張永香/福建福州大北農(nóng)生物技術有限公司 陳海南/湖北襄陽襄州畜牧獸醫(yī)局

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豬瘟的實驗室診斷與預防措施

張永香/福建福州大北農(nóng)生物技術有限公司 陳海南/湖北襄陽襄州畜牧獸醫(yī)局

豬瘟俗稱“爛腸瘟”，是一種高度接觸性傳染病，遍布全世界，世界動物衛(wèi)生組織將此病列為A類傳染病之一，我國也將其列為一類傳染病。該病是由豬瘟病毒(CSFV)引起豬的一種常見烈性傳染病，主要通過呼吸道和消化道傳染，一年四季都可發(fā)生，以春夏多雨季節(jié)為多，傳播速度快，發(fā)病率高，死亡率高。感染豬在潛伏期即可向外排毒；感染強毒株的病豬可持續(xù)排毒直至死亡，幸存者持續(xù)排毒到產(chǎn)生抗體；中等毒力或低毒力毒株會引起慢性傳染，可持續(xù)排毒或間歇性排毒到死亡。我國各地雖然對豬瘟都積極進行免疫，但豬瘟仍時有發(fā)生，并且非典型和溫和型豬瘟病例逐漸增多，造成的經(jīng)濟損失甚為慘重。主要傳播是通過直接或間接與感染野豬或家豬接觸經(jīng)口鼻傳播，或食入被污染的飼料。種公豬篩選不當，可通過配種將病毒傳播給受配母豬?；疾∧肛i可經(jīng)胎盤直接感染胎兒，誘發(fā)仔豬發(fā)病。消毒隔離不嚴，人群被視為豬群之間重要的傳播因素。

一、流行病學

家豬和野豬是豬瘟病毒的自然宿主，病豬和帶毒豬是最主要的傳染源。在自然環(huán)境下，傳播途徑為口鼻傳播、精液傳播和胎盤傳播。

二、臨床癥狀

（一）急性型

由豬瘟病毒強毒株引起，潛伏期在24～72 h，臨床上常見，病豬體溫41℃左右，呈稽留熱，喜歡臥地，弓背，走路搖晃或打寒戰(zhàn)，食欲減退甚至廢絕，飲水量增加，部分患豬可發(fā)生嘔吐。結膜發(fā)炎充血，眼睛有膿性分泌物，流膿性鼻涕。病初便秘，后期出現(xiàn)腹瀉，糞便惡臭帶粘液或血液。鼻端、耳后根、腹部及四肢內(nèi)側皮膚及牙齦、唇內(nèi)、肛門等黏膜處出現(xiàn)針尖狀出血，由病初的充血逐漸發(fā)展為出血斑或發(fā)紺；腹股溝淋巴結腫大。有些病豬出現(xiàn)神經(jīng)癥狀，磨牙、轉圈、強直及游泳樣，甚至昏迷。公豬包皮發(fā)炎，用手擠壓時有渾濁的液體射出，惡臭難聞。懷孕母豬感染低毒力豬瘟病毒可表現(xiàn)為流產(chǎn)、產(chǎn)死胎、畸形胎、胎兒干尸化、弱胎或外觀健康但已經(jīng)感染的帶毒仔豬。

（二）慢性型

多由急性型轉變而來，體溫時高時低，主要表現(xiàn)為消瘦、貧血，全身衰弱，常伏臥、步態(tài)緩慢無力、食欲不振、便秘與腹瀉交替；有的病豬在耳端、尾尖及四肢皮膚上出現(xiàn)紫斑或壞死痂，病程一般在20 d以上，最后死亡，耐過豬成僵豬。

（三）遲發(fā)性

多數(shù)見斷奶后仔豬及架子豬，癥狀不明顯，較輕微，病情緩和，病程較長，皮膚無出血點。但有瘀血和壞死，食欲不振，排便時干時稀，致死率較高。耐過豬生長發(fā)育受阻，母豬耐過后長期帶毒，受胎率低、流產(chǎn)、死胎、木乃伊胎或畸形胎，所生仔豬先天感染，死亡或成為僵豬。

三、病理變化

（一）急性型

白細胞及血小板減少，全身皮膚、漿膜和內(nèi)臟器官有不同程度的出血；全身淋巴結腫大、多汁、充血、出血，呈暗紅色，切面周圍出血明顯，整個切面成紅白相間的大理石樣紋理或黑紅色外觀；典型癥狀是脾臟邊緣可見缺血性梗死；腎臟表面有密集或散在的大小不一的出血點或出血斑，出血部位以皮質表面最為常見，呈現(xiàn)所謂的“雀斑腎”外觀；盲腸、回盲瓣口及結腸黏膜出現(xiàn)有特征性的偽膜性壞死和大小不一的圓形紐扣狀潰瘍；喉頭、會厭軟骨、膀胱黏膜以及心外膜等也出現(xiàn)出血點或出血斑。

（二）慢性型

全身性出血變化不明顯，主要表現(xiàn)為壞死性腸炎，在盲腸、回盲瓣口及結腸黏膜上形成同心輪狀的紐扣狀潰瘍，突出于黏膜表面，顏色呈褐色，中央凹陷；全身淋巴組織萎縮；有診斷意義的是由于鈣磷失調表現(xiàn)為突然鈣化，從肋骨、肋軟骨聯(lián)合到肋骨近端常見有半硬的骨結構形成的明顯橫切線。

（三）遲發(fā)性

最典型的病理變化是胸腺萎縮，外周淋巴器官嚴重缺乏淋巴細胞。

四、實驗室診斷

根據(jù)臨床癥狀和病理變化可做初步診斷，確診需要進行實驗室診斷。目前已建立了多種對豬瘟抗原的檢測方法，下面主要介紹免疫熒光試驗、病原分離和回歸試驗及瓊脂擴散試驗3種檢測方法。

（一）免疫熒光試驗

此法簡便、快速、檢出率較高，許多國家和地區(qū)已將其作為豬瘟的法定診斷方法，此法也是我國進行實驗室診斷的最常用方法之一。

1.直接免疫熒光試驗。采取病料：取早期病豬或死亡豬的扁桃體、淋巴結和脾；中后期病豬取胰臟；病程長的患病豬以采集腎或副腎為宜。制成觸片或冰凍切片，室溫下用丙酮固定15 min，取出立即放入0.01 mol/L pH7.2的PBS中，輕輕漂洗3～4次。取出自然干燥后，盡快進行熒光抗體染色。將豬瘟熒光抗體滴加于切片表面，置濕盒內(nèi)于37℃作用30 min。取出后放入PBS中充分漂洗，最后用無離子水沖洗，自然干燥。再用0.5 mol/L pH9.0～9.5的碳酸鹽緩沖甘油封片，置熒光顯微鏡（激發(fā)光為藍紫光或紫外光）下檢查。如在扁桃體隱窩上皮細胞內(nèi)或腎曲小管上皮細胞漿內(nèi)見有黃綠色熒光斑（強毒株熒光明顯，弱毒株僅有微弱的熒光斑），即可判為豬瘟感染陽性。青灰色或帶橙色為陰性。如反差不明顯，亦可用1％伊文思藍復染，但需注意，復染后不要過度脫色。也可用豬源原代細胞或傳代細胞作單層培養(yǎng)時，加入蓋玻片。當形成單層時，種入病豬脾或其他組織浸出液，培養(yǎng)24～48 h，取出蓋玻片，風干、固定。用熒光抗體染色，方法同上。如細胞胞漿內(nèi)有亮綠色熒光斑，可判為陽性。

2.間接免疫熒光試驗。在病料組織片上，滴加1∶4抗豬瘟陽性血清，作用30 min后洗滌。再加羊抗豬IgG熒光抗體作用30 min，漂洗、干燥，進行熒光檢查，判定方法同上。此法簡易快速，可在2～3 h內(nèi)得出結果，檢出率可達91％～100％，但非特異性染色仍是一個值得注意的問題。

（二）病原分離和回歸試驗

這是最經(jīng)典和可靠的方法。采集病變典型的可疑組織，包括血液或臟器，經(jīng)研磨、超聲裂解、差速離心提取病毒，一方面可作病原檢測，另一方面再將病毒回歸到健康動物體內(nèi)，觀察是否出現(xiàn)豬瘟的典型癥狀。本法特異性高、敏感性強，最具診斷價值，但耗時、耗財。

1.病料的采集和處理。應采集扁桃體、脾、腎和回腸末段。扁桃體是豬瘟病毒感染后最先能檢測出病毒抗原陽性的組織，因而扁桃體是急性病例的首選病料?；啬c末段則是慢性病例的首選病料。病料應從多個病豬采集。采集的病料不加防腐劑、置低溫環(huán)境（冰盒中）中，盡快送到實驗室檢測。實驗室通常采用直接免疫熒光法和接種細胞培養(yǎng)分離病毒的方法進行病原學診斷。用熒光法檢測的病料要新鮮，用于病毒分離的病料還應過濾除菌。

2.病毒分離。用豬腎、睪丸的原代、次代或傳代細胞均可。病料經(jīng)研磨、離心、過濾除菌后接種細胞培養(yǎng)，細胞不出現(xiàn)病變。通常用熒光抗體法可測出細胞培養(yǎng)中蓋玻片上細胞漿內(nèi)的病毒抗原，亦可用新城疫病毒強化試驗檢測豬瘟病毒的存在。

3.豬體回歸感染試驗。豬是豬瘟病毒唯一的易感動物，用其作為實驗動物診斷本病是最可靠的方法。將易感仔豬（10～20 kg）分為三組，每組3～5頭。其中，一組接種豬瘟疫苗，另一組皮下注射豬瘟抗血清（1 ml/kg體重）。1周后三組同時接種被檢病料（血毒或病料乳劑1 ml/kg），繼續(xù)飼養(yǎng)2～3周。疫苗和抗血清免疫組不發(fā)病，未免疫組呈現(xiàn)臨床癥狀和病理變化，即可確診。該試驗結果確實可靠，但此過程需要嚴格的隔離條件，且耗時較長，僅在特別需要（如重要疫情）時及其它診斷方法很難確診時使用。

（三）瓊脂擴散試驗

通常采用雙向雙擴散法，可選用病豬脾、淋巴結做抗原（脾臟較好）。該法是將瓊脂糖按1％濃度加入pH8.6的硼酸鹽緩沖液中煮沸溶解，倒入平皿中，冷卻后置4℃保存。臨用時打孔，最常用的是在凝膠板上作成7孔圖形（中央打1孔，周圍打6孔）。檢測抗原時，在中央孔加入足夠效價的抗血清，周圍孔加已知抗原、陰性抗原和待檢樣品，置濕盒內(nèi)于37℃孵育。待檢樣品為陽性時，可于24～72 h內(nèi)出現(xiàn)沉淀線。由于抗原擴散較慢，常需在加抗血清之前2～4 h加入孔中。本法取材方便、操作簡單、易于判定，既可檢測抗原，也可檢測抗體，而且此法在病的急性期檢出率最高，但敏感性低，故一般不采用。

五、預防措施

（一）免疫接種

該病尚無特效藥物，采取免疫預防和及時淘汰感染豬是預防的最佳選擇?？山臃N的免疫疫苗，有豬瘟弱毒疫苗或與豬丹毒、豬肺疫制成的二聯(lián)苗或三聯(lián)苗。同時開展免疫監(jiān)測，了解抗體保護水平。對免疫豬群定期用酶聯(lián)免疫吸附試驗或正向間接血凝試驗等方法開展抗體監(jiān)測試驗，了解免疫豬群是否達到有效保護水平。建立種公豬及種母豬血清監(jiān)督系統(tǒng)和有效的公豬認證及記錄系統(tǒng)。避免生產(chǎn)出感染仔豬形成惡性循環(huán)，應用4倍量豬瘟兔化弱毒疫苗對能繁母豬進行配種前注射，結合檢測淘汰隱性感染豬。

（二）加強飼養(yǎng)管理

加強飼養(yǎng)管理，提高整個豬群的抵抗力。做好豬場的隔離、衛(wèi)生、消毒和殺蟲工作，減少豬瘟病毒的侵入。在生產(chǎn)區(qū)時，飼養(yǎng)員之間避免或盡量減少接觸，減少傳染的概率。購買種豬時，杜絕到疫區(qū)購買，嚴格檢疫程序。新進的豬應該隔離觀察21 d，確認是健康的豬之后再進行合群飼養(yǎng)。配種選擇優(yōu)質種公豬、種母豬，嚴格檢查精液質量，避免生產(chǎn)弱胎、畸形胎。

六、小結

豬瘟被我國列為一類動物疫病，發(fā)病急，死亡率高，發(fā)現(xiàn)應立即上報，劃定疫區(qū)，淘汰感染豬，避免出現(xiàn)大范圍暴發(fā)。免疫接種是豬瘟最佳的預防選擇，同時加強飼養(yǎng)管理，提高豬群抵抗力。根據(jù)臨床癥狀和病理變化可做初步診斷，確診需要進行實驗室診斷，常用的檢測方法有免疫熒光試驗、病原分離和回歸試驗和瓊脂擴散試驗等，養(yǎng)殖戶可根據(jù)實際條件進行實驗室診斷，確保早確診早隔離早淘汰，降低經(jīng)濟損失。