高玲 王豫紅

【摘 要】 目的：研究干擾MTDH基因表達(dá)對(duì)宮頸癌Hela細(xì)胞增殖和侵襲的影響及其作用機(jī)制。方法：構(gòu)建MTDH shRNA表達(dá)質(zhì)粒，將其轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞并設(shè)置相應(yīng)的對(duì)照組，Western-blot檢測(cè)各組細(xì)胞中MTDH、VEGF-A、E-Cadherin蛋白表達(dá)情況；同時(shí)MTT法檢測(cè)各組細(xì)胞增殖情況；Transwell檢測(cè)各組細(xì)胞侵襲能力。結(jié)果：與對(duì)照組相比，MTDH干擾組Hela細(xì)胞中MTDH、VEGF-A蛋白表達(dá)明顯下降，E-Cadherin蛋白表達(dá)顯著上升。MTDH干擾組Hela細(xì)胞增殖受到明顯抑制，且細(xì)胞侵襲能力顯著下降。結(jié)論：干擾Hela細(xì)胞中MTDH基因表達(dá)能夠下調(diào)VEGF-A表達(dá)并增強(qiáng)E-Cadherin的表達(dá)，從而抑制Hela細(xì)胞增殖及侵襲。

【關(guān)鍵詞】 MTDH RNA干擾 宮頸癌 細(xì)胞增殖 細(xì)胞侵襲

宮頸癌是常見的婦科惡性腫瘤，對(duì)宮頸癌的基因治療是值得探索的綜合治療手段之一，理想靶點(diǎn)的選擇及有效的干預(yù)手段是基因治療的重要基礎(chǔ)。MTDH即metadherin，中文名為異黏蛋白，是近年來發(fā)現(xiàn)的一個(gè)比較新的癌基因。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[1]，MTDH在宮頸癌、乳腺癌等多種腫瘤組織中高表達(dá)，顯示其可能與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。研究顯示，MTDH過度表達(dá)能夠誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞異常增殖，提高腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞侵襲能力，增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的耐藥性，從而促進(jìn)腫瘤的發(fā)展。因此MTDH可能是在很多腫瘤中進(jìn)行基因治療的理想靶點(diǎn)。

目前國(guó)內(nèi)外已有研究者通過下調(diào)MTDH表達(dá)抑制肝癌、乳腺癌等腫瘤的發(fā)生及發(fā)展[2，3]，但將MTDH作為基因治療靶點(diǎn)應(yīng)用于宮頸癌治療的相關(guān)報(bào)道很少。在宮頸癌細(xì)胞中抑制MTDH表達(dá)后，是否會(huì)對(duì)腫瘤細(xì)胞的增殖和侵襲能力造成影響，其具體作用機(jī)制如何，是值得研究的課題。因此本課題構(gòu)建了MTDH shRNA質(zhì)粒，利用其下調(diào)宮頸癌Hela細(xì)胞中MTDH表達(dá)，觀察其對(duì)Hela細(xì)胞增殖和侵襲能力的影響，并對(duì)其中可能的作用機(jī)制進(jìn)行了研究。

1 材料與試劑

MTDH shRNA表達(dá)質(zhì)粒（pLV-MTDH-sh）及相應(yīng)的對(duì)照質(zhì)粒（pLV-shNC）購(gòu)自長(zhǎng)沙贏潤(rùn)生物技術(shù)有限公司。Hela細(xì)胞購(gòu)自中科院上海細(xì)胞庫(kù)。胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自Gibco。Lip2000轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)自Invitrogen。MTDH抗體、VEGF-A抗體、E-Cadherin抗體均購(gòu)自CST。β-actin內(nèi)參抗體、MTT檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自長(zhǎng)沙贏潤(rùn)生物技術(shù)有限公司。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染

用T25細(xì)胞培養(yǎng)瓶培養(yǎng)兩瓶Hela細(xì)胞，利用Lip2000轉(zhuǎn)染試劑將pLV-MTDH-sh、pLV-shNC質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染至Hela細(xì)胞中，48h后收細(xì)胞。

2.2 Western-blot檢測(cè)

提取2.1中獲得的各組細(xì)胞總蛋白，常規(guī)Western-blot方法檢測(cè)各組細(xì)胞中MTDH、VEGF-A、E-Cadherin蛋白表達(dá)情況，以β-actin作為內(nèi)參。

2.3 MTT檢測(cè)細(xì)胞增殖

將Hela細(xì)胞分為兩組，分別轉(zhuǎn)染pLV-MTDH-sh、pLV-shNC質(zhì)粒，于轉(zhuǎn)染后24h、48h、72h用MTT檢測(cè)試劑盒檢測(cè)各組細(xì)胞增殖情況。

2.4 Transwell檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力

將Hela細(xì)胞分為兩組，分別轉(zhuǎn)染pLV-MTDH-sh、pLV-shNC質(zhì)粒，48h后用Transwell法檢測(cè)各組細(xì)胞侵襲能力。

3 結(jié)果

3.1 Western-blot檢測(cè)MTDH、VEGF-A、E-Cadherin蛋白表達(dá)

Western-blot檢測(cè)對(duì)照組及MTDH干擾組Hela細(xì)胞中MTDH、VEGF-A、E-Cadherin蛋白表達(dá)情況，結(jié)果顯示與對(duì)照組相比，MTDH干擾組Hela細(xì)胞中MTDH、VEGF-A蛋白表達(dá)明顯下降，而E-Cadherin蛋白表達(dá)顯著上升（圖1），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

3.2 干擾MTDH基因表達(dá)對(duì)Hela細(xì)胞增殖的影響

MTT法檢測(cè)對(duì)照組及MTDH干擾組Hela細(xì)胞增殖情況，結(jié)果顯示與對(duì)照組相比，MTDH干擾組Hela細(xì)胞增殖受到顯著抑制，細(xì)胞增殖抑制率最高可達(dá)12.23%（圖2），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

3.3 干擾MTDH基因表達(dá)對(duì)Hela細(xì)胞侵襲能力的影響

Transwell法檢測(cè)對(duì)照組及MTDH干擾組Hela細(xì)胞侵襲能力，結(jié)果顯示MTDH干擾組Hela細(xì)胞侵襲能力下降為對(duì)照組的49.3%（圖3），改變明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

4 討論

MTDH是近年來新發(fā)現(xiàn)的一個(gè)癌基因，在乳腺癌、宮頸癌等多種腫瘤中高表達(dá)，如王明娟等[4]發(fā)現(xiàn)宮頸癌組織中MTDH蛋白陽性表達(dá)率明顯高于正常宮頸組織，認(rèn)為MTDH與宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。因此，MTDH可能是在很多腫瘤中進(jìn)行基因治療的理想靶點(diǎn)。目前已有研究者報(bào)道通過下調(diào)MTDH表達(dá)抑制各種腫瘤的發(fā)生及發(fā)展，如劉兆喆等[5]利用shRNA干擾MTDH抑制乳腺癌細(xì)胞侵襲能力；李榮國(guó)等[6]利用mir-22下調(diào)膠質(zhì)瘤細(xì)胞中MTDH蛋白表達(dá)，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞生長(zhǎng)受到明顯抑制。但將MTDH作為基因治療靶點(diǎn)應(yīng)用于宮頸癌治療的相關(guān)報(bào)道很少。因此，本課題針對(duì)干擾MTDH基因表達(dá)對(duì)宮頸癌Hela細(xì)胞增殖和侵襲的影響及其作用機(jī)制進(jìn)行了初步研究。

本課題首先用RNA干擾技術(shù)抑制了宮頸癌Hela細(xì)胞中MTDH蛋白表達(dá)，然后針對(duì)Hela細(xì)胞增殖及細(xì)胞侵襲能力進(jìn)行了檢測(cè)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Hela細(xì)胞中MTDH表達(dá)下調(diào)后，細(xì)胞增殖及細(xì)胞侵襲能力均受到了明顯抑制，顯示在宮頸癌細(xì)胞中亦可通過干擾MTDH表達(dá)來抑制腫瘤的發(fā)生和發(fā)展，MTDH可能能夠作為潛在的靶點(diǎn)用于宮頸癌的基因治療。

本課題同時(shí)發(fā)現(xiàn)，在Hela細(xì)胞中，MTDH表達(dá)下調(diào)后，VEGF-A蛋白表達(dá)亦隨之下降，而E-Cadherin蛋白表達(dá)隨之上升。VEGF-A是血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子VEGF家族成員之一，能夠誘導(dǎo)腫瘤血管和淋巴管生成，為腫瘤生長(zhǎng)提供更多的氧氣和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，從而促進(jìn)腫瘤增殖[7]。E-cadherin能夠抑制腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移，是EMT的重要指標(biāo)之一。當(dāng)其表達(dá)下降時(shí)，往往伴隨著EMT的發(fā)生或發(fā)展，腫瘤細(xì)胞表型發(fā)生改變，侵襲轉(zhuǎn)移能力隨之增強(qiáng)[8]。由此可以推斷，MTDH表達(dá)下調(diào)進(jìn)而引起VEGF-A蛋白表達(dá)下降，從而降低Hela細(xì)胞增殖能力；而同時(shí)E-cadherin蛋白隨之表達(dá)增加，導(dǎo)致EMT現(xiàn)象減弱，Hela細(xì)胞侵襲能力受到抑制。

綜上所述，本課題發(fā)現(xiàn)干擾宮頸癌Hela細(xì)胞中MTDH基因表達(dá)后，可以明顯抑制Hela細(xì)胞增殖及侵襲能力，且對(duì)其中作用機(jī)制進(jìn)行了初步探討，具有一定的理論和實(shí)踐意義。

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