陳書(shū)華，姜旭，張念潔（.延邊朝鮮族自治州產(chǎn)品質(zhì)量檢驗(yàn)所，吉林延吉33000；2.北京澤優(yōu)醫(yī)藥科技有限公司，北京00000）

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人參果蔬酵素中人參皂甙含量的測(cè)定

陳書(shū)華1，姜旭2，*，張念潔1
（1.延邊朝鮮族自治州產(chǎn)品質(zhì)量檢驗(yàn)所，吉林延吉133000；2.北京澤優(yōu)醫(yī)藥科技有限公司，北京100000）

摘要：建立高效液相法色譜測(cè)定人參果蔬酵素中的人參皂甙Rg1、Re、Rb1、Rc、Rb2、Rd的含量，用于評(píng)價(jià)產(chǎn)品的優(yōu)劣。色譜條件：DiamonsilC18（250 mm×4.6 mm，5 μm）色譜柱，流動(dòng)相為乙腈與0.05 mol/L磷酸二氫鉀水溶液，流速1 mL/min，梯度洗脫檢測(cè)波長(zhǎng)為203nm。該方法對(duì)人參皂甙Rg1、Re、Rb1、Rc、Rb2、Rd具有良好的線性，相關(guān)系數(shù)在

0.9993～0.9999之間；重復(fù)性和精密度良好，樣品加標(biāo)回收率在92.00%～101.50%之間。RSD小于5%；檢出限低。該方法線性范圍廣，準(zhǔn)確性和精密度良好，操作較簡(jiǎn)便，結(jié)果滿意，能滿足日常檢驗(yàn)要求。

關(guān)鍵詞：人參果蔬酵素；人參皂甙；高效液相色譜

微生物酵素是以一種或多種新鮮蔬菜、水果、菌菇、中草藥等為原料，經(jīng)多種有益菌發(fā)酵而產(chǎn)生的，含有豐富的維生素、酶、礦物質(zhì)和次生代謝產(chǎn)物等營(yíng)養(yǎng)成分的功能性微生物發(fā)酵產(chǎn)品。微生物酵素不但保存了發(fā)酵原料中所固有的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，而且有不少有效成分大量增加，并產(chǎn)生了一些新的生物活性成分和生物酶[1]。研究證明：免疫系統(tǒng)是人機(jī)體內(nèi)一個(gè)重要的感受和調(diào)節(jié)系統(tǒng)，益生菌和各種酶（酵素）使免疫細(xì)胞固有的識(shí)別和記憶功能正常。當(dāng)免疫細(xì)胞因?yàn)樽R(shí)別和記憶發(fā)生障礙，攻擊和損傷正常細(xì)胞組織時(shí)，會(huì)發(fā)生自身免疫疾病。如I型胰島素依賴糖尿病，可能就是免疫細(xì)胞對(duì)胰腺中B細(xì)胞進(jìn)行破壞，控制血糖胰島素的分泌減少，補(bǔ)充人參果蔬酵素調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞的功能，提高免疫細(xì)胞的識(shí)別能力，使免疫功能逐步的恢復(fù)到動(dòng)態(tài)平衡，進(jìn)而達(dá)到對(duì)治療糖尿病的輔助治療的作用。

人參果蔬酵素是由人參、蔬菜和水果為原料，經(jīng)過(guò)科學(xué)的生物轉(zhuǎn)化技術(shù)精制而成的純天然的植物飲料，營(yíng)養(yǎng)完整的酵素是萃取自人參及多種天然果蔬植物精華，再以植入有益菌種轉(zhuǎn)化成熟的全機(jī)能性天然食品，富含多種維生素、礦物質(zhì)和人體必需的氨基酸等，從中醫(yī)上講人參果蔬酵素具有補(bǔ)肝腎、益氣血、生津液、調(diào)節(jié)各個(gè)臟腑功能正常的作用。它對(duì)維護(hù)血管健康、強(qiáng)化微血管彈性有一定的作用?？勺鳛楦哐獕?、血管硬化、心臟疾病之輔助調(diào)養(yǎng)的食物，同時(shí)對(duì)預(yù)防腫瘤、抗衰老、抗心律失常、抑制細(xì)胞凋亡、降糖降脂、改善記憶、增強(qiáng)性功能和免疫功能及解酒等方面均有療效。人參果蔬酵素中含有人參皂甙、人參醇、人參多糖、揮發(fā)油、低分子肽、氨基酸、維生素及其有機(jī)酸和多種微量元素等多種成分，同時(shí)對(duì)于發(fā)酵液來(lái)說(shuō)，發(fā)酵過(guò)程中破壞了細(xì)胞組織，有利于有效成分的浸出。對(duì)于判定該物質(zhì)的優(yōu)劣，主要是從測(cè)定人參皂甙的含量來(lái)確定，人參皂甙主要包括有Rg1、Re、Rb1、Rc、Rb2、Rd等。含量測(cè)定方法有比色法[2]、薄層色譜法[3]、高效液相法[4]、超高速液相法[5]等。本文采用反相高效液相色譜法對(duì)人參果蔬酵素中人參皂甙Rg1、Re、Rb1、Rc、Rb2、Rd的含量進(jìn)行了測(cè)定。

1　材料與方法

1.1儀器與試劑

KQ-100B超聲波清洗儀：昆山市超聲儀器有限公司；1260 infinity高效液相色譜儀：美國(guó)安捷倫有限公司；Milli-Q Advantage Merck Millipore純水機(jī)：Merck Millipore USA；201s賽多利斯電子天平：北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司。

人參皂甙Rg1（批號(hào)AB421G）、人參皂甙Re（批號(hào)AB240G）、人參皂甙Rb1（批號(hào)AB120G）、人參皂甙Rb2（批號(hào)AB235G）、人參皂甙Rc（批號(hào)AB237G）、人參皂甙Rd（批號(hào)AB763G），以上標(biāo)準(zhǔn)品含量＞98 %：天津一方科技有限公司；乙腈、甲醇為HPLC級(jí)別：sigma公司；其他試劑均為分析純。

1.2色譜分析條件[6]

色譜柱：Diamonsil C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈與0.05 mol/L磷酸二氫鉀水，流動(dòng)相組成見(jiàn)表1；流速：1 mL/min；紫外檢測(cè)波長(zhǎng)：203 nm；進(jìn)樣量：20 μL；柱溫：室溫。洗脫溶劑梯度見(jiàn)表1。

表1　洗脫溶劑梯度表Table 1 The gradient of elution solvent

高效液相色譜圖見(jiàn)圖1。

1.3對(duì)照品的制備

精密稱(chēng)取人參皂甙Rg1、Re、Rb1、Rc、Rb2、Rd對(duì)照品，置于10 mL量瓶中，用甲醇溶解稀釋至刻度，超聲10min，得人參皂甙Rg1、Re、Rb1、Rc、Rb2、Rd對(duì)照品溶液作為儲(chǔ)備液，用0.25 μm針頭式濾膜過(guò)濾，初濾液棄去，續(xù)濾液備用。

1.4樣品的前處理

精密稱(chēng)取人參果蔬酵素溶液20.00 g，加入甲醇置75℃水浴回流1 h，冷卻后加正丁醇提取3次，濃縮至近干，加入甲醇定容5 mL。用0.25 μm針頭式濾膜，初濾液棄去，續(xù)濾液進(jìn)樣進(jìn)行液相色譜測(cè)定。

2　結(jié)果與討論

2.1線性方程、方法檢測(cè)限和精密度

標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備精密吸取人參皂甙Rg1、Re、Rb1、Rc、Rb2、Rd對(duì)照品2.0、4.0、6.0、8.0 mL分別置10 mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，分別吸取20 μL，注入液相色譜儀，按照1.2項(xiàng)下的方法測(cè)定，取其中一個(gè)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液重復(fù)測(cè)定6次，以峰面積與質(zhì)量濃度進(jìn)行一元線性回歸分析，計(jì)算峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，進(jìn)行線性關(guān)系、線性范圍、檢測(cè)限和精密度的測(cè)定。6種人參皂甙在較寬的濃度范圍內(nèi)均具有良好地線性、相關(guān)系數(shù)都大于0.99，檢測(cè)限較低，精密度較好，標(biāo)準(zhǔn)較好，見(jiàn)表2所示，最低檢出線以信噪比為3∶1計(jì)算。

表2　人參皂苷工作曲線、線性、檢測(cè)限和精密度（n=6）Table2 Theworkingcurve，linearities，detectionlimitsand RSD% of standard samples of ginsenosides（n=6）

2.2穩(wěn)定性試驗(yàn)

樣品溶液，按照1.2的方法在0、2、4、8、16、24 h分別進(jìn)樣20 μL，測(cè)定峰面積，結(jié)果人參Rg1+ Re、Rb1、Rc、Rb2、Rd，表明樣品溶液在24 h內(nèi)保持穩(wěn)定。見(jiàn)表3所示。

表3　人參皂苷穩(wěn)定性試驗(yàn)Table 3 Stability experiments of ginsenosides

2.3重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批人參果蔬酵素樣品6份，按1.2的方法測(cè)定峰面積，見(jiàn)表4所示，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在2 %以內(nèi)。

表4　人參皂甙重復(fù)性試驗(yàn)Table 4 Repeated experiment of ginsenosides

2.4加樣回收率試驗(yàn)

精密稱(chēng)取人參果蔬酵素樣品20 g，分別加入一定量的（3個(gè)梯度濃度）人參皂甙Rg1、Re、Rb1、Rc、Rb2、Rd混合對(duì)照品溶液，按1.4的制備方法及1.2的條件方法進(jìn)行測(cè)定，進(jìn)樣分析，每個(gè)平行樣6次平行測(cè)定，計(jì)算其回收率。結(jié)果表明，平均回收率92.00 %～101.50 %之間。見(jiàn)表5所示。

表5　人參皂苷加樣回收率的試驗(yàn)結(jié)果（n=6）Table 5 Results of recovery ratio of ginsenosides（n=6）

2.7樣品的含量測(cè)定

取按照1.4的方法處理得到的樣品處理液，按照1.2的下的方法測(cè)定，人參果蔬酵素樣品中含人參皂甙Rg1、Re、Rb1、Rc、Rb2、Rd的含量見(jiàn)表6所示。

表6　樣品中人參皂苷的含量（n=6）Table 6 The contents of in samples of ginsenosides（n=6）

3　結(jié)論

1）在樣品前處理的過(guò)程中經(jīng)過(guò)多種試驗(yàn)方法的比較，最終選擇該前處理方法，由于樣品劑型為果蔬酵素溶液，先用甲醇溶解去除樣品中的一些雜質(zhì)及蛋白質(zhì)，冷卻后加正丁醇提取3次，提取溶液中的皂甙成分。經(jīng)試驗(yàn)對(duì)比，該提取方法簡(jiǎn)單易行，回收率高。

2）液相檢測(cè)方法經(jīng)過(guò)多種試驗(yàn)方法的比較，同時(shí)測(cè)出樣品中的人參果蔬酵素中人參皂甙Rg1、Re、Rb1、Rc、Rb2、Rd的含量，本方法分離效果好，快速靈敏，穩(wěn)定?？梢愿鶕?jù)人參皂甙的含量來(lái)評(píng)價(jià)酵素的優(yōu)劣，為評(píng)價(jià)提供依據(jù)。

3）最近十幾年來(lái)微生態(tài)、酵素[7]水解被應(yīng)用到食品提取這個(gè)領(lǐng)域中來(lái)，采用酵素水解技術(shù)和生物發(fā)酵技術(shù)的處理更好的提高樣品的含量，此產(chǎn)品前處理簡(jiǎn)單，易提取，這次試驗(yàn)的結(jié)果為以后的制備人參皂苷制品及酵素制品提供了一定的參考價(jià)值。

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Determination of Panaxoside in Enzyme of Ginseng and Fruit and Vegetable by HPLC

CHEN Shu-hua1，JIANG Xu2，*，ZHANG Nian-jie1
（1.Yanbian State Product Inspection，Yanji 133000，Jilin，China；2.Beijing Zeyou Medeicine Technologies Co.，Ltd.，Beijing 100000，China）

Abstract：To determine the content of panaxosides，such as Rg1、Re、Rb1、Rc、Rb2、Rd in enzyme of ginseng and fruit and vegetable，to evaluate the quality of the products，the HPLC method was established.Chromatographic conditions：Diamonsil C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）chromatographic column，flow phase for acetonitrile and 0.05 mol/L KH2PO4aqueous solution，flow rate was 1 mL/min，gradient elution detection wavelength at 203 nm.The method had good linear correlation coefficient Rg1、Re、Rb1、Rc、Rb2、Rd and the correlation coefficient was between 0.999 3 and 0.999 9.The recovery rate was between 92 % and 101.50 %.RSD was less than 5 %，the detection limit was low.The method has a wide linear range，good accuracy and precision，the operation is simple，the results are satisfactory，can meet the daily inspection requirements.

Key words：enzyme of ginseng and fruit and vegetable；panaxosides；HPLC

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2016.05.027

作者簡(jiǎn)介：陳書(shū)華（1968—），男（漢），工程師，本科，研究方向：產(chǎn)品質(zhì)量檢測(cè)。

*通信作者：姜旭（1977—），女（漢），工程師，研究生，研究方向：食品質(zhì)量分析。

收稿日期：2015-11-02