蘭煒明，姜唯聲，謝曙英，徐銀，戴坤教，高曉暉，曾小軍(江西省寄生蟲病防治研究所，江西南昌330046)

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硫酸銨法提取血吸蟲感染兔血清IgG初探

蘭煒明，姜唯聲，謝曙英，徐銀，戴坤教，高曉暉，曾小軍
(江西省寄生蟲病防治研究所，江西南昌330046)

摘要：目的探索硫酸銨法提取血吸蟲感染兔血清IgG用于制備陽性參考品的可行性。方法采用飽和硫酸銨溶液對(duì)感染兔血清中IgG進(jìn)行沉淀分離，IHA試劑測定分離前后、凍干前后的抗體滴度以及凍干IgG復(fù)溶后的穩(wěn)定性。結(jié)果滴度為1：320的血吸蟲感染兔血清經(jīng)硫酸銨沉淀法提取IgG，經(jīng)透析、濃縮至原體積后抗體滴度為1：320，粗提IgG以陰性兔血清和蔗糖為凍干保護(hù)劑，凍干前、后滴度均為1：160；凍干IgG復(fù)溶0d、3d、6d和8d抗體滴度分別為1：160、1：80、1：40和1：40。結(jié)論硫酸銨沉淀法提取、凍干IgG不引起滴度改變，凍干保護(hù)劑的加入會(huì)使抗體滴度下降，凍干IgG復(fù)溶3d后滴度出現(xiàn)下降。因此，硫酸銨沉淀法可用于提取血吸蟲感染兔血清IgG。

關(guān)鍵詞：硫酸銨沉淀法；免疫球蛋白；血吸蟲；IHA

血清學(xué)檢查是血吸蟲病防治工作中篩查病人的主要方法之一[1]，江西省血吸蟲病疫區(qū)現(xiàn)場查病常采用IHA試驗(yàn)進(jìn)行初篩以確定化療對(duì)象[2，3]，而在IHA試驗(yàn)現(xiàn)場工作中，因操作或試劑的影響常有整塊檢測板呈現(xiàn)陽性或陰性的結(jié)果。為保證IHA試驗(yàn)結(jié)果的可靠性，在試驗(yàn)中使用陽性參考品進(jìn)行質(zhì)量控制顯得非常必要[4，5]。但在IHA試劑盒中，配備的陽性參考品的量均較少，而使用各實(shí)驗(yàn)室自己保存的陽性血清在經(jīng)過反復(fù)凍融后，亦易于出現(xiàn)抗體滴度下降及出現(xiàn)渾濁的現(xiàn)象[6]，不能滿足實(shí)際的使用要求。為避免上述的問題，本文探索一種簡便的血吸蟲感染兔血清免疫球蛋白（IgG）收集方法，以制備血吸蟲病陽性對(duì)照血清。

1　材料與方法

1.1材料陽性兔血清，陰性兔血清，血吸蟲IHA檢測試劑(江西環(huán)鄱科技發(fā)展有限公司，批號(hào)：20140419，20130206，20140509)；(NH3)2SO4，NaCl，蔗糖，Na2HPO4，KCl，BaCl2，以上試劑均為AR級(jí)（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司），批號(hào)分別為20130307，20121022，20121120，20040718，2008101 0，F(xiàn)20100519；KH2PO4，聚乙二醇6000（上海精化科技研究所），批號(hào)分別為060916，20001120；透析袋MD77（Solarbio，進(jìn)口分裝，截留分子量8000～14000Da）。

1.1.2陽性兔血清健康家兔腹部去毛經(jīng)皮膚人工感染1500條血吸蟲尾蚴，人工喂養(yǎng)45d后截?cái)囝i動(dòng)脈收集感染兔全血，室溫自然凝固后3000r/min，離心8min，收集陽性兔血清，－20℃冰凍保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.3陰性兔血清未感染家兔經(jīng)截?cái)囝i動(dòng)脈收集全血，室溫自然凝固后3000r/min，離心8min，收集兔血清，－20℃冰凍保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2方法硫酸銨沉淀IgG法

1.2.1飽和硫酸銨溶液配制稱取500g硫酸銨溶于500ml蒸餾水中，加熱到40℃，趁熱過濾，置室溫過夜，即得飽和硫酸銨溶液。

1.2.2 pH7.0 PBS緩沖溶液的配制分別準(zhǔn)確稱取8.0g NaCl，2.9g Na2HPO4，0.2g KH2PO4和0.2g KCl，少量蒸餾水溶解后定容至1000ml。

1.2.3透析袋預(yù)處理將透析袋剪成15cm長，用沸水煮5～10min，再用蒸餾水洗凈，置于4℃蒸餾水中備用。

1.2.4硫酸銨沉淀法收集IgG[7，8]陽性兔血清收集后混勻，取10ml于50ml離心管中，加10ml生理鹽水混勻，再取5ml飽和硫酸銨溶液逐滴滴入，使硫酸銨成20%飽和度（振蕩器邊滴邊混勻），4℃靜置30min，3000r/min，離心20min，棄沉淀，于上清中逐滴加入25ml飽和硫酸銨溶液并振蕩混勻，使硫酸銨成50%飽和度，4℃靜置30min，3000r/min，離心20min，棄上清；于沉淀中加入適量生理鹽水定容至10ml刻度，振蕩器溶解，加入5ml飽和硫酸銨，使成33%飽和度，3000r/min，離心20min，棄上清；重復(fù)兩次于沉淀中加適量生理鹽水至10ml刻度，溶解后加5ml飽和硫酸銨，3000r/min，離心20min，棄去上清的操作；獲得沉淀加生理鹽水定容至10ml溶解。

1.2.5透析將沉淀溶解后裝于透析袋中以自來水為透析液于4℃透析，不定期更換透析液，用1% BaCl溶液檢查透析袋中SO42－以確定透析完成。

1.2.6測定將聚乙二醇6000以PBS配成30%溶液，將透析完成后透析袋浸入，4℃濃縮12h，取出后定容至10ml，獲得IgG提取液（簡稱粗提IgG）。

1.2.4冷凍干燥以陰性兔血清和蔗糖作為凍干蛋白保護(hù)劑，加于獲得的IgG提取液8ml中，使溶液中含有10%陰性兔血清和5%蔗糖（簡稱凍干前IgG），200μl/管分裝，冷凍干燥后4℃保存（簡稱凍干后IgG）。

2　結(jié)果

2.1硫酸銨沉淀法粗提IgG前后抗體滴度變化對(duì)收集混勻后陽性兔血清及粗提IgG用不同批次血吸蟲IHA試劑檢測抗體滴度，抗體提取前后抗體滴度均為1：320，粗提IgG的抗體滴度與原血清抗體滴度一致，顯示提取IgG過程不會(huì)降低抗體的滴度。見表1。

表1　粗提IgG前后抗體滴度變化

2.2粗提IgG凍干前后抗體滴度變化粗提IgG以陰性兔血清和蔗糖溶液為蛋白保護(hù)劑，分別對(duì)凍干前IgG和凍干IgG用不同批次IHA試劑測定抗體滴度，粗提IgG抗體滴度為1：320，凍干前IgG和凍干IgG抗體滴度分別為1：160和1：160，結(jié)果表明凍干前IgG較粗提IgG出現(xiàn)一個(gè)滴度下降，但凍干前后抗體滴度保持一致。見表2。

表2　粗提IgG、凍干前、后抗體滴度變化

2.4凍干IgG復(fù)溶后抗體滴度的變化凍干IgG以200μl蒸餾水復(fù)溶，置4℃冰箱保存，不同時(shí)間以不同批次IHA試劑對(duì)其抗體滴度變化進(jìn)行小樣本檢測，第0d抗體滴度為1：160，第3d抗體滴度為1：80，第6d抗體滴度為1：40，第8d抗體滴度為1：40，結(jié)果顯示凍干IgG在復(fù)溶后，第3d即下降1個(gè)滴度，第6d后下降2個(gè)滴度，其后滴度不變。見表3。

表3　凍干IgG復(fù)溶后抗體滴度的變化

3　討論

血吸蟲病免疫學(xué)診斷常以IHA試驗(yàn)為主，因其具有較高敏感性、特異性的特點(diǎn)，在疫區(qū)的現(xiàn)場工作中常作為初篩的手段[9-11]。由于近年來血吸蟲病人群感染率和感染度均出現(xiàn)顯著下降[12]，IHA現(xiàn)場試驗(yàn)中亦常出現(xiàn)整塊IHA反應(yīng)板全部陰性的結(jié)果，因此在IHA試驗(yàn)過程中加入陽性質(zhì)控血清，可為檢驗(yàn)結(jié)果提供參考，以保證結(jié)果的可靠性。凍干質(zhì)控血清是臨床實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行室內(nèi)質(zhì)控和室間質(zhì)評(píng)常用的參考物之一[13，14]，為解決IHA試劑中陽性參照品量少或?qū)嶒?yàn)室自存陽性血清經(jīng)反復(fù)凍融后出現(xiàn)渾濁的現(xiàn)象，探索一種簡單的血吸蟲感染兔陽性血清中IgG提取方法，以獲得凍干IgG陽性參考品，對(duì)保證IHA實(shí)驗(yàn)質(zhì)量具有重要意義。

本研究通過硫酸銨沉淀法提取血吸蟲感染兔血清中的IgG，結(jié)果顯示具有非常好的效果，硫酸銨沉淀法在收集IgG中具有較高的收率，在提取前、后抗體滴度未發(fā)生改變；凍干過程中抗體滴度亦未發(fā)生改變；但在制備IgG凍干液的過程中，抗體滴度會(huì)出現(xiàn)1個(gè)滴度的下降，因此應(yīng)該選擇抗體滴度較高的血清進(jìn)行IgG的提??；對(duì)凍干IgG復(fù)溶后穩(wěn)定性進(jìn)行小樣本研究發(fā)現(xiàn)，復(fù)溶后的抗體滴度第3d即出現(xiàn)1個(gè)滴度的下降，顯示復(fù)溶后的抗體滴度下降較快，應(yīng)在3d內(nèi)用完，與報(bào)道的質(zhì)控品復(fù)溶結(jié)果相似[15]，但凍干IgG保存有效期的試驗(yàn)還需進(jìn)一步研究。綜上，硫酸銨法沉淀IgG是一種較方便且適宜的制備血吸蟲病陽性參考血清的方法。

參考文獻(xiàn)

[1]鐘子靜，曾小軍，姜唯聲，等.鄱陽湖沿湖居民血吸蟲病血清流行病學(xué)調(diào)查分析[J].實(shí)驗(yàn)與檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)，2009，27(2)：141-142.

[2]李軍宏，汪天平，肖祥，等.血吸蟲病中度流行區(qū)化療對(duì)象篩查方案的研究[J].中國血吸蟲病防治雜志，2002，14(6)：418-421.

[3]吳昭武，劉兆春，陽桂芬.采用間接血凝試驗(yàn)(IHA)確定湖區(qū)血吸蟲病中度流行區(qū)化療對(duì)象的可靠性分析[J].中國血吸蟲病防治雜志，2000，12(1)：21-23.

[4]高曉暉，姜唯聲，蘭煒明.溶血樣本對(duì)血吸蟲間接血凝試驗(yàn)檢測結(jié)果的影響[J].實(shí)驗(yàn)與檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)，2015，6(6)：798-799.

[5]陳健康，肖祥.溶血等因素對(duì)血吸蟲抗體檢測影響的實(shí)驗(yàn)觀察[J].安徽預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志，1999，5(4)：374-375.

[6]王文英，俞年生，陳衛(wèi)國，等.血清凍融次數(shù)對(duì)抗體效價(jià)影響的觀察[J].中國衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志，1993，3(1)：22-23.

[7]張和平，岳喜慶，馮巧萍，等.飽和硫酸銨法提取血清中IgG最佳條件的研究[J].中國乳品工業(yè)，2006，34(1)：4-8.

[8]王三虎，謝巖黎，張錄華.豬血清中免疫球蛋白提取工藝[J].鄭州糧食學(xué)院學(xué)報(bào)，1998，19(3)：75-78.

[9]林丹丹，劉躍民，胡飛，等.中國日本血吸蟲病常用診斷方法現(xiàn)場應(yīng)用價(jià)值的分析與評(píng)估I. IHA篩查法評(píng)估血吸蟲病疫區(qū)人群感染率的評(píng)價(jià)[J].中國血吸蟲病防治雜志，2008，20(3)：179-183. [10]陳年高，林丹丹，謝曙英，等.日本血吸蟲間接血凝試驗(yàn)診斷試劑盒臨床診斷效能[J].中國血吸蟲病防治雜志，2011，23(4)：377-379.

[11]佘有彬.四種血吸蟲病檢測方法在傳播控制地區(qū)病情監(jiān)測中的對(duì)比觀察[J].實(shí)驗(yàn)與檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)，2015，33(2)：237-238.

[12]雷正龍，鄭浩，張利娟，等. 2013年全國血吸蟲病疫情通報(bào)[J].中國血吸蟲病防治雜志，2014，26(6)：591-597.

[13]杜安全，趙春杰.介紹一種凍干質(zhì)控血清復(fù)溶方法[J].陜西醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)，1999，14(4)：14.

[14]張正飛.冰凍保存的復(fù)溶后凍干質(zhì)控血清適用性觀察[J].檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)與臨床，2009，6(20)：1731-1733.

[15]葉章發(fā)，雷志華，楊樺.冰凍保存復(fù)溶后凍干質(zhì)控血清標(biāo)本對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響[J].中國實(shí)用醫(yī)藥，2008，3(25)：64.

·讀者·作者·編者·

Extraction of IgG from serum of rabbit infected with Schistosoma japonicum by saturated ammonium sulphate

LAN Weiming，JIANG Weisheng，XIE Shuying，XU Yin，DAI Kunjiao，GAO Xiaojun，ZENG Xiaojun. Jiangxi Provincial Institute of Parasitic Disease，Nanchang 330046，China.

Abstract：Objective To explore the feasibility of preparing the schistosomiasis positive reference product by the method of ammonium sulfate precipitation to extract the IgG from the infected rabbits’serum of Schistosoma japonicum. Methods We used the saturated ammonium sulfate solution to precipitate and separate the IgG from the infected rabbits’serum. Compared the titer of infected rabbits’serum with the separated IgG，and compared unfreeze－drying titer of IgG with the freeze－drying by IHA，also studied the stability of freeze－drying IgG after we dissolve with water. Results The titer of the infected rabbits’serum was 1:320 used to extract IgG by the method of ammonium sulfate precipitation，we dialysised，concentrated the liquid of the extracted IgG to the original volume，the extracted IgG titer was 1:320. the negative rabbits’serum and sucrose as the protein protective agent added to the extracted IgG to freeze－drying，the extracted IgG titer of the unfreeze－drying and the freeze－drying were 1:160. The titer of the freeze－drying IgG dissolved in water changed with the time，the 0th，3rd，6th and 8th titer is 1:160，1:80，1:40 and 1:40 respectively. Conclusion All of the process of the ammonium sulfate precipitation method to extract the IgG and the freeze－drying can not chang the titer of the antibody，but the process adding the protein protective agent to the extracted IgG reduced the titer，the titer of freeze－drying IgG dissolve with water falled after the 3rd. The ammonium sulfate precipitation method is suitable for extracting the IgG from the infected rabbit serum.

Key words：Ammonium sulfate precipitation method；Immunoglobulin；Schistosoma；Indirect hemagglutination assay

(收稿日期2015-10-30；修回日期2016-03-23)

作者簡介：蘭煒明，男，1981年12月生，碩士學(xué)位，助理研究員，主要從事寄生蟲病診斷與防治研究。

基金項(xiàng)目：江西省衛(wèi)生廳科技計(jì)劃項(xiàng)目（編號(hào)：20143190）

DOI：10.3969/j.issn.1674－1129.2016.02.009

中圖分類號(hào)：R383.2+4，R446.62

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1674－1129(2016)02－0155－03