錢雯婕　袁青鋒　魏紅英

摘要 介紹了一種利用棉花種子通用DNA快速提取方法以及多重PCR技術(shù)實(shí)現(xiàn)其純度快速檢測(cè)的技術(shù)。由于該技術(shù)具備準(zhǔn)確、高效、成本低，以及便于推廣應(yīng)用的特點(diǎn)，實(shí)現(xiàn)了棉花種子純度的快速檢測(cè)。

關(guān)鍵詞 棉花種子；PCR；快速檢測(cè)

中圖分類號(hào) S562 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 1007-5739（2016）07-0056-01

棉花是我國(guó)重要經(jīng)濟(jì)作物之一，對(duì)我國(guó)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的發(fā)展發(fā)揮了重要促進(jìn)作用。自我國(guó)成功加入WTO組織之后，棉花出口量逐年遞增，對(duì)其產(chǎn)量、品質(zhì)均提出了更高的要求。棉花的種子是棉花生產(chǎn)的基礎(chǔ)，種子純度是衡量質(zhì)量的主要標(biāo)準(zhǔn)，棉種質(zhì)量的高低是決定該品種能否在生產(chǎn)上推廣、應(yīng)用的前提，也是棉種生產(chǎn)及其推廣應(yīng)用的生命線[1-2]。種子純度作為衡量棉花種子的重要指標(biāo)之一，不僅影響著企業(yè)對(duì)于棉種的購(gòu)銷，也是企業(yè)能否穩(wěn)健發(fā)展的根本。如何及時(shí)準(zhǔn)確地鑒定出棉種的純度，一直是棉種行業(yè)質(zhì)量監(jiān)控的重點(diǎn)和難點(diǎn)。純度鑒定是判定種子質(zhì)量最復(fù)雜的檢驗(yàn)過(guò)程。種子純度檢測(cè)的方法有很多，傳統(tǒng)鑒定方法為等到種子下一個(gè)生長(zhǎng)季節(jié)或者到海南省通過(guò)種植鑒定，該方法的缺點(diǎn)在于費(fèi)時(shí)費(fèi)力，且成本較高，無(wú)法滿足現(xiàn)代化種子經(jīng)營(yíng)的步伐[3-4]。隨著DNA標(biāo)記技術(shù)的逐步成熟，目前已成為鑒定棉花雜家種子純度鑒定方法的補(bǔ)充或有效替代[5-6]。

哈密地處亞歐大陸腹地，位于西風(fēng)帶控制之下，常年干燥少雨，溫差大，光照時(shí)間長(zhǎng)，熱量豐富，屬于典型的大陸性半干旱氣候，對(duì)棉花等種植業(yè)的發(fā)展極為有利，在新疆棉花氣候資源區(qū)劃上屬宜棉區(qū)。得天獨(dú)厚的自然條件，吸引了諸多內(nèi)地廠家來(lái)此繁育棉花。在雜交棉花的制種方面，目前多通過(guò)人工去雄授粉方法進(jìn)行，其缺點(diǎn)表現(xiàn)為難免會(huì)出現(xiàn)一部分自交現(xiàn)象，導(dǎo)致該現(xiàn)象的誘因有多種：首先是人工去雄不到位，即由于天氣或勞動(dòng)力等因素所限，導(dǎo)致去雄不徹底；其次是種子純度不高，部分種子經(jīng)銷商在利益驅(qū)使下，在種子中摻雜假種子，嚴(yán)重影響種子純度；最后，由于棉花自身具備一定天然異交率，容易造成品種混亂。對(duì)于棉花生產(chǎn)來(lái)說(shuō)，如果不能有效鑒定棉種的純度，將嚴(yán)重影響棉花產(chǎn)量及品質(zhì)。因此，如果能夠探索出一種精準(zhǔn)、高效、經(jīng)濟(jì)的棉種純度檢測(cè)技術(shù)，可對(duì)雜交棉的種植及推廣起到積極的促進(jìn)作用[7-8]。

本文通過(guò)將棉花種子DNA快速提取方法和通用多重PCR技術(shù)結(jié)合起來(lái)，實(shí)現(xiàn)提高棉花種子純度鑒定效率的同時(shí)，也極大地提升新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)第十三師農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所科研技術(shù)服務(wù)能力，對(duì)促進(jìn)哈密地區(qū)及十三師現(xiàn)代化農(nóng)業(yè)健康、持續(xù)發(fā)展有著重要的意義。現(xiàn)將棉花種子純度快速檢測(cè)技術(shù)研究的具體實(shí)施方案介紹如下。

1 引物設(shè)計(jì)

根據(jù)Cotton Microsatellite Database（CMD）已公布的序列，以及兩端序列的保守性，設(shè)計(jì)多對(duì)引物。在設(shè)計(jì)引物的過(guò)程中，要充分考慮引物的差異性、Tm值、長(zhǎng)度、GC含量等。

2 DNA提取方法

本試驗(yàn)采用改良的CTAB法提、SDS法、試劑盒快速提取法分別提取棉花種仁和子葉DNA。通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA的完整性，分光光度法測(cè)定DNA濃度和純度，篩選出最優(yōu)的提取部位和提取方法。建立一種基于PCR的棉花種子DNA快速提取方法，并經(jīng)過(guò)多組試驗(yàn)，深入研究提取方法所涉及因素（如提取液體積、濃度、提取時(shí)間等）對(duì)DNA完整性以及PCR產(chǎn)物的影響，以及不同公司的Mix以及DNA模板量存在差異性的情況下對(duì)PCR產(chǎn)物的影響，最終研究出一種基于PCR的棉花種子DNA快速提取方法。

3 多重PCR技術(shù)

通過(guò)深入研究多重PCR技術(shù)，多方面、多維度對(duì)引物設(shè)計(jì)、PCR擴(kuò)增體系以及PCR擴(kuò)增程序進(jìn)行深入思考，并對(duì)其技術(shù)可行性進(jìn)行縝密論證，最終建立起一套通用多重PCR技術(shù)。

4 擴(kuò)增產(chǎn)物的PAGE與銀染檢測(cè)

經(jīng)過(guò)PCR擴(kuò)增完成并且經(jīng)過(guò)變性以后，再利用變性聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳分離，隨后進(jìn)行銀染檢測(cè)，再根據(jù)聚丙烯酰胺凝膠電泳的帶型統(tǒng)計(jì)母本自交粒帶型數(shù)量、待測(cè)樣品目標(biāo)帶型數(shù)量，以及雜粒帶型數(shù)量，最終計(jì)算出待測(cè)樣品的純度，亦可根據(jù)其他PCR產(chǎn)物檢測(cè)儀器的參數(shù)計(jì)算待測(cè)樣品純度[9-11]。

5 參考文獻(xiàn)

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