帥超群，向極釬，談　弋，楊永康，殷紅清，覃大吉，陳菲菲

(1.武漢大學(xué)藥學(xué)院，湖北 武漢 430072；2.恩施清江生物工程有限公司，湖北 恩施 445000；3.恩施州農(nóng)科院藥物與園藝研究所，湖北 恩施 445000；4.恩施州硒應(yīng)用技術(shù)與產(chǎn)品開發(fā)研究院，湖北 恩施 445000)

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恩施州漁塘壩硒礦區(qū)天然高富硒微生物的篩選與鑒定

帥超群1,2,4，向極釬2,4，談弋1，楊永康2，3，殷紅清2,4，覃大吉2,3，陳菲菲2,3

(1.武漢大學(xué)藥學(xué)院，湖北 武漢 430072；2.恩施清江生物工程有限公司，湖北 恩施 445000；3.恩施州農(nóng)科院藥物與園藝研究所，湖北 恩施 445000；4.恩施州硒應(yīng)用技術(shù)與產(chǎn)品開發(fā)研究院，湖北 恩施 445000)

摘要：采用富集培養(yǎng)及平板劃線法分離恩施州漁塘壩硒礦區(qū)中天然高富硒微生物。通過在基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中添加不同濃度亞硒酸鈉，篩選出一株高富硒微生物XS-1，該菌株培養(yǎng)物最高硒含量可達(dá)34 782.52×10-6。通過形態(tài)學(xué)觀察及ITS序列分析鑒定該菌株為異常威克漢姆酵母(Wickerhamomyces anomalus)，對硒具有極高的耐受及富集能力。

關(guān)鍵詞：硒礦區(qū)；富硒微生物；篩選；鑒定

硒是動(dòng)物生長必不可少的微量元素，是人體多種功能酶的活性中心，如谷胱甘肽過氧化物酶(GPx)家族[1]、脫碘酶(ID)家族[2]等，在機(jī)體抗氧化、提高免疫力等方面發(fā)揮著重要的作用。

世界上包括中國在內(nèi)的40多個(gè)國家和地區(qū)屬于缺硒地區(qū)。據(jù)《地方疾病與環(huán)境因素圖集》記載，我國72%地區(qū)屬于低硒地區(qū)，其中30%為嚴(yán)重缺硒地區(qū)。

缺硒可能導(dǎo)致癌癥、心肌梗塞等多種疾病的發(fā)生，通過膳食攝取足夠的硒可起到預(yù)防相關(guān)疾病的作用[3]。大部分天然食物中的硒含量極低，遠(yuǎn)不能滿足人體正常需求?，F(xiàn)有補(bǔ)硒方式主要為食用富硒保健品、富硒食物等，根據(jù)硒的形態(tài)將硒源分為無機(jī)硒源和有機(jī)硒源。無機(jī)硒毒性高、吸收率低、環(huán)境污染大；有機(jī)硒毒性低、吸收率高、環(huán)境污染小[4]。因此，有機(jī)硒是今后補(bǔ)硒的主要方式。目前有機(jī)硒源主要為微生物，即利用傳統(tǒng)的食用菌或者已經(jīng)馴化的真菌資源，進(jìn)行人工補(bǔ)硒誘導(dǎo)培養(yǎng)以獲得具有高耐受力、強(qiáng)富硒力的菌株[5-7]。但目前人工培育菌株大多存在穩(wěn)定性較差、富硒能力有限、生產(chǎn)成本較高等問題。

恩施被譽(yù)為“世界硒都”，恩施州恩施市雙河鄉(xiāng)漁塘壩是迄今為止全球唯一探明的獨(dú)立硒礦床所在地。漁塘壩核心礦區(qū)礦石中硒含量均值為3 637.5×10-6，最高硒含量達(dá)6 300×10-6，為硒地殼豐度(0.05×10-6)的171 800倍。恩施硒礦床的發(fā)現(xiàn)，改寫了“硒不能形成獨(dú)立工業(yè)礦床”的學(xué)術(shù)界論斷[8]。

作者對漁塘壩硒礦區(qū)中微生物進(jìn)行篩選，并對其進(jìn)行鑒定，以期發(fā)現(xiàn)天然高富硒微生物，為有機(jī)硒源微生物的開發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1實(shí)驗(yàn)

1.1材料與培養(yǎng)基

土壤、水體均取自漁塘壩硒礦區(qū)內(nèi)。土壤取樣點(diǎn)為硒礦坑內(nèi)外，水體取樣點(diǎn)為硒礦坑附近河溝小溪。

富集培養(yǎng)基：肉湯培養(yǎng)基、PD培養(yǎng)基、黃豆芽汁培養(yǎng)基。

分離培養(yǎng)基：牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基、孟加拉紅培養(yǎng)基、PDA培養(yǎng)基。各類培養(yǎng)基中亞硒酸鈉濃度梯度為1 000×10-6、2 000×10-6、4 000×10-6、8 000×10-6、16 000×10-6、32 000×10-6。

種子培養(yǎng)基：PD培養(yǎng)基。

發(fā)酵培養(yǎng)基：PD培養(yǎng)基中添加亞硒酸鈉，起始濃度為2 000×10-6。

1.2方法

1.2.1分離純化

1)采集漁塘壩硒礦坑內(nèi)土樣6份、水樣2份，坑前土樣9份，礦坑下行100m出水溝水樣1份，礦坑附近三角洲處水樣3份、巖石樣3份、水中腐殖物5份，礦坑木橋下水溝中水體附著物1份。將采集的樣本預(yù)處理后進(jìn)行富集培養(yǎng)。富集培養(yǎng)條件：肉湯培養(yǎng)基為25 ℃、100r·min-1、24h；PD培養(yǎng)基、黃豆芽汁培養(yǎng)基為25 ℃、100r·min-1、48h。

2)富集完成后，肉湯培養(yǎng)基中培養(yǎng)物采用稀釋平板法接種到各個(gè)亞硒酸鈉濃度梯度的牛肉膏蛋白胨瓊脂平板上進(jìn)行分離純化；PD培養(yǎng)基中培養(yǎng)物采用稀釋平板法接種到各個(gè)亞硒酸鈉濃度梯度的PDA平板上進(jìn)行分離純化；黃豆芽汁培養(yǎng)基中培養(yǎng)物采用稀釋平板法接種到各個(gè)亞硒酸鈉濃度梯度的孟加拉紅平板上進(jìn)行分離純化。

3)接種完畢后，將各接種平板轉(zhuǎn)入培養(yǎng)室中于25 ℃、自然光照下培養(yǎng)5～7d后，觀察不同平板上菌落生長狀況，選取有菌落生長的最高亞硒酸鈉濃度的平板培養(yǎng)物，對其采用平板劃線法再次進(jìn)行分離純化，重復(fù)分離純化直至菌落形態(tài)一致時(shí)，作為預(yù)發(fā)酵菌株備用。

1.2.2菌株篩選

將預(yù)發(fā)酵菌株接入種子培養(yǎng)基中于25 ℃、100r·min-1搖瓶培養(yǎng)5d，再接入2 000×10-6亞硒酸鈉發(fā)酵培養(yǎng)基中于25 ℃、100r·min-1搖瓶培養(yǎng)5d，離心，取沉淀，用蒸餾水清洗3遍，50 ℃烘干，檢測硒含量。選取硒含量最高的1～2種菌株作為目標(biāo)菌株。

1.2.3菌種鑒定

對篩選的目標(biāo)菌株進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察和ITS序列分析。

1)形態(tài)學(xué)觀察

將目標(biāo)菌株接種于PDA平板上，25 ℃、黑暗條件下培養(yǎng)7d，觀察并記錄菌落形態(tài)、質(zhì)地和顏色等特征。在高倍顯微鏡下觀察菌株形態(tài)。

2)ITS序列分析

采用CTAB法提取DNA，將DNA的OD260/OD280值調(diào)至1.6～1.8之間進(jìn)行PCR擴(kuò)增。ITS序列擴(kuò)增引物為：正向ITS4，反向ITS5。50μLPCR反應(yīng)體系為：ddH2O37.2μL、10×Buffer5.0μL、dNTPs3.0μL、Primer1.6μL、DNA3.0μL(30ng)、Taq酶 0.2μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃ 5min；94 ℃ 45s，36 ℃ 45s，72 ℃ 45s，共35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 5min。將PCR產(chǎn)物回收，送生工生物工程股份有限公司測序，測序結(jié)果提交GenBank進(jìn)行比對分析。

2結(jié)果與討論

2.1分離純化

各樣本富集培養(yǎng)物在32 000×10-6亞硒酸鈉平板上均有菌落生成，表明礦區(qū)不同環(huán)境中均存在硒耐受微生物。不同培養(yǎng)基菌落生長狀況如表1所示。

由表1可知，孟加拉紅培養(yǎng)基中絮狀菌落及黏稠狀菌落均有生長，且與牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基和PDA培養(yǎng)基生長狀況相近，表明含亞硒酸鈉的不同培養(yǎng)基可能具有篩選一致性。

2.2菌株篩選

選擇在最高亞硒酸鈉濃度的培養(yǎng)基中生長狀況良好的菌株進(jìn)行搖瓶培養(yǎng)，2 000×10-6亞硒酸鈉培養(yǎng)基中菌落形態(tài)及培養(yǎng)物硒含量如表2所示。

由表2可知，在32 000×10-6亞硒酸鈉平板上生長情況較好的5株菌株在2 000×10-6亞硒酸鈉培養(yǎng)基搖瓶培養(yǎng)中的形態(tài)差異明顯，渾濁狀、米粒狀、蠶豆?fàn)?、異型等形態(tài)均有出現(xiàn)；對硒的富集能力也有顯著差異(圖1)。對BP6-1菌株進(jìn)一步測試表明，其培養(yǎng)物硒含量可達(dá)34 782.52×10-6。

表1

不同培養(yǎng)基中菌落生長狀況

Tab.1

Growth status of colonies in different media

表2

2000×10-6亞硒酸鈉培養(yǎng)基搖瓶培養(yǎng)中菌落形態(tài)及培養(yǎng)物硒含量

Tab.2

Morphology of colonies and selenium content of shake flask culture in medium containing 2000×10-6 sodium selenite

注：BP6-1、BP6-16、BP6-13、BP6-24、BP6-18為在32 000×10-6亞硒酸鈉平板上生長情況較好的5株菌株。

2.3菌種鑒定

2.3.1形態(tài)學(xué)特征(圖2)

菌株BP6-1在PDA平板上生長較快，25 ℃、黑暗條件下培養(yǎng)7 d，菌落直徑達(dá)10～15 mm，正反面和邊緣、中央部位的顏色均為白色，質(zhì)地均勻，邊緣整齊(圖2a)；其顯微特征為：菌株形態(tài)為球狀，直徑25.0～50.0 μm，無鞭毛，不能游動(dòng)，多邊芽殖(圖2b，圖2c)。

圖1　不同微生物培養(yǎng)物中的硒含量

2.3.2ITS序列分析

經(jīng)PCR擴(kuò)增后菌株BP6-1的ITS序列全長602 bp(KU301793)，GenBank比對分析結(jié)果顯示，該序列與異常威克漢姆酵母(Wickerhamomycesanomalus)(GQ376076.1)的相似性為99%。

綜上，菌株BP6-1可鑒定為異常威克漢姆酵母(Wickerhamomycesanomalus)，命名為XS-1。

2.4討論

微生物對極端環(huán)境有著極強(qiáng)的耐受性，且往往對極端環(huán)境具有極強(qiáng)的改造性[9]。漁塘壩屬于礦質(zhì)極端環(huán)境，2008年，中國科學(xué)院地球化學(xué)研究所對漁塘壩微生物形態(tài)硒或硒化物的形成機(jī)理開展研究，證實(shí)了硒化物微體化石的細(xì)菌成因，提出微生物充當(dāng)“冶煉師”的角色。本研究在分離純化過程中發(fā)現(xiàn)多種耐、富硒微生物，從旁佐證了上述研究結(jié)果。

本研究發(fā)現(xiàn)，硒對部分微生物的搖瓶生長形態(tài)影響顯著，搖瓶培養(yǎng)物出現(xiàn)畸變現(xiàn)象。如菌株BP6-18在種子培養(yǎng)基中，菌球近圓形，但在亞硒酸鈉發(fā)酵培養(yǎng)基中則出現(xiàn)扁形、長條形等多種異形菌體(2-E)，甚至還有菌體聚合的現(xiàn)象發(fā)生。表明部分菌株對硒敏感性較大。硒對微生物的畸變作用機(jī)理有待進(jìn)一步研究。

本研究分離篩選出的天然高富硒微生物XS-1屬異常威克漢姆酵母(Wickerhamomycesanomalus)，其培養(yǎng)物硒含量可達(dá)34 782.52×10-6。該酵母在發(fā)酵領(lǐng)域應(yīng)用十分廣泛，被譽(yù)為“生香酵母”，本研究也發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)液均有異香散發(fā)。該酵母的“生香”及“超富硒”能力，預(yù)示其在食品領(lǐng)域具有極好的市場應(yīng)用前景，開發(fā)潛力巨大。

3結(jié)論

通過富集培養(yǎng)及平板劃線法從恩施州漁塘壩硒礦區(qū)篩選出一株高富硒微生物XS-1，該菌株屬異常威克漢姆酵母(Wickerhamomycesanomalus)，培養(yǎng)物最高硒含量可達(dá)34 782.52×10-6，對硒具有極高的耐受和富集能力。

本研究雖篩選出天然高富硒微生物XS-1，但對其培養(yǎng)物中硒的形態(tài)未做深入研究，而富硒微生物中硒的形態(tài)特征對理論研究和實(shí)際應(yīng)用均有重大價(jià)值；該菌株所具有的高硒富集能力，必然有其特殊的代謝轉(zhuǎn)化機(jī)理，對它的深入研究同樣有著較大的理論價(jià)值。對上述兩個(gè)問題進(jìn)行研究探索，將進(jìn)一步為天然高富硒微生物的開發(fā)應(yīng)用奠定堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。

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Screening and Identification of Natural Selenium Super-Enriched Microorganisms in Enshi Yutangba′s Selenium Ore Area

SHUAI Chao-qun1,2,4,XIANG Ji-qian2,4,TAN Yi1,YANG Yong-kang2，3,YIN Hong-qing2,4,QIN Da-ji2,3,CHEN Fei-fei2,3

(1.SchoolofPharmaceuticalSciences,WuhanUniversity,Wuhan430072,China;2.EnshiQingjiangBio-EngineeringCo.,Ltd.,Enshi445000,China;3.MedicineandHorticulturalResearchInstitute,EnshiAcademyofAgriculturalSciences,Enshi445000,China;4.EnshiSeleniumInstituteofAppliedTechnologyandProductDevelopment,Enshi445000,China)

Abstract：The natural selenium super-enriched microorganisms in Enshi Yutangba′s selenium ore area were isolated by enrichment culture and streak plate methods.The selenium super-enriched microorganism XS-1 was screened by adding different concentrations of sodium selenite into the fermentation medium,and the highest selenium content in the fermentation products was 34 782.52×10-6.The microorganism XS-1 was identified to be Wickerhamomyces anomalus by morphological observation and ITS sequence analysis.This microorganism has high tolerance and enrichment capacity to selenium.

Keywords：selenium ore area；selenium enriched microorganism；screening；identification

中圖分類號：TQ 920.1

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：1672-5425(2016)04-0051-04

doi：10.3969/j.issn.1672-5425.2016.04.013

作者簡介：帥超群(1987-)，男，湖北荊門人，初級農(nóng)藝師，研究方向：功能微生物的開發(fā)與利用，E-mail：woshiscq@163.com。

收稿日期：2015-12-22

基金項(xiàng)目：湖北省科技支撐計(jì)劃資助項(xiàng)目(2013BEC048)