倪松，王聰，宋旭，高品，侯麗華（1．天津出入境檢驗(yàn)檢疫局動(dòng)植物與食品檢測(cè)中心，天津300461；．天津科技大學(xué)食品工程與生物技術(shù)學(xué)院，天津300457）

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高滲環(huán)境假絲酵母胞內(nèi)甘油和海藻糖代謝研究

倪松1，2，王聰2，宋旭1，*，高品2，侯麗華2
（1．天津出入境檢驗(yàn)檢疫局動(dòng)植物與食品檢測(cè)中心，天津300461；2．天津科技大學(xué)食品工程與生物技術(shù)學(xué)院，天津300457）

摘要：研究高滲環(huán)境中假絲酵母（T酵母）細(xì)胞內(nèi)海藻糖和甘油的代謝情況。利用微波破碎法這一傳統(tǒng)的物理破壁法來(lái)提取T酵母細(xì)胞內(nèi)甘油和海藻糖，并通過(guò)高效液相色譜儀測(cè)定細(xì)胞內(nèi)甘油和海藻糖的含量。經(jīng)過(guò)高效液相色譜測(cè)定，可以得到不同鹽濃度下T酵母胞內(nèi)甘油和海藻糖含量。T酵母在高滲環(huán)境中通過(guò)對(duì)甘油和海藻糖的積累，同時(shí)阻止甘油的外排作用來(lái)抵抗外界環(huán)境對(duì)其生長(zhǎng)的影響。

關(guān)鍵詞：假絲酵母；甘油；海藻糖；高效液相色譜

假絲酵母能在高滲透壓環(huán)境中存活引起了人們關(guān)注[1]。在1976年，Brown提出了相容溶質(zhì)可以在高滲透壓環(huán)境中對(duì)細(xì)胞起到保護(hù)作用[2]。之后，Brown[3]和Crowe[4]報(bào)道了甘油和海藻糖對(duì)保護(hù)細(xì)胞內(nèi)可溶性酶和細(xì)胞膜穩(wěn)定性起作用。在Kuniho NaKata[5]和Sukesh[6]對(duì)酵母耐鹽生長(zhǎng)試驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)了酵母通過(guò)合成海藻糖來(lái)抵抗高滲環(huán)境。目前，國(guó)內(nèi)主要研究魯氏酵母（S酵母）的耐鹽機(jī)理，很少研究T酵母[7]。本文將研究假絲酵母在高滲透壓環(huán)境中細(xì)胞內(nèi)海藻糖和甘油的代謝情況，為今后研究T酵母耐鹽機(jī)理提供參考。

1　材料與設(shè)備

1.1菌株

醬油發(fā)酵過(guò)程中的耐鹽產(chǎn)香酵母假絲酵母、米曲霉3.042來(lái)源于天津科技大學(xué)菌種保藏室。

1.2試劑

海藻糖為分析純：北京索萊寶科技有限公司；甘油為分析純：天津市天大化工實(shí)驗(yàn)廠；酵母提取物為分析純：英國(guó)賽默飛世爾科技；乙腈為色譜純：天津市科密歐化學(xué)試劑開(kāi)發(fā)中心；氯化鈉、蛋白胨、葡萄糖等試劑均為分析純：天津市化學(xué)試劑一廠。

1.3儀器設(shè)備

LRH-250-A生化培養(yǎng)箱：廣東省醫(yī)療器械廠；721型可見(jiàn)分光光度計(jì)：上海舜宇衡平科學(xué)儀器廠；冷凍離心機(jī)：Thermo Scientific，美國(guó)；微波爐：LG公司，韓國(guó)；微量進(jìn)樣器：Socorex，瑞士；高效液相色譜儀LC-20A型：島津公司，日本。

1.4方法

1.4.1不同鹽濃度條件下酵母生長(zhǎng)曲線的測(cè)定

取培養(yǎng)到對(duì)數(shù)期的假絲酵母菌懸液，將其按初始5×106cfu/mL的濃度分別接入到200 mL的0 %、8 %、16 %鹽濃度的YPDN培養(yǎng)基中，30℃，180r/min恒溫培養(yǎng)。自接種時(shí)間起每隔12 h取一次樣，用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)在600 nm處測(cè)其吸光值[8]。

1.4.2酵母胞內(nèi)甘油和海藻糖的提取

將不同時(shí)間點(diǎn)取得的樣品1 mL離心洗滌，取其中一管的假絲酵母菌菌體在80℃的烘箱中烘至恒重，計(jì)算每毫升發(fā)酵液中菌體的干重[9]。取另外一管的假絲酵母菌體利用微波破碎法[10]進(jìn)行胞內(nèi)甘油和海藻糖的提取。使用功率為700 W的微波爐進(jìn)行破碎，每次微波處理時(shí)間為1min，時(shí)間間隔為30 s。然后加入1 mL的去離子水，渦旋1min。然后在冰浴條件下反復(fù)抽提3次，每次20min。抽提完畢后離心。吸取上清液過(guò)0.22 μm的微孔濾膜過(guò)濾，過(guò)濾完成后的抽提液即可用于測(cè)定酵母胞內(nèi)甘油和海藻糖的含量。酵母胞內(nèi)甘油和海藻糖含量是每克菌體中所含的二者的質(zhì)量。

1.4.3甘油、海藻糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

分別準(zhǔn)確稱(chēng)取甘油標(biāo)品1.5 g，海藻糖標(biāo)品1.0 g（精確至0.000 2 g），其中海藻糖在稱(chēng)量之前在60℃條件下干燥5 h。用70 %的乙腈溶液溶解甘油和海藻糖并最終定容到100 mL的容量瓶中。再以配制好的甘油和海藻糖標(biāo)準(zhǔn)液為基礎(chǔ)，分別稀釋成3、6、9、12、15 mg/mL的甘油標(biāo)準(zhǔn)液和2、4、6、8、10 mg/mL的海藻糖標(biāo)準(zhǔn)液。利用高效液相色譜檢測(cè)標(biāo)品中的標(biāo)準(zhǔn)品的含量，色譜柱為Inertsil氨基柱，5 μm，4.6 mm×300 mm。色譜柱柱溫為30℃；流速為1.00 mL/min；檢測(cè)器為示差檢測(cè)器RID-10A；進(jìn)樣量為10 μ。

1.4.4樣品中甘油、海藻糖含量的測(cè)定

色譜柱為Inertsil氨基柱，5 μm，4.6 mm×300 mm。色譜柱柱溫為30℃；流速為1.00 mL/min；檢測(cè)器為示差檢測(cè)器RID-10A；進(jìn)樣量為10 μ[11-12]。流動(dòng)相為70 %過(guò)膜后的乙腈。將不同時(shí)間點(diǎn)提取的胞內(nèi)外甘油和海藻糖樣品依次進(jìn)樣，并將得到的色譜圖利用島津工作站[13]進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，確定保留時(shí)間和相對(duì)應(yīng)的峰面積。根據(jù)測(cè)得的峰面積代入到標(biāo)準(zhǔn)曲線求出樣品中甘油和海藻糖的含量。

2　結(jié)果與討論

2.1不同鹽濃度條件下酵母生長(zhǎng)情況

由于酵母進(jìn)入高滲環(huán)境時(shí)會(huì)迅速產(chǎn)生相應(yīng)的保護(hù)機(jī)制來(lái)適應(yīng)環(huán)境的變化，因此為了確定酵母對(duì)環(huán)境適應(yīng)的時(shí)間區(qū)段，有必要對(duì)其生長(zhǎng)曲線進(jìn)行測(cè)定確定酵母生長(zhǎng)各個(gè)時(shí)期的時(shí)間區(qū)段。酵母的生長(zhǎng)曲線見(jiàn)圖1。

由圖1可以清楚地看到酵母在12 h之后陸續(xù)進(jìn)入對(duì)數(shù)期[14]，開(kāi)始進(jìn)行大規(guī)模的生長(zhǎng)。在此之前酵母菌已經(jīng)產(chǎn)生對(duì)環(huán)境的適應(yīng)能力，因此選擇在12 h之內(nèi)選取時(shí)間點(diǎn)來(lái)對(duì)酵母的耐高滲能力進(jìn)行研究。

圖1　不同鹽濃度條件下酵母生長(zhǎng)曲線的測(cè)定Fig.1 The growth curve of T yeast under the different salt concentration

2.2酵母胞內(nèi)甘油和海藻糖含量的測(cè)定

2.2.1甘油和海藻糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)定

甘油和海藻糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖見(jiàn)圖2。

圖2?。╝）甘油的標(biāo)準(zhǔn)曲線；（b）海藻糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2（a）The glycerol standard curve；（b）The trehalose standard curve

利用高效液相色譜對(duì)假絲酵母胞內(nèi)甘油含量進(jìn)行測(cè)定，T酵母胞內(nèi)甘油含量見(jiàn)圖3。

由圖3可以觀察到0 %NaCl濃度下胞內(nèi)甘油在第1小時(shí)時(shí)達(dá)到最高，然后在后面的4 h內(nèi)下降達(dá)到最低點(diǎn)，在第5小時(shí)到第8小時(shí)胞內(nèi)甘油含量開(kāi)始上升，在第8小時(shí)后胞內(nèi)甘油含量下降，到第11小時(shí)時(shí)胞內(nèi)甘油含量趨于平穩(wěn)。8 %NaCl濃度下第1小時(shí)胞內(nèi)甘油含量比0 %第1小時(shí)降低61.5 %，在前6 h內(nèi)胞內(nèi)甘油含量一直降低，在第6小時(shí)到第8小時(shí)胞內(nèi)甘油又逐漸升高，但都比另外兩個(gè)鹽濃度下含量低，此后下降，到第11小時(shí)時(shí)小幅度上升。16 %NaCl開(kāi)始與0 %相同，但此后到第5小時(shí)在直線下降，第5小時(shí)到第8小時(shí)又在上升，但胞內(nèi)甘油含量處于0 %和8 %之間。第8小時(shí)后逐漸下降，第11小時(shí)后趨于平穩(wěn)。

圖3　T酵母胞內(nèi)甘油含量的測(cè)定Fig.3 The content of glycerol in the T yeast cell

2.2.3T酵母胞內(nèi)海藻糖含量的測(cè)定

利用高效液相色譜對(duì)假絲酵母胞內(nèi)海藻糖含量進(jìn)行測(cè)定，T酵母胞內(nèi)海藻糖含量見(jiàn)圖4。

圖4　T酵母胞內(nèi)海藻糖含量的測(cè)定Fig.4 The content of trehalose in the T yeast cell

由圖4可以觀察到假絲酵母在0 %NaCl濃度下，胞內(nèi)海藻糖在開(kāi)始的6 h內(nèi)波動(dòng)并且下降趨勢(shì)非常緩慢，在6 h后海藻糖含量直線下降。8 %NaCl濃度下胞內(nèi)前6 h與0 %NaCl條件下波動(dòng)類(lèi)似，后6 h平緩下降但胞內(nèi)海藻糖含量都比0 %時(shí)高。而16 %NaCl濃度下，胞內(nèi)海藻糖含量在第2小時(shí)時(shí)達(dá)到峰值，在前4 h胞內(nèi)海藻糖含量都比0 %、8 %NaCl濃度下的高，2 h后一直下降，第5小時(shí)降到最低，在第5小時(shí)到第7小時(shí)時(shí)胞內(nèi)海藻糖的含量又逐漸升高，第8小時(shí)后海藻糖含量逐漸降低，但也都比另兩個(gè)濃度下胞內(nèi)海藻糖含量高。

3　結(jié)論

通過(guò)對(duì)不同鹽度培養(yǎng)條件下酵母胞內(nèi)甘油和海藻糖含量的測(cè)定發(fā)現(xiàn)，T酵母在12 h的時(shí)候進(jìn)入指數(shù)生長(zhǎng)期，說(shuō)明酵母在12 h之內(nèi)已經(jīng)完成了對(duì)高滲環(huán)境的適應(yīng)，而在此期間比較適合選作用來(lái)對(duì)T酵母的耐高滲環(huán)境進(jìn)行研究。利用高效液相色譜法測(cè)定發(fā)現(xiàn)高滲透壓會(huì)誘導(dǎo)細(xì)胞迅速產(chǎn)生大量的海藻糖和甘油，培養(yǎng)基中的滲透壓越高，胞內(nèi)海藻糖和甘油也越高[15]。T酵母在高滲環(huán)境中通過(guò)對(duì)甘油和海藻糖的積累，同時(shí)阻止甘油的外排作用來(lái)抵抗外界環(huán)境對(duì)其生長(zhǎng)的影響。其中甘油的作用相對(duì)較小，而海藻糖在其耐高滲的過(guò)程中起著主要的作用。鹽度越高，甘油的合成量越大。

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Metabolism of Glycerol and Trehalose in the Cells of Candida Versatilis in Hypertonic Environment

NI Song1，2，WANG Cong2，SONG Xu1，*，GAO Pin2，HOU Li-Hua2
（1.Animal，Plant and Foodstuffs Inspection Center，Tianjin Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Tianjin 300461，China；2.College of Food Engineering and Biotechnology，Tianjin University of Science and Technology，Tianjin 300457，China）

Abstract：To study the metabolism of trehalose and glycerol in the cells of Candida Versatilis（T yeast）in the high osmotic environment.Using microwave crushing method the traditional physical wall breaking method to extract t yeast intracellular glycerol and trehalose，and by high performance liquid chromatography for the determination of the content of intracellular glycerol and trehalose.The contents of glycerol and trehalose in T yeast cells under different salt concentrations were determined by HPLC.The accumulation of glycerol and trehalose in the hypertonic environment of T yeast was also prevented by blocking the efflux of glycerol.

Key words：T yeast；glycerol；trehalose；HPLC

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2016.05.033

作者簡(jiǎn)介：倪松（1992—），男（漢），助理工程師，本科，研究方向：微生物檢測(cè)和發(fā)酵。

*通信作者：宋旭（1990—），男（漢），助理工程師。

收稿日期：2015-09-01