汪雪峰，舒　 揚(yáng)，汪　毅，周月鵬，毛朝明

(江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院1.中心實(shí)驗(yàn)室；2.核醫(yī)學(xué)科，江蘇 鎮(zhèn)江　212001)

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◇臨床醫(yī)學(xué)◇

FlowCytomix檢測(cè)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者細(xì)胞因子表達(dá)譜

汪雪峰1,2，舒 揚(yáng)1,2，汪毅1，周月鵬2，毛朝明2

(江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院1.中心實(shí)驗(yàn)室；2.核醫(yī)學(xué)科，江蘇 鎮(zhèn)江212001)

摘要：目的應(yīng)用FlowCytomix檢測(cè)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者(RA)細(xì)胞因子表達(dá)譜，探討其在RA發(fā)病及治療中的作用。方法分離RA患者及健康對(duì)照者外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMCs)，經(jīng)PHA刺激后，收集細(xì)胞培養(yǎng)上清，F(xiàn)lowCytomix檢測(cè)上清中細(xì)胞因子濃度。結(jié)果與健康對(duì)照組相比，RA患者IL-17、IL-6、IL-1β、TNF-α水平均顯著升高(P<0.05)，但I(xiàn)FN-γ水平顯著降低(P<0.05)，IL-10水平無(wú)明顯改變。RA患者疾病活動(dòng)組IL-17、IL-6、IL-1β、TNF-α水平顯著高于緩解組(P<0.05)，但I(xiàn)FN-γ水平低于緩解組(P<0.05)；IL-17、IL-6、IL-1β、TNF-α、IFN-γ水平與DAS28評(píng)分顯著相關(guān)(P<0.05)。結(jié)論FlowCytomix多細(xì)胞因子檢測(cè)系統(tǒng)可特異、靈敏地檢測(cè)RA患者PBMCs中細(xì)胞因子產(chǎn)生，RA患者PBMCs中IL-17、IL-6、IL-1β、TNF-α水平反映了其關(guān)節(jié)的炎癥程度及活動(dòng)狀態(tài)。

關(guān)鍵詞：FlowCytomix；類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎；細(xì)胞因子表達(dá)譜

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(RA)是一種以慢性侵蝕性周圍關(guān)節(jié)炎為主要表現(xiàn)的自身免疫性疾病，致殘率高，已經(jīng)成為一種嚴(yán)重威脅人類健康的疾病[1]。RA的病因及發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚，大量的細(xì)胞因子參與RA的病理過(guò)程，RA患者的炎癥關(guān)節(jié)滑膜及滑液中，能檢測(cè)出大量的細(xì)胞因子，這些細(xì)胞因子所形成的“免疫網(wǎng)絡(luò)”促使滑膜組織慢性炎癥不斷遷延，最終引起軟骨和骨質(zhì)破壞等。因而，其中的一些細(xì)胞因子作為靶標(biāo)，通過(guò)封閉這些細(xì)胞因子從而治療RA。其中，白介素-1(IL-1)、白介素-6(IL-6)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)已經(jīng)作為RA患者炎癥狀態(tài)的指示劑[2-3]。因而單一的細(xì)胞因子檢測(cè)不能反映RA患者的免疫狀態(tài)及炎癥水平。FlowCytomix多細(xì)胞因子分析系統(tǒng)是將熒光標(biāo)記的微球與不同的抗體連接，抗體能與樣本中的不同細(xì)胞因子特異反應(yīng)，然后根據(jù)微球大小不同和熒光強(qiáng)度的不同，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)同一份樣本中各種細(xì)胞因子的表達(dá)。FlowCytomix能在一份小數(shù)量的樣本中同時(shí)檢測(cè)多種不同的細(xì)胞因子，同時(shí)減少樣本組間差異，減少樣本原料、分析時(shí)間、減少費(fèi)用及人為誤差等，特別在大樣本或稀少樣本的檢測(cè)方面是一種非常有用的工具。用FlowCytomix檢測(cè)RA患者外周血中多種細(xì)胞因子改變，對(duì)監(jiān)測(cè)RA患者的炎癥狀態(tài)，或?qū)χ委熕幬锏膽?yīng)答反應(yīng)具有重要的臨床意義。本研究用FlowCytomix檢測(cè)了RA患者外周血單個(gè)核細(xì)胞經(jīng)PHA刺激后多種細(xì)胞因子的分泌，旨在探討RA患者細(xì)胞因子的產(chǎn)生及其在RA發(fā)病中可能的作用。

1材料與方法

1.1材料選取2010年7月—2013年12月江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院就診的RA患者38例，年齡32～70歲，病例選擇均符合2009年美國(guó)風(fēng)濕病學(xué)會(huì)和歐洲抗風(fēng)濕聯(lián)盟(EULAR)提出的新RA分類標(biāo)準(zhǔn)和評(píng)分系統(tǒng)。根據(jù)28個(gè)關(guān)節(jié)的疾病活動(dòng)度評(píng)分(disease activity score in 28 joints, DAS28)評(píng)定疾病的活動(dòng)狀態(tài)。其中RA活動(dòng)組23例，其DAS28>5.1分，男6例，女17例，平均年齡(51.2±11.6)歲；RA緩解組15例，其DAS28<2.6分，男4例，女11例，平均年齡(48.5±12.7)歲；健康對(duì)照組20例，年齡35～71歲，所有RA患者及健康對(duì)照者無(wú)感染性疾病、惡性腫瘤、心血管或其他炎癥性疾病。研究對(duì)象均知情同意，并經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2主要儀器及試劑BD FACScan流式細(xì)胞儀、MAVM09608 Milipore 真空抽濾裝置(美國(guó)Milipore公司)、淋巴細(xì)胞分離液(濟(jì)南元興公司)及干擾素-γ(IFN-γ)、TNF-α、IL-17、IL-6、IL-1β、IL-10的FlowCytomix檢測(cè)試劑盒(奧地利Bender MedSystems公司)。

1.3外周血單個(gè)核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cells, PBMC)的制備采集各研究對(duì)象的空腹靜脈血5 mL，用Ficoll密度梯度離心法，按參考文獻(xiàn)[4]操作分離PBMC，收集細(xì)胞懸液備用。

1.4PBMCs培養(yǎng)上清中細(xì)胞因子檢測(cè)收集上述PBMCs，每孔2×105個(gè)細(xì)胞加入5 mg·L-1phytohaemagglutinin (PHA) 刺激24 h后，800×g離心10 min收集細(xì)胞培養(yǎng)上清，F(xiàn)lowCytomix Human Cytokine Kit(Bender MedSystems, Vienna, Austria)檢測(cè)上清中IFN-γ、TNF-α、IL-17、IL-6、IL-1β、IL-10。實(shí)驗(yàn)步驟按照產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.5流式細(xì)胞儀校準(zhǔn)儀器參數(shù)使用藻紅蛋白(phycoerythrin,PE)標(biāo)記的陽(yáng)性和陰性對(duì)照微球設(shè)定儀器參數(shù)。檢測(cè)前向散射光(FSC)、側(cè)向散射光(SSC)，調(diào)節(jié)熒光通道FL2、FL3的參數(shù)。經(jīng)FSC、SSC分析，微球分為兩群R1、R2，分別對(duì)應(yīng)于4.4 μm和5.5 μm，在FL2、FL3熒光通道下，根據(jù)熒光強(qiáng)度的不同分別分成11和9個(gè)微球群，因而在同一個(gè)熒光通道中，可以區(qū)分20種不同的細(xì)胞因子,見(jiàn)圖1。

圖1　 FlowCytomix校準(zhǔn)儀器的流式細(xì)胞圖

1.6細(xì)胞因子標(biāo)準(zhǔn)曲線的擬定用試劑盒中的細(xì)胞因子標(biāo)準(zhǔn)品，倍比稀釋后，測(cè)定的細(xì)胞因子值擬定標(biāo)準(zhǔn)曲線，曲線擬合fit均大于80%，cut off 值為30%,見(jiàn)圖2。

1.7數(shù)據(jù)分析及統(tǒng)計(jì)學(xué)方法將FACS Calibur流式細(xì)胞儀檢測(cè)所得數(shù)據(jù)傳入FlowCytomix Pro 2.2分析軟件(Bender MedSystems公司提供)，建立各檢測(cè)因子的標(biāo)準(zhǔn)曲線，樣品濃度由軟件自動(dòng)讀出。應(yīng)用SPSS 10.1軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，兩組均數(shù)之間的比較采用成組t檢驗(yàn)；兩變量相關(guān)分析采用Pearson相關(guān)分析。顯著性水準(zhǔn)α=0.05。

2結(jié)果

2.1RA患者PBMCs中細(xì)胞因子檢測(cè)結(jié)果根據(jù)流式細(xì)胞儀校準(zhǔn)的細(xì)胞因子參數(shù)(見(jiàn)圖1)及擬定的標(biāo)準(zhǔn)曲線(見(jiàn)圖2)測(cè)定RA患者及健康對(duì)照者PBMCs中細(xì)胞因子濃度，與健康對(duì)照組相比，RA患者PBMCs經(jīng)PHA刺激后，IL-17、IL-6、IL-1β、TNF-α水平(P<0.05)顯著升高，IFN-γ顯著降低(P<0.05)，IL-10水平無(wú)明顯改變。而且，RA患者疾病活動(dòng)組IL-17、IL-6、IL-1β、TNF-α水平顯著高于疾病緩解組(P<0.05)，但疾病緩解組IFN-γ水平高于疾病活動(dòng)組(P<0.05)；然而，疾病緩解組IL-6水平仍高于健康對(duì)照組(P<0.05)，見(jiàn)表1。

圖2　FlowCytomix檢測(cè)細(xì)胞因子的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

注：與健康對(duì)照組相比,aP< 0.05;與C組相比，bP< 0.05;與健康對(duì)照者相比,cP< 0.05。

2.2RA患者PBMCs中細(xì)胞因子與DAS28評(píng)分的相關(guān)性RA患者PBMCs中IL-17、IL-6、IL-1β、TNF-α、IFN-γ與DAS28評(píng)分的Pearson 相關(guān)結(jié)果見(jiàn)表2。RA患者PBMCs中IL-17、IL-6、IL-1β、TNF-α、IFN-γ與DAS28評(píng)分均顯著相關(guān)(P<0.05)。

表2　RA患者PBMCs中細(xì)胞因子與DAS28評(píng)分的相關(guān)性

3討論

CD4+輔助性T細(xì)胞(Th)分化異常和功能紊亂可能是RA發(fā)病的重要原因。初始T輔助細(xì)胞(Th0)在不同的細(xì)胞因子的誘導(dǎo)下，表達(dá)不同的轉(zhuǎn)錄因子，進(jìn)而分化為功能和表型不同的效應(yīng)性T細(xì)胞(Th1、Th2和Th17)和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)。既往認(rèn)為RA是Th1占優(yōu)勢(shì)的自身免疫病。Th1細(xì)胞主要分泌IFN-γ，但動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)IFN-γ基因敲除[5]或阻斷IFN-γ的治療[6]卻不能使關(guān)節(jié)炎小鼠病情緩解，提示Th1細(xì)胞可能在RA發(fā)病中并非占有主導(dǎo)地位。越來(lái)越多的證據(jù)表明Th17細(xì)胞在RA疾病進(jìn)展中發(fā)揮著重要作用，在活動(dòng)性RA患者血清及關(guān)節(jié)液中IL-17的表達(dá)均增高，阻止Th17細(xì)胞分化或封閉IL-17的活性，可明顯抑制RA的病理反應(yīng)[7]?；顒?dòng)性RA患者炎癥關(guān)節(jié)局部的單核細(xì)胞能活化CD4+T細(xì)胞，自發(fā)特異地誘導(dǎo)Th17細(xì)胞，而不是Th1或Th2細(xì)胞[8]。IL-17能誘導(dǎo)T細(xì)胞活化，促進(jìn)滑膜細(xì)胞分泌多種細(xì)胞因子，IL-17上調(diào)和/或協(xié)同局部炎癥介質(zhì)如IL-6、IL-1β、TNF-α等，促進(jìn)胞外基質(zhì)損傷，抑制基質(zhì)成分修復(fù)，導(dǎo)致RA進(jìn)一步發(fā)展。一旦關(guān)節(jié)局部炎癥過(guò)程被啟動(dòng)，IL-17能不依賴于TNF-α，維持RA的發(fā)生[9-10]。與上述文獻(xiàn)報(bào)道相一致，本研究發(fā)現(xiàn)，RA患者PBMCs經(jīng)PHA刺激后，與健康對(duì)照組相比，IL-17、IL-6、IL-1β、TNF-α水平均顯著升高(P<0.05)，但I(xiàn)FN-γ的產(chǎn)生顯著降低(P<0.05)，該研究結(jié)果與Dong等[11]的研究結(jié)果一致。但RA患者緩解組IL-17、IL-6、IL-1β、TNF-α水平均顯著低于活動(dòng)組(P<0.05)，IFN-γ水平顯著高于活動(dòng)組(P<0.05)。RA患者PBMCs中IL-17、IL-6、IL-1β、TNF-α水平與DAS28評(píng)分呈顯著正相關(guān)(P<0.05)，IFN-γ水平與DAS28評(píng)分呈顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05)，表明RA患者PBMCs中IL-17、IL-6、IL-1β、TNF-α、IFN-γ水平反映了其關(guān)節(jié)的炎癥程度及活動(dòng)狀態(tài)。

除了監(jiān)測(cè)RA患者的免疫狀態(tài)外，目前，RA患者的細(xì)胞因子封閉或受體拮抗劑治療非常有效，但是，部分患者，最高達(dá)40%的患者對(duì)此類生物治療無(wú)反應(yīng)[2]。考慮到生物治療非常昂貴，生物標(biāo)記預(yù)測(cè)，選擇高反應(yīng)的患者進(jìn)行生物治療具有重要的社會(huì)效益和經(jīng)濟(jì)效益。一些細(xì)胞因子水平反應(yīng)了患者對(duì)治療的應(yīng)答狀態(tài)。RA患者對(duì)anti-TNF-α無(wú)反應(yīng)，其滑液中IL-6的水平增高；但對(duì)anti-TNF-α反應(yīng)的患者，其IL-2、G-CSF的表達(dá)上調(diào)?；褐蠭L-6、IL-2、G-CSF水平可能是對(duì)anti-TNF-α反應(yīng)的預(yù)測(cè)指標(biāo)[12]。Das等[13]報(bào)道，利妥昔單抗無(wú)反應(yīng)的RA患者血清中IL-6的水平顯著增高，而應(yīng)答者IL-6水平顯著減少。對(duì)anti-TNF-α(依那西普)起反應(yīng)的患者，其IL-6水平減少， IL-23和IL-32的水平增加，無(wú)反應(yīng)者其上述細(xì)胞因子無(wú)明顯改變[14]。

與傳統(tǒng)的酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)檢測(cè)技術(shù)相比，基于微球的FlowCytomix檢測(cè)能夠自一份標(biāo)本中同時(shí)檢測(cè)多種指標(biāo)，且所需樣本量少，檢測(cè)時(shí)間短，具有更高的靈敏度和更好的重復(fù)性，并且能最大限度地消除不同反應(yīng)體系所帶來(lái)的各種誤差，重要的是，它還有免費(fèi)脫機(jī)分析軟件，使得數(shù)據(jù)的分析處理更加便捷。而且，本課題組前期研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PBMCs由于缺少血清中干擾因素，檢測(cè)PBMCs中細(xì)胞因子濃度顯著高于血清中濃度;FlowCytomix與ELISA在細(xì)胞因子濃度檢測(cè)方面顯著相關(guān)，但FlowCytomix比ELISA更靈敏，能檢測(cè)出更多PBMCs中細(xì)胞因子且檢測(cè)濃度顯著高于ELISA檢測(cè)濃度[15]。與其他基于微球技術(shù)的多參數(shù)檢測(cè)技術(shù)(如Luminex液相蛋白芯片技術(shù)，CBA流式微珠陣列技術(shù))相比,FlowCytomix檢測(cè)技術(shù)的實(shí)驗(yàn)過(guò)程幾乎可在所有的流式細(xì)胞儀上完成，這使得在流式細(xì)胞儀平臺(tái)上進(jìn)行多參數(shù)檢測(cè)變的更加普遍。因而，考慮到RA本身發(fā)病機(jī)制的復(fù)雜性及異質(zhì)性，應(yīng)用FlowCytomix檢測(cè)RA患者多種細(xì)胞因子，不僅為RA患者的免疫狀態(tài)和炎癥水平提供更為可信的依據(jù)。而且，可用于預(yù)測(cè)RA患者對(duì)細(xì)胞因子治療的應(yīng)答反應(yīng)，為RA患者個(gè)性化治療提供一種有用的工具，更好地為臨床服務(wù)。

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Detection of cytokine profile of patients with rheumatoid arthritis by FlowCytomix

WANG Xue-feng1,2, SHU Yang1,2, WANG Yi1, et al

(1.DepartmentofCentralLaboratory；2.DepartmentofNuclearMedicineandInstituteofOncology,theAffiliatedHospitalofJiangsuUniversity,Zhenjiang,Jiangsu212001,China)

Abstract:Objective To detect cytokine profile of patients with rheumatoid arthritis (RA) by FlowCytomix. Methods Peripheral blood mononuclear cells (PBMC) were isolated from healthy controls and RA patients by Ficoll-Hypaquedensity gradient centrifugation, then the cells were stimulated with phytohaemagglutinin (PHA) and the supernatants were collected to quantitatively measure cytokine production by FlowCytomix. Results Compared with control group, the concentrations of IL-17, IL-6, IL-1β and TNF-α were significantly increased but the level of IFN-γ was decreased. The concentration of IL-10 was not significantly changed. The levels of IL-17, IL-6, IL-1β, and TNF-α were higher in active RA than those of remission, whereas IFN-γ level was high in remission. IL-17, IL-6, IL-1β, TNF-α, and IFN-γ levels and DAS28 score showed significant correlation.Conclusions Multiplex cytokine profiling systems of FlowCytomix can be applied to specific and sensitive quantification of cytokines of PBMCs from RA patients, and the levels of IL-17, IL-6, IL-1β, and TNF-α in PBMCs reflect the degree of inflammation in joints and the disease activity.

Key words:FlowCytomix；rheumatoid arthritis;cytokine profile

(收稿日期：2015-11-19，修回日期：2016-02-20)

doi:10.3969/j.issn.1009-6469.2016.04.015

基金項(xiàng)目:江蘇省自然科學(xué)基金(No BK20141295)；江蘇省“333工程”科研項(xiàng)目(No BRA2014172);鎮(zhèn)江市社會(huì)發(fā)展項(xiàng)目(SH2015033)；鎮(zhèn)江市重點(diǎn)醫(yī)學(xué)人才資助(2014年)