洪蓓蓓

摘 要：聯(lián)乙烯還原酶（divinyl reductase，DVR）將各種葉綠素中間物質(zhì)的8-乙烯基轉(zhuǎn)化為乙基，是生物合成葉綠素必不可少的一個(gè)關(guān)鍵酶。本文用生物信息分析方法對黃瓜DVR基因編碼的氨基酸序列與組成、疏水性/親水性、理化性質(zhì)等進(jìn)行分析與預(yù)測。結(jié)果表明DVR基因全長1260 bp，編碼419個(gè)氨基酸，推測為親水性的非跨膜類蛋白。根據(jù)同源序列的遺傳距離得知黃瓜DVR與黃瓜（JX239753.1）同源基因關(guān)系最近，其次為香瓜，與鷹嘴豆基因關(guān)系最遠(yuǎn)。

關(guān)鍵詞：黃瓜；聯(lián)乙烯還原酶；生物信息學(xué)分析

黃瓜（Cucumissativus L. var.sativus）又稱胡瓜，是葫蘆科、甜瓜屬植物，起源于喜馬拉雅山南麓的熱帶雨林地區(qū)，是葫蘆科甜瓜屬一年生草本蔓生攀緣植物[1]。黃瓜雌雄同株，雄花：常數(shù)朵在葉腋簇生；花梗纖細(xì)；花冠黃白色，花冠裂片長圓狀披針形。雌花：單生或簇生；花梗粗壯；子房粗糙。果實(shí)長圓形或圓柱形，熟時(shí)黃綠色，表面粗糙，花果期夏季[2]。黃瓜味甘性涼，具有清熱利水，解毒的功效。黃瓜含水分為98%，并含有少量的維生素C、胡蘿卜素、蛋白質(zhì)、鈣、磷、鐵、維生素（VA、VB1、VB2、VC、VE）等人體必需的營養(yǎng)素[3]。食用方便，可生食或烹調(diào)用?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究認(rèn)為，黃瓜中含有的丙醇二酸能抑制糖類物質(zhì)轉(zhuǎn)化為脂肪，葫蘆索C可抗癌，黃瓜汁有美容功效[4]。

聯(lián)乙烯還原酶[5]是一種膜結(jié)合蛋白，它嵌入質(zhì)體和葉綠體膜中，催化卟啉環(huán)上的C-8位乙烯基還原為乙基，是植物體內(nèi)合成正常的MV-Chl必不可少的一個(gè)關(guān)鍵酶。在高等植物中各種DVR的基因活性是由一個(gè)基因編碼的具有廣譜底物?；缘腄VR蛋白所催化，來源于不同物種的DVR蛋白的催化活性具有極顯著的差異，并且即使是同一個(gè)DVR蛋白，對不同的聯(lián)乙烯底物也可能具有顯著不同的催化活性[6]?？梢?，對黃瓜聯(lián)乙烯還原酶的結(jié)構(gòu)和功能進(jìn)行推斷和預(yù)測具有一定的生物學(xué)意義，故本文將對黃瓜聯(lián)乙烯還原酶的生物信息學(xué)進(jìn)行分析。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

黃瓜DVR基因序列來源于實(shí)驗(yàn)獲得，從在美國國家生物技術(shù)信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）核酸及蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫中檢索得到。同時(shí)通過檢索與黃瓜DVR基因具有較為相近同源序列的基因：黃瓜（登錄號(hào)JX239753.1）、香瓜Cucumismelo（登錄號(hào)XM_008440580.1）、野草莓Fragariavesca subsp. vesca（登錄號(hào)XM_004296747.2）、白梨Pyrus xbretschneideri（登錄號(hào)XM_009347536.1）、白梨Pyrusx bretschneideri（登錄號(hào)XM_009347528.1）、白梨Pyrus x bretschneideri（登錄號(hào)XM_009370831.1）、白梨Pyrus xbretschneideri（登錄號(hào)XM_009353937.1）、鷹嘴豆Cicerarietinum（登錄號(hào)XM_004486002.2）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

通過軟件primer 5.0獲得相應(yīng)的氨基酸序列[7]；MEGA3.1軟件采用Neighbor-Joining的方法進(jìn)行進(jìn)化樹分析

[8]；通過npsa-prabi在線工具（http：//npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page=npsa_sopma.html）進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測；通過Protscale（http：//expasy.org/tools/protscale.html）預(yù)測分析蛋白質(zhì)功能和疏水性/親水性[9]；利用CBS網(wǎng)站TMHMM Serverv.2.0（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）在線工具對氨基酸序列進(jìn)行跨膜分析預(yù)測[10]。

2 結(jié)果與分析

2.1 黃瓜DVR基因序列的分析

根據(jù)DNAMAN軟件分析可知，DVR基因序列全長1260pb，分別以ATG和TGA為起始密碼子和終止密碼子，共編碼419個(gè)殘基（圖1），編碼的蛋白質(zhì)分子質(zhì)量為45516 Da。

2.2黃瓜DVR及其同源序列的分析進(jìn)化樹

根據(jù)MEGA軟件分析，將進(jìn)化樹分為五段，分別是四種白梨、野草莓、香瓜、兩種黃瓜和鷹嘴豆（圖2）。黃瓜DVR與黃瓜（JX239753.1）的同源基因關(guān)系最為接近，幾乎完全相同，其次為香瓜，測得黃瓜與香瓜的同源距離約為0.029，與鷹嘴豆基因關(guān)系最遠(yuǎn)，測得它們之間的距離達(dá)到0.357。

2.3 黃瓜DVR蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測

通過sopma在線軟件預(yù)測可知，該蛋白由419個(gè)氨基酸組成，其中α螺旋和無規(guī)則卷曲所占比例最高，α螺旋有146個(gè)，占總數(shù)的34.84%，無規(guī)則卷曲有140個(gè)，占總數(shù)的33.41%。β折疊數(shù)量略少于無規(guī)則卷曲，但遠(yuǎn)多于β轉(zhuǎn)角（圖3）。

2.4 黃瓜DVR蛋白跨膜結(jié)構(gòu)分析

跨膜結(jié)構(gòu)域一般富含疏水性氨基酸殘基，起著固系于細(xì)胞膜中的“拋錨”作用，具有跨膜結(jié)構(gòu)域的蛋白屬于跨膜蛋白類。通過TMHMM在線軟件預(yù)測可知，橫坐標(biāo)表示氨基酸殘基位置，縱坐標(biāo)表示殘基具有相應(yīng)結(jié)構(gòu)的可能性， 結(jié)果顯示，聯(lián)乙烯還原酶蛋白沒有檢測到跨膜區(qū)，可能不是跨膜蛋白，聯(lián)乙烯還原酶蛋白極可能為覆蓋蛋白（圖4）。

2.5 黃瓜DVR蛋白的親疏水性預(yù)測

用protscale軟件分析可知，圖中大于零的氨基酸為疏水性氨基酸，小于零的氨基酸為親水性的氨基酸。通過預(yù)測可知，組成聯(lián)乙烯還原酶蛋白的氨基酸中高親水性的氨基酸的位點(diǎn)有兩個(gè)（圖5），分別是57和58，分值都是-2.667；組成聯(lián)乙烯還原酶蛋白的氨基酸中高疏水性的氨基酸的位點(diǎn)206，分值是2.978。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)預(yù)測得黃瓜聯(lián)乙烯還原酶蛋白為親水性的非跨膜類蛋白，通過對蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測可知，黃瓜聯(lián)乙烯還原酶蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)以α螺旋和無規(guī)則卷曲為主；根據(jù)同源序列的遺傳距離得知黃瓜DVR與黃瓜（JX239753.1）同源基因關(guān)系最近，與鷹嘴豆基因關(guān)系最遠(yuǎn)。

絕大多數(shù)綠色植物進(jìn)行光合作用離不開葉綠體的存在[11]，而聯(lián)乙烯還原酶是生物合成葉綠素必不可少的一個(gè)關(guān)鍵酶，迄今已在高等植物中檢測到5種DVR活性[12]。聯(lián)乙烯還原酶具有活性，對葉綠素的生物合成途徑具有十分重要的意義

[13]。聯(lián)乙烯蛋白酶基因的突變可能會(huì)引起聯(lián)乙烯還原酶失活，對植物的生存、生長和繁殖造成較大的影響

[15]。應(yīng)用生物信息學(xué)方法對已知黃瓜DVR序列進(jìn)行比對、分析，從而對其結(jié)構(gòu)和功能進(jìn)行推斷和預(yù)測，這可以為我們在開展試驗(yàn)研究前提供盡可能多的信息，從而為選擇合適的試驗(yàn)方法提供理論參考，為進(jìn)一步對該基因的功能研究提供線索。

[參考文獻(xiàn)]

[1]閆世江， 張繼寧， 劉潔. 低溫對黃瓜傷害的研究進(jìn)展[J]. 蔬菜， 2010， 5（10）：31-34.

[2] 陳惠明， 劉曉虹. 黃瓜性型遺傳規(guī)律的研究[J]. 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版， 1999， 25（1）：40-43.

[3] 孫洪濤. 黃瓜果實(shí)橫徑遺傳分析及分子標(biāo)記[D]. 哈爾濱： 東北農(nóng)業(yè)大學(xué)， 2010.

[4] 曾維華. “黃瓜”始名考[J]. 上海師范大學(xué)學(xué)報(bào)：哲學(xué)社會(huì)科學(xué)版， 2000， 29（4）： 313-315.

[5] Nielsen J G， Newman M， Nielsen H. Control and testing of a dynamic voltage restorer （DVR） at medium voltage level [J]. IEEE Transactions on Power Electronics， 2004， 19（3）：806-813.

[6] 王平榮， 鄧曉建. 高等植物葉綠素生物合成的聯(lián)乙烯還原酶及編碼基因研究進(jìn)展 [J]. 西北植物學(xué)報(bào)， 2013， 33（4）：843-849.

[7] 王江波. 中國水仙LTR反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子研究及IRAP、REMAP分子標(biāo)記的開發(fā) [D]. 福州： 福建農(nóng)林大學(xué)， 2012.

[8] 李鳳梅， 蓋雪梅. 半胱氨酸蛋白酶抑制劑的系統(tǒng)發(fā)生分析（英文） [J]. 農(nóng)業(yè)科學(xué)與技術(shù)， 2010， 14（2）： 44-54.

[9] 廖文彬， 崔百明， 溫瑋. 赤霉素負(fù)調(diào)控因子GhRGL（RGL-LIKE）基因序列與功能預(yù)測分析 [J]. 熱帶作物學(xué)報(bào)， 2009， 30（2）： 773-781.

[10] 張繁. 結(jié)核分枝桿菌哺乳動(dòng)物細(xì)胞入侵因子mce家族Rv0590A基因的性質(zhì)及功能研究 [D]. 重慶： 西南大學(xué)， 2011.

[11] 蘭金蘋， 李莉云， 賈霖， 曹英豪， 白輝. 葉綠體基因編碼蛋白質(zhì)在水稻葉片生長過程中的表達(dá)研究[D]. 保定： 河北農(nóng)業(yè)大學(xué)， 2011.

[12] 王平榮. 水稻824ys黃綠葉突變基因的圖位克隆及功能分析[D]. 雅安： 四川農(nóng)業(yè)大學(xué)， 2010.

[13] 王平榮， 馬曉智， 李春梅， 孫昌輝， 鄧曉建. 三個(gè)水稻聯(lián)乙烯還原酶基因突變體的比較研究 [J]. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2013， 46（7）：1305-1313.

（作者單位：臺(tái)州學(xué)院 英語系，浙江 臨海 317000）