史立信，胡福廣，顧春雷，王冰，張文超，王傳海

彌漫性軸索損傷患者的血清NF-L表達變化

史立信1，胡福廣2，顧春雷3，王冰4，張文超1，王傳海1

目的：探討彌漫性軸索損傷（DAI）患者血清中的神經絲蛋白輕鏈多肽（NF-L）的濃度與DAI病情的嚴重程度和預后的相關性。方法：選擇DAI患者95例（DAI組）和健康體檢者65例（正常對照組），采用ELISA檢測2組血清中NF-L的濃度。結果：損傷后7 d內，DAI組血清中NF-L的濃度均高于正常對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。ROC曲線顯示血清NF-L濃度＞3.85 ng/mL對于輔助診斷DAI的敏感性與特異性最高。DAI死亡患者血清NF-L濃度明顯高于存活患者。結論：血清NF-L濃度與DAI損傷嚴重程度及患者預后具有相關性。關鍵詞 神經絲蛋白輕鏈多肽；彌漫性軸索損傷；特異性；準確性

彌漫性軸索損傷（diffuse axonal injury，DAI）的基本病變包括神經軸索的彌漫性損傷，胼胝體及上腦干背側局灶性損傷，即DAI三聯(lián)征[1]。DAI患者最突出的臨床特點是傷后原發(fā)性昏迷，表現(xiàn)為去大腦強直或去皮質強直，意識恢復較慢[2]，約占重型顱腦損傷的28%～42%，在死亡患者中占29%～43%。病情危重，病死率和致殘率高，是導致顱腦損傷患者神經功能障礙、植物狀態(tài)和死亡的主要原因[3-5]。目前DAI的診斷主要依據(jù)臨床表現(xiàn)、影像學特征，但CT及MRI的特異性及準確性不高，所以尋求顱腦創(chuàng)傷后DAI發(fā)病過程中的生物標志物的變化進行早期診療[6-10]，以期改善患者預后。本文研究DAI發(fā)病過程中血清神經絲蛋白輕鏈多肽（neurofilament light polypeptide，NF-L）的表達、變化，對其在DAI診斷、預后判斷中的價值進行分析。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2012年1月1日至2015年1月1日清河縣人民醫(yī)院神經外科收治的顱腦創(chuàng)傷后DAI患者95例為DAI組，男28例，女67例；年齡12～74歲；格拉斯哥昏迷評分（Glasgow coma scale，GCS）評分3～5分58例，6～8分 37例；格拉斯哥預后分級（Glasgow outcome scale，GOS）1級（死亡）13例、2級（植物人狀態(tài)）0例、3級（重殘）45例、4級（中殘）24例、5級（輕殘）13例；DAI程度分級1級21例、2級32例、3級42例。另選取同期在本院常規(guī)體檢的健康人65例為對照組，男44例，女21例；年齡18～61歲。2組性別、年齡差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。本研究經醫(yī)院倫理委員會審查批準，所有受試者簽署知情同意書。

1.2 實驗器材

Kayto RT-6000酶標儀、Kayto RT-3000洗板機、Ketong恒溫箱及TOSHIBA全自動生化分析儀均借用于本院檢驗科。NF-L酶聯(lián)免疫吸附試劑盒購自北京博奧生物技術公司。

1.3 方法

對照組采集靜脈血，DAI組受傷8 d內每隔12 h采集外周靜脈血低溫保存，檢測血清中NF-L含量。包被：用0.05 mol/L pH9的碳酸鹽包被緩沖液將抗體稀釋至蛋白質含量為1～10 μg/mL，在每個聚苯乙烯板的反應孔中加0.1 mL，4℃過夜。次日，棄去孔內溶液，用洗滌緩沖液洗3次，每次3 min。加樣：加一定稀釋的待檢樣品0.1 mL于上述已包被之反應孔中，置37℃孵育1 h，然后洗滌（同時設置空白孔、陰性對照孔及陽性對照孔）。于各反應孔中，加入新鮮稀釋的酶標NF-L單克隆抗體（經滴定后的稀釋度）0.1 mL，37℃孵育0.5～1 h，洗滌。于各反應孔中加入臨時配制的TMB底物溶液0.1 mL顯色，37℃10～30 min。于各反應孔中加入2 mol/L硫酸0.05 mL終止反應。在酶標儀上進行結果判定，NF-L濃度檢測臨界點為29 ng/L，檢測范圍為100～10 000 ng/L。如果檢測結果超過該濃度范圍，則對待測標本經過濃縮或稀釋后重新檢測3次，最后取平均值作為結果。

1.4 統(tǒng)計學處理

采用SPSS18.0軟件進行統(tǒng)計學分析，χ2檢驗、ROC曲線，用單因素回歸模型分析NF-L在DAI診斷與預后中的價值，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 DAI組NF-L濃度的變化

損傷后7 d內，DAI組血清中NF-L的濃度均高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；在損傷6 h時NFL濃度值高達（5.33±1.10）ng/mL，在24 h時達（2.10± 0.42）ng/mL，36 h后便迅速下降（圖1）。

圖1 2組血清中NF-L濃度比較

2.2 血清NF-L在DAI診斷中的價值

根據(jù)ROC曲線分析和正確診斷指數(shù)（Youden指數(shù)）最大截斷點原則，用NF-L診斷DAI的曲線下面積為 0.912，95%置信區(qū)間為 0.901～0.943（P＜0.01），Youden最大值為 0.66，所對應的血清 NF-L為3.85 ng/mL，此為NF-L在DAI中的最佳診斷界點，此時靈敏度為82.73%，特異度為84.81%，陽性預測值為88.34%，陰性預測值為82.36%，漏診率為17.27%，誤診率為15.19%（圖2）。根據(jù)該曲線可知，血清NF-L濃度＞3.85 ng/mL可輔助診斷外傷后DAI的診斷，其敏感性與特異性最高。

圖2 血清NF-L對DAI的診斷效能ROC曲線

2.3 血清NF-L濃度與DAI嚴重程度的相關性

DAI組中，DAI1、2、3級患者的血清NF-L濃度分別為（1.21±0.02）、（2.79±0.13）、（4.53±0.03）ng/mL，DAI2、3級患者的NF-L值均明顯高于1級患者，差異有統(tǒng)計學意義（P=0.003，P=0.01）。

2.4 NF-L與DAI組死亡患者結果的相關性分析

DAI組中，7 d內的死亡患者和存活患者在受傷后6 h血清中NF-L的濃度分別為（8.42±2.51）、（1.00± 0.21）ng/mL，前者明顯高于后者，差異有統(tǒng)計學意義（P=0.01）。單變量回歸分析發(fā)現(xiàn)，DAI組血清NF-L＞5.22 ng/mL是預測DAI死亡風險的獨立因子（表1）。

3 討論

近年來人們發(fā)現(xiàn)了許多與顱腦創(chuàng)傷后相關的生物標記物[11,12]，它們在DAI的發(fā)生、發(fā)展過程中有明顯變化，且與病情的發(fā)展及預后有一定的相關性[13]。理想的生物學標記物需要滿足以下條件：對顱腦創(chuàng)傷的特異性和敏感性高；能反映損傷的嚴重程度；在體液中快速表達；能反映損傷機制；能監(jiān)測疾病的進展及對治療的反應；能對預后進行評估[14]。

DAI時神經元發(fā)生軸索斷裂、分解等損傷，腦白質纖維受損后的生化級聯(lián)反應和修復反應過程中會出現(xiàn)多種蛋白質的變化，它們與DAI的發(fā)生緊密相關，對早期診斷DAI及制訂治療策略有重要意義[15,16]。神經微絲屬于中間絲蛋白家族的第Ⅳ類成員，特異地在神經細胞內表達，NF是神經元中直徑10 nm的中間絲，是神經元細胞骨架的主要成分，負責軸漿運輸，在維持神經元正常形態(tài)中發(fā)揮著重要的作用。NF分為3種亞型，即輕鏈蛋白（NF-L，分子量為68 kD）、中鏈蛋白（NFM，分子量為160 kD）、重鏈蛋白（NF-H，分子量為200 kD）[17]。NF的結構變化是軸索損傷最早、最有特征性的表現(xiàn)形式，它是軸索腫脹的始動因素[12]。NF-L在神經元中含量最豐富，其活性的改變與神經變性疾病密切相關[18,19]。NF-L是對DAI最敏感的亞基，傷后0.5～2 h即可在腦脊液中檢測到其降解產物[20]，并且腦脊液中NF-L的濃度亦會明顯升高[14]。其病理生理基礎為：DAI后NF-L發(fā)生異常磷酸化、減緩NF-L自細胞體向軸突的運輸，軸突斷裂后，斷端回縮可引起磷酸化的NF-L從軸突向細胞體逆流，導致NF-L在細胞體內異常聚集，使損傷神經元細胞體的NF-L含量增加、濃度升高[21]。

本文結果顯示DAI發(fā)生后很早就能檢測出NF-L，DAI組血清中NF-L濃度明顯高于對照組，并與損傷嚴重程度和死亡風險相關。在DAI后血清中還存在NFL濃度第2個小高峰（圖1），這可能與顱腦創(chuàng)傷后繼發(fā)的顱內高壓或低氧血癥有關。

本文通過繪制ROC曲線的統(tǒng)計學方法發(fā)現(xiàn)，血清NF-L濃度＞3.85 ng/mL對DAI診斷的特異性和敏感性最高，這與國外實驗結果相符[22,23]。同時發(fā)現(xiàn)，DAI后12 h內血清NF-L的升高與患者DAI嚴重程度明顯相關，這與通過入院時GCS評分所的結果一致；并且患者DAI后3月內的死亡率還與受傷6 h內血清NF-L的升高及本研究期內的平均值顯著相關。筆者推測在神經元損傷后，NF-L進入細胞外液，再通過受損的血腦屏障入血直至達到平衡[24]，所以血清NF-L能準確反應腦組織、神經元及血腦屏障的損傷程度，判斷DAI的預后、預測死亡方面具有重要的參考價值。

本文的不足之處在于，樣本量偏小，在后續(xù)研究中應擴大DAI患者的數(shù)量；實驗中對DAI病情的判斷主要依靠入院時GCS評分和隨訪中GOS評分，主觀性偏強，今后研究中應該盡量多地采用基于MRI、CT等客觀檢查的病情判斷手段。

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（本文編輯：王晶）

Expression Changes of Serum NF-L Levels in Patients with Diffuse Axonal Injury

SHI Li-xin1, HU Fu-guang2,GU Chun-lei3,WANG Bing4,ZHANG Wen-chao1,WANG Chuan-hai1.1.Department of Neurosurgery,People’s Hospital of Qinghe Country,Hebei 054800,China;2.Department of Neurosurgery,The second Hospital of Hebei Medical University,Shijiazhuang 054800,China;3.Department of Neurosurgery,The Center Hospital of Qinghe Country,Hebei 054800,China;4.Teacher Education School of Qinghe Country,Hebei 054800,China

Objective:To investigate the correlation between the concentration of neurofilament light polypeptide(NF-L)in serum of patients with diffuse axonal injury(DAI)after brain trauma and the severity and prognosis of DAI disease.Methods:Total 95 patients with DAI(DAI group)and 65 patients with healthy physical examination(Normal control group)were enrolled.ELISA was used to detect the concentration of NF-L in the serum and CSF of the two groups.Results:The serum NF-L concentration in DAI group was significantly higher than that in the normal control group within 7 days after trauma(P＜0.05).ROC curves showed that the sensitivity and specificity was the highest for the auxiliary diagnosis of DAI when the serum NF-L concentration was higher than 3.85 ng/mL.The serum NF-L concentration of DAI patients was significantly higher in the dead patients than that in the survivors.Conclusion:The serum NF-L concentration was correlated with the severity of DAI damage and the prognosis of the patients.

R741；R684

A DOI 10.16780/j.cnki.sjssgncj.2016.04.012

1.河北省清河縣人民醫(yī)院神經外科河北 清河 054800

2.河北醫(yī)科大學第二醫(yī)院神經外科河北石家莊 050000

3.河北省清河縣中心醫(yī)院神經外科 河北 清河 054800

4.河北省清河縣教師進修學校河北 清河 054800

邢臺市科技支撐計劃項目（No.2016ZC143）

2015-12-15

史立信wbslx8099@163.com