究其活性物質的理化性質，并進行初步純化，評價其抑菌活性，擬為進一步研究奠定基礎。

1實驗

1.1菌種與培養(yǎng)基

病原指示菌：恥垢分枝桿菌(Mycobacterium smegmatis)MC2 155，由華中農業(yè)大學何正國教授課題組提供。

植物根際細菌：多粘類芽胞桿菌(Paenibacillus polymyxa)KM2501-1，分離自江西湖口有機復合污染地區(qū)植物毛茛根際，由華中農業(yè)大學張吉斌教授課題組分離并鑒定。

植物根際細菌培養(yǎng)基(KMB)：20g胰蛋白胨，1.5gK2HPO4，1.5gMgSO4·7H2O，10mL甘油，定容至1L，pH值調至7.4。

恥垢分枝桿菌液體培養(yǎng)基(7H9)：稱取0.47g7H9肉湯基礎至100mL蒸餾水中，添加0.2mL甘油和0.05mL吐溫80。

恥垢分枝桿菌固體培養(yǎng)基(7H10)：稱取3.8g7H10瓊脂基礎至200mL蒸餾水中，添加1mL甘油。

1.2方法

1.2.1抗恥垢分枝桿菌菌株的篩選

將深海細菌和植物根際細菌分別接種于對應的培養(yǎng)基中發(fā)酵48 h，離心取上清液；向2 mLOD600值為0.1左右的恥垢分枝桿菌懸液中加入0.5 mL過濾除菌的發(fā)酵上清液，于37 ℃、180 r·min-1共培養(yǎng)40 h，測定終止OD600值并判斷抑菌活性，每個實驗重復3次。以終濃度為100 μg·mL-1的異煙肼作陽性對照，加入相同體積的培養(yǎng)基作陰性對照。

1.2.2多粘類芽胞桿菌KM2501-1活性物質的理化特性分析

(1)溫度處理

取KM2501-1發(fā)酵上清液，分別在溫度為4 ℃、37 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃、80 ℃、90 ℃和100 ℃的條件下處理60 min，然后冷卻至室溫(25 ℃)，測試抑菌活性。

(2)酸堿處理

室溫下取KM2501-1發(fā)酵上清液，用鹽酸或氫氧化鈉將pH值分別調至2.0、4.0、6.0、8.0、10.0、12.0，溫育3 h，然后用鹽酸或氫氧化鈉將各組樣品的pH值復調到初始值5.6，測試抑菌活性。

(3)紫外線照射處理

取0.5 mL KM2501-1發(fā)酵上清液至2 mL離心管中，在距紫外燈(24 W)50 cm處分別照射處理30 min、60 min、90 min、120 min，測試抑菌活性。

(4)蛋白酶處理

分別用終濃度為1 mg·mL-1的蛋白酶K、胰蛋白酶和胃蛋白酶處理KM2501-1發(fā)酵上清液3 h后，將pH值全部調至6，測試抑菌活性。其中蛋白酶K處理條件為pH值8.0、37 ℃；胰蛋白酶處理條件為pH值8.0、37 ℃；胃蛋白酶處理條件為pH值4.5、37 ℃。

(5)超濾管處理

取KM2501-1發(fā)酵上清液5 mL，用100 kDa的超濾管超濾處理后分別測試截留液和濾過液的抑菌活性；然后將100 kDa的濾過液用50 kDa的超濾管超濾處理，分別測試截留液和濾過液的抑菌活性；用同樣的方法依次用30 kDa、10 kDa和3 kDa的超濾管超濾處理。以原始上清液作對照，測試抑菌活性，并判斷活性物質的分子量范圍。

(6)硫酸銨沉淀

取KM2501-1在28 ℃、180 r·min-1發(fā)酵48 h的發(fā)酵上清液，采用梯度鹽析法，分別收集0%～30%、30%～70%硫酸銨沉淀物和70%硫酸銨沉淀上清液，并以恥垢分枝桿菌為指示菌，采用牛津杯法測量抑菌圈直徑。

1.2.3多粘類芽胞桿菌KM2501-1活性物質的初步分離純化

(1)分離純化

硫酸銨沉淀：取KM2501-1在28 ℃、180 r·min-1發(fā)酵48 h的發(fā)酵上清液，收集70%硫酸銨沉淀物，用蒸餾水復溶后透析。

高溫處理：取上述70%硫酸銨沉淀物復溶透析液，于100 ℃高溫處理60 min后離心，取上清液。

(2)抑菌活性和蛋白純度的測定

按1.2.1所述的共培養(yǎng)法測試活性物質的抑菌活性；取分離純化上清液進行SDS-PAGE電泳，測定活性物質的蛋白純度。

1.2.4活性蛋白的抑菌活性分析

將得到的活性蛋白凍干，稱量，分別配制成不同濃度，按1.2.1所述的共培養(yǎng)法測定活性蛋白的最小抑菌濃度。

2結果與討論

2.1抗恥垢分枝桿菌菌株的篩選

對80株深海細菌和425株植物根際細菌抗恥垢分枝桿菌進行篩選，部分結果見表1。

表1

抗恥垢分枝桿菌菌株篩選的部分結果

Tab.1

Partial screening results of the bacteria

注：“-”表示發(fā)酵上清液不能抑制恥垢分枝桿菌生長；“+”表示發(fā)酵上清液能抑制恥垢分枝桿菌生長?！?”表示OD600差值>0.7；“+”表示OD600差值=0.5～0.7；“++”表示OD600差值=0.3～0.5；“+++”表示OD600差值=0.1～0.3；“++++”表示OD600差值<0.1。表4同。

由表1可知，多粘類芽胞桿菌KM2501-1和假單胞菌KY5406的發(fā)酵上清液都對恥垢分枝桿菌有較好的拮抗作用，其中多粘類芽胞桿菌KM2501-1的發(fā)酵上清液的拮抗效果最好，可用于后續(xù)進一步研究。

2.2多粘類芽胞桿菌KM2501-1活性物質的特性分析

2.2.1對溫度的敏感性(圖1)

圖1　不同溫度處理后的KM2501-1發(fā)酵上清液的抑菌效果

由圖1可以看出，KM2501-1發(fā)酵上清液對溫度不敏感，100 ℃處理60 min對抑菌活性有一定影響，但影響不明顯。表明該活性物質較穩(wěn)定，在高溫下不易失活。

2.2.2對酸、堿的敏感性(圖2)

圖2　不同pH值處理后的KM2501-1發(fā)酵上清液的抑菌效果

由圖2可以看出，KM2501-1發(fā)酵上清液的抑菌活性在pH值2.0～8.0范圍內都是穩(wěn)定的，但pH值達到10.0以后就沒有抑菌活性了。表明該活性物質在堿性環(huán)境下不穩(wěn)定。

2.2.3對紫外線照射的敏感性(圖3)

圖3　紫外線照射不同時間后的KM2501-1

由圖3可以看出，KM2501-1發(fā)酵上清液經過120 min的紫外線照射后，其抑菌活性未受到影響。表明該活性物質在紫外環(huán)境下較穩(wěn)定。

2.2.4對蛋白酶的敏感性(表2)

由表2可知，KM2501-1發(fā)酵上清液經過蛋白酶K和胰蛋白酶處理后失去抑菌活性，而經胃蛋白酶處理后仍然保持較高的抑菌活性；該活性物質對蛋白酶K和胰蛋白酶敏感，對胃蛋白酶不敏感。表明該活性物質可能是蛋白類物質。

表2

不同蛋白酶處理后的KM2501-1發(fā)酵上清液的抑菌效果

Tab.2Antibacterial effect of fermentation surpernatant of

KM2501-1 treated by different proteases

2.2.5分子量大小

梯度超濾處理KM2501-1發(fā)酵上清液，結果發(fā)現(xiàn)，抑菌活性物質可以通過30 kDa的超濾管，但不能通過10 kDa的超濾管，表明該抑菌活性物質的分子量為10～30 kDa。

綜合以上理化特性實驗結果，可以初步推斷該活性物質是一個耐高溫蛋白。

2.2.6硫酸銨沉淀物對恥垢分枝桿菌的抑菌活性(表3)

表3

KM2501-1發(fā)酵上清液的硫酸銨沉淀物的抑菌效果

Tab.3Antibacterial effect of ammonium sulfate precipitation

of fermentation surpernatant of KM2501-1

注：原始發(fā)酵上清液的抑菌圈直徑為11.2 mm。

由表3可知，活性物質主要集中在30%～70%的硫酸銨沉淀物中。表明該活性物質可以被硫酸銨沉淀下來，可能為蛋白類物質。

2.3多粘類芽胞桿菌KM2501-1活性物質分離純化后的抑菌活性及純度

通過分析活性物質的理化特性，初步鑒定該活性物質為耐高溫蛋白，故采用耐高溫蛋白的方法對活性物質進行分離純化，并進行抑菌活性測試。

2.3.1抑菌活性(表4)

表4

KM2501-1活性物質不同分離純化階段的抑菌活性

Tab.4Antibacterial activity of the active substance of

KM2501-1 at different purification stages

由表4可知，活性物質在不同分離純化階段均有很高的抑菌活性。表明該活性物質一直在純化樣品中。

2.3.2純度

采用SDS-PAGE檢測活性物質分離純化后的純度，結果見圖4。

M.蛋白質標記　1.硫酸銨沉淀物復溶后沉淀　2.硫酸銨沉淀物

由圖4可以看出，硫酸銨沉淀物復溶高溫處理后離心上清液的SDS-PAGE圖譜中有兩條分子量介于18.4～25.0 kDa之間的蛋白條帶(條帶3)，與理化特性分析中活性物質的分子量相吻合。因此，可以推斷該活性物質很有可能是這兩個耐高溫蛋白中的某一個或者兩個。

2.4活性蛋白對恥垢分枝桿菌的抑菌活性(表5)

由表5可以看出，當初步純化的活性物質濃度大于250 μg·mL-1時，對恥垢分枝桿菌具有較高的抑菌活性；當活性物質濃度小于125 μg·mL-1時，對恥垢分枝桿菌沒有抑菌活性。說明初步純化的活性物質的最小抑菌濃度在125～250 μg·mL-1之間，抑菌效果良好。

3結論

從80株深海細菌和425株植物根際細菌中分離得到2株對恥垢分枝桿菌有穩(wěn)定拮抗作用的細菌，其中多粘類芽胞桿菌KM2501-1的拮抗效果最佳；其發(fā)酵上清液具有穩(wěn)定拮抗恥垢分枝桿菌的活性。對KM2501-1發(fā)酵上清液中的活性物質的理化特性進行了研究，結果表明，該活性物質分子量在10～30 kDa之間，耐高溫，在pH值為2.0～8.0時穩(wěn)定，對部分蛋白酶敏感，能耐受紫外線，能被硫酸銨沉淀；據(jù)此初步判斷該活性物質是一個耐高溫蛋白。

對活性物質進行了初步的分離純化，最終得到了分子量在18.4～25.0 kDa之間的蛋白。該初步純化蛋白的最小抑菌濃度在125～250 μg·mL-1之間，抑菌效果良好。

表5不同濃度初步純化活性物質對恥垢分枝桿菌的抑菌活性

Tab.5

Antibacterial activity of different concentrations of

注：“+”表示具有抑菌活性，“-”表示沒有抑菌活性。

參考文獻：

[1]World Health Organization.Global Tuberculosis Report[M].Gav-ena：WHO Press，2014:1-155.

[2]OKADA K，ONOZAKI I，YAMADA N，et aL.Epidemiological impact of mass tuberculosis screening：A 2-year follow-up after a national prevalence survey[J].The International Journal of Tuberculosis and Lung Disease，2012,16(12):1619-1624.

[3]KOLAPPAN C，SUBRAMANI R，CHANDRASEKARAN V，et al.Trend in tuberculosis infection prevalence in a rural area in south India after implementation of the DOTS strategy[J].The International Journal of Tuberculosis and Lung Disease，2012,16(10):1315-1319.

[4]MAGEE M J，BLUMBERG H M，BROZ D,et al.Prevalence of drug resistant tuberculosis among patients at high-risk for HIV attending outpatient clinics in Delhi，India[J].The Southeast Asian Journal of Tropical Medicine and Public Health，2012,43(2):354-363.

[5]ASH C，PRIEST F G，COLLINS M D.Molecular identification of rRNA group 3 bacilli(Ash，F(xiàn)arrow,Wallbanks and Collins)using a PCR probe test[J].Antonie van Leeuwenhoek，1993,64(3-4):253-260.

[6]楊少波，劉訓理.多粘類芽孢桿菌及其產生的生物活性物質研究進展[J].微生物學通報，2008,35(10):1621-1625.

[7]RASTOGI N,POTAR M C,DAVID H L.Antimycobacterial specterum of colistin(polymyxin E)[J].Annales de l′Institut Pasteur/Microbiologie,1986,137(1A)：45-53.

[8]KHAN Z,KIM S G,JEON Y H,et al.A plant growth promoting rhizobacterium,Paenibacilluspolymyxastrain GBR-1,suppresses root-knot nematode[J].Bioresource Technology,2008,99(8):3016-3023.

Screening of Bacteria AgainstMycobacteriumSmegmatisand Preliminary Study on Its Active Substance

WANG Mao-lin，CHENG Wan-li，YU Chen，ZHANG Ji-bin

(StateKeyLaboratoryofAgriculturalMicrobiology,CollegeofLifeScienceandTechnology,HuazhongAgriculturalUniversity,Wuhan430070,China)

Abstract：Two bacteria with stable antagonistic activity against Mycobacterium smegmatis were screened from 80 deep sea bacteria and 425 plant rhizosphere bacteria,in which Paenibacillus polymyxa KM2501-1 had the strongest antagonistic activity.The physicochemical properties of the active substance produced by KM2501-1 were studied.Results showed that,the active substance could be precipitated by ammonium sulfate,it was thermostable,sensitive to some proteases,stable in pH value range of 2.0～8.0 and UV irradiation,and its molecule weight was 10～30 kDa.So the preliminary research results showed that the active substance might be a protein.Then preliminary isolation and purification of the active substance and the SDS-PAGE results showed that there were proteins in the active substance.The minimal inhibitory concentration of the preliminary purified active substance against M.smegmatis was between 125 μg·mL-1and 250 μg·mL-1.It has potential for futher study.

Keywords：Paenibacillus polymyxa;Mycobacterium smegmatis;physicochemical property;minimal inhibitory concentration;high-temperature resistance protein

中圖分類號：Q 939.9

文獻標識碼：A

文章編號：1672-5425(2016)04-0041-05

doi：10.3969/j.issn.1672-5425.2016.04.011

作者簡介：王茂淋(1989-)，女，貴州六盤水人，碩士研究生，研究方向：微生物工程與制劑，E-mail：wmmmlll@163.com；通訊作者：張吉斌，教授，E-mail：zhangjb05@163.com。

收稿日期：2016-01-21