曹海營(yíng) 馮震 魏俊強(qiáng) 趙景新 于濤 金宇

摘要：目的 通過比較改良法與傳統(tǒng)法制作兔VX2骨腫瘤模型，明確改良法可明顯改善腫瘤細(xì)胞經(jīng)骨孔外滲情況。方法 取傳代VX2腫瘤荷瘤兔，將腫瘤制備成腫瘤組織塊，分別植入22只成年家兔雙側(cè)脛骨內(nèi)制成兔VX2骨腫瘤模型。所有家兔左側(cè)脛骨采用改良法植入腫瘤組織塊，即通過套管植入腫瘤組織并給予骨蠟封堵；而所有右側(cè)脛骨直接經(jīng)穿刺骨孔植入腫瘤組織塊。模型制作3w后，給予所有家兔患肢行彩色超聲檢查，明確有無軟組織包塊形成；同時(shí)處死家兔，取骨孔周圍軟組織行病理檢查，明確有無腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移。結(jié)果 造模3w后，雙側(cè)脛骨成瘤率100%。超聲顯示左側(cè)組發(fā)現(xiàn)軟組織包塊2例，右側(cè)組6例；病理檢查示左側(cè)組腫瘤細(xì)胞經(jīng)骨孔外滲率（23%，5/22小于右側(cè)組（55%，12/22）。將兩組穿刺骨孔腫瘤細(xì)胞外滲率進(jìn)行比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=4.69，P<0.05）。結(jié)論 改良法制作骨腫瘤模型可改善腫瘤細(xì)胞經(jīng)骨孔外滲情況，是一種較為理想的造模方式。

關(guān)鍵詞：VX2腫瘤；骨腫瘤；模型；病理學(xué)

Study on the Improved Method in Establishment of VX2 Bone Tumor Model in Rabbit

CAO Hai-ying，F(xiàn)ENG Zhen，WEI Jun-qiang，ZHAO Jing-xin，YU Tao，JIN Yu

（Chengde Medical College， Chengde 067000，Hebei，China）

Abstract：Objective To investigate the efficacy between the traditional method and the improved method in establishment of VX2 bone tumor model in rabbit in order to prove the improved method can improve tumor cells spreading. Methods After separating the VX2 tumor from cancer bearing VX2 rabbit， the tumor tissue blocks were prepared. the tissue blocks were embedded into the right tibias 22 rabbits through the puncture hole ，and all the puncture holes were closed by bone wax. Color Doppler Ultrasound was used to assess the soft enclosed mass near the puncture hole after 2 weeks. The pathological study also was carried out for the soft tissue near the holes after 14 days. Results Only 2 cases from the left group showed the soft mass around the puncture holes after 14 days， but there were 6 cases around the puncture holes of all the 22 cases of the right group. The pathological showed there were 5 cases（23%，5/22） that we can find the tumor cells in the soft tissue around the puncture hole in the left group， but 12 cases（55%，12/22）in the right group. The difference was statistically significant（χ2=4.69，P<0.05）. Conclusion The improved method was more convenient in operation and less tumor cells spreading in establishment of bone tumor model compared with the traditional method.

Key words：VX2 tumor；Bone tumor；Model；Pathology

目前由于我國(guó)人們生活方式及環(huán)境因素的改變，腫瘤特別是骨腫瘤的發(fā)病率呈逐年升高趨勢(shì)。VX2腫瘤一種可移植的惡性乳頭狀瘤，可移植在兔的肝臟，肺臟，骨骼肌肌肉等處，所建立的腫瘤模型具有較高的生物學(xué)特性[1～3]。由于VX2腫瘤對(duì)兔骨質(zhì)的侵犯及破壞作用與人類骨腫瘤較為類似，兔VX2骨腫瘤的研究備受學(xué)者青睞。良好的兔骨腫瘤模型是實(shí)驗(yàn)研究成功的第一步，然而造模過程中經(jīng)常遇到腫瘤細(xì)胞經(jīng)骨孔外滲等困難。本實(shí)驗(yàn)中，通過改良法與傳統(tǒng)法植入腫瘤細(xì)胞制造兔骨腫瘤模型對(duì)比，明確改良法可改善腫瘤細(xì)胞經(jīng)骨孔外滲情況。

1 資料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 新西蘭成年家兔22只，月齡4個(gè)月，體質(zhì)量2～3kg，雌雄不限，所有動(dòng)物進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)兔舍圈養(yǎng)，衛(wèi)生水及標(biāo)準(zhǔn)兔飼料喂養(yǎng)。本實(shí)驗(yàn)遵循承德醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物保護(hù)及使用規(guī)定，遵循醫(yī)學(xué)倫理學(xué)要求。

1.2實(shí)驗(yàn)器材及儀器 超聲診斷掃描儀采用Medical Systems-LOGIQ9（GE公司，美國(guó)）；OLYMPUS-BX53光學(xué)顯微鏡（OLYMPUS公司，日本）；VX2腫瘤株由廣州吉妮歐生物試劑公司提供。

1.3兔VX2肌肉腫瘤模型制備

1.3.1腫瘤細(xì)胞懸液及瘤塊組織制備 取傳代荷瘤VX2種兔1只，經(jīng)耳緣靜脈注射3%戊巴比妥鈉（1ml/kg）麻醉后，瘤區(qū)去毛俯臥位保定于操作臺(tái)上，剪開皮膚，分離皮下組織、腫瘤，將腫瘤完整取出；將腫瘤置于37℃磷酸鹽緩沖液（PBS）中，仔細(xì)分離腫瘤組織，去除壞死及周圍纖維組織；無菌條件下將腫瘤組織剪成1mm×1mm×1mm大小的組織塊，以上操作均于超凈工作臺(tái)內(nèi)完成。

1.3.2骨腫瘤模型制備 經(jīng)耳緣靜脈注射3%戊巴比妥鈉（1ml/kg）麻醉后，分別給予所有家兔后肢毛發(fā)去除，俯臥位固定于操作臺(tái)上，常規(guī)碘伏消毒，鋪無菌孔單。于脛骨干骺端內(nèi)側(cè)較平坦處作1cm長(zhǎng)皮膚切口，分離皮下組織暴露脛骨后，用1.6mm克氏針經(jīng)脛骨近端關(guān)節(jié)面穿刺，克氏針與脛骨長(zhǎng)軸平行，將克氏針?biāo)腿朊劰巧隙嗡枨?cm左右。將直徑為1.5mm套管插入左側(cè)脛骨骨孔，將少許腫瘤組織塊沿套管植入，應(yīng)用頂棒將其頂入髓腔內(nèi)。然后拔除套管，骨蠟封堵骨孔（見圖1）。同時(shí)，用無菌鑷夾持腫瘤組織塊少許（與左側(cè)相等），直接放入右側(cè)骨孔內(nèi)，然后給予骨蠟封堵骨孔。給予骨孔周圍酒精擦拭，逐層縫合切口。

圖1 改良法植入腫瘤組織示意圖：a示將套管插入骨孔，b示將頂棒將腫瘤組織塊經(jīng)套管植入髓內(nèi)，c示腫瘤組織塊植入髓內(nèi)后，骨蠟封堵骨孔。

1.4超聲評(píng)估 模型制備21d后，給予所有家兔雙脛骨部位行超聲檢查，明確穿刺骨孔周圍有無軟組織包塊形成。

1.5病理檢查 模型制備21d后，經(jīng)耳緣靜脈空氣栓塞法處死所有家兔，取脛骨穿刺骨孔外軟組織并浸泡于4%甲醛溶液中固定，然后進(jìn)行石蠟包埋，切片并進(jìn)行HE染色，與病理學(xué)醫(yī)師共同探討鏡下結(jié)果，將左側(cè)組、右側(cè)組病理結(jié)果進(jìn)行對(duì)比分析。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用統(tǒng)計(jì)學(xué)知識(shí)，將左、右側(cè)組腫瘤細(xì)胞骨孔外滲率進(jìn)行χ2檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1超聲檢查結(jié)果 模型制備21d后，超聲檢查時(shí)左側(cè)組骨孔旁軟組織發(fā)現(xiàn)包塊2例，右側(cè)組6例。

2.2大體解剖結(jié)果 模型制備后21d后，處死家兔，對(duì)所有家兔下肢進(jìn)行解剖，發(fā)現(xiàn)脛骨成瘤率100%，左側(cè)組發(fā)現(xiàn)骨孔周圍軟組織包塊2例，右側(cè)組6例，同超聲檢查結(jié)果相符。

2.3病理檢查結(jié)果 取骨孔外軟組織行病理檢查，左側(cè)組骨孔周圍軟組織發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞5例，右側(cè)組發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞12例，顯微鏡下可見外滲的腫瘤細(xì)胞核大深染，胞質(zhì)較淡（見圖2）。將左側(cè)組與右側(cè)組腫瘤細(xì)胞經(jīng)骨孔外滲率進(jìn)行χ2檢驗(yàn)（見表1），χ2=4.12，P<0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖2 a示正常肌肉組織在HE染色低倍鏡（×10）下觀察未見腫瘤瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移的病理圖片；b穿刺骨孔周圍軟組織經(jīng)HE染色后高倍鏡（×40）下觀察可見腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移，可見肌肉組織中含核大深染的腫瘤細(xì)胞

3 討論

近年來隨著我國(guó)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展、人民生活方式的改變，惡性腫瘤已成為中國(guó)居民死亡的主要原因，骨腫瘤的發(fā)病率也呈逐年升高趨勢(shì)。早期發(fā)現(xiàn)、正確診斷、及時(shí)治療對(duì)腫瘤預(yù)后有著重要影響[4]。

兔VX2腫瘤是由Shope病毒在兔皮膚上誘發(fā)乳頭狀瘤衍生的鱗狀細(xì)胞癌，經(jīng)歷72次傳代培養(yǎng)后仍可種植于家兔體內(nèi)的腫瘤細(xì)胞株，具有生長(zhǎng)迅速、容易移植、侵襲性強(qiáng)、造模成功率高等優(yōu)點(diǎn)[5，6]。新西蘭種屬兔缺乏針對(duì)該腫瘤抗體，VX2腫瘤細(xì)胞可接種在兔的肝臟、肺臟，大腦，肌肉及骨骼等處，所建立的腫瘤模型具有較高的生物學(xué)特性[7～9]。由于VX2腫瘤對(duì)兔骨質(zhì)的侵犯及破壞作用與人類骨腫瘤較為類似，許多學(xué)者應(yīng)用其模仿人轉(zhuǎn)移性骨腫瘤來研究[10]。

目前VX2腫瘤模型制作常用兩種方法，一種方法是將腫瘤組織經(jīng)過離心、細(xì)胞計(jì)數(shù)等制作成腫瘤細(xì)胞懸液，注入需要相應(yīng)器官或組織內(nèi)。另一種方法是將腫瘤組織碎塊剪成碎塊，然后通過外科手術(shù)方式植入相應(yīng)器官或組織內(nèi)。在制作VX2肝癌模型中，有研究[11]認(rèn)為組織塊包埋組制作的肝癌腫瘤模型較細(xì)胞懸液相比具有腫瘤形狀規(guī)則，生長(zhǎng)較均一等優(yōu)點(diǎn)，但在骨VX2腫瘤模型制造中，腫瘤組織塊植入法制作骨腫瘤模型應(yīng)用較為廣泛。由于脛骨髓腔內(nèi)壓力與外界不同及髓內(nèi)出血等因素，當(dāng)腫瘤組織植入髓內(nèi)時(shí)易被溢出而污染骨孔周圍軟組織，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)失敗，而本實(shí)驗(yàn)?zāi)康脑谟趹?yīng)用一種新的方法來將腫瘤組織植入骨孔內(nèi)，避免或改善腫瘤細(xì)胞經(jīng)骨孔外滲情況，從而避免骨孔周圍軟組織污染。

本實(shí)驗(yàn)將VX2腫瘤組織分別在無菌條件下制成腫瘤組織碎塊，并將其通過外科手術(shù)方式分別植入22只新西蘭大白兔雙側(cè)脛骨髓腔內(nèi)。左側(cè)脛骨在植入腫瘤組織塊時(shí)，先將自制的管徑略小于骨孔的金屬套管插入骨孔內(nèi)，在將腫瘤組織碎通過套管植入家兔脛骨髓腔內(nèi)，然后拔除套管，用骨蠟給予骨孔封堵。右側(cè)組應(yīng)用無菌鑷夾持少許腫瘤組織塊直接經(jīng)骨孔植入脛骨髓腔內(nèi)。改良法的優(yōu)點(diǎn)在于應(yīng)用金屬套管插入骨孔的同時(shí)，對(duì)骨孔產(chǎn)生了物理隔離，在腫瘤組織塊植入過程中，避免腫瘤組織被髓內(nèi)血液溢出或殘余腫瘤組織留在骨孔外而污染骨孔周圍軟組織的可能。而建模后14d的病理檢查也驗(yàn)證這一結(jié)論，建模后14d取骨孔周圍軟組織，行病理檢查示改良法植入組有5例發(fā)現(xiàn)骨孔周圍軟組織有腫瘤細(xì)胞浸潤(rùn)，而傳統(tǒng)法組發(fā)現(xiàn)有12例。發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞浸潤(rùn)的軟組織顯微鏡下可見瘤細(xì)胞呈圓形或不規(guī)則形，核大深染，核分裂像多見，細(xì)胞排列紊亂，細(xì)胞間質(zhì)少。對(duì)兩組骨孔腫瘤細(xì)胞外滲率進(jìn)行χ2檢驗(yàn)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明改良法植入腫瘤組織塊制作骨腫瘤模型可明顯改善腫瘤細(xì)胞外滲情況。

同時(shí)，改良法植入腫瘤組織塊制作VX2骨腫瘤模型操作較為簡(jiǎn)單，具備一般外科基本操作技能即可完成，是一種理想的VX2骨腫瘤模型制作方法。

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編輯/成森