王　濤，洪　煬，傅志強(qiáng)，曹曉丹，呂　超，竇雪峰，許　瑞，韓　倩，賈秉光，趙枝新，林矯矯

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所 農(nóng)業(yè)部動物寄生蟲學(xué)重點(diǎn)開放實驗室，上海 200241）

大、小鼠來源32 d日本血吸蟲凋亡相關(guān)基因表達(dá)分析

王濤，洪煬，傅志強(qiáng)，曹曉丹，呂超，竇雪峰，許瑞，韓倩，賈秉光，趙枝新，林矯矯

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所 農(nóng)業(yè)部動物寄生蟲學(xué)重點(diǎn)開放實驗室，上海 200241）

大鼠為日本血吸蟲的非適宜宿主，而小鼠為日本血吸蟲的適宜宿主。前期研究表明細(xì)胞凋亡影響了日本血吸蟲在不同適宜性宿主體內(nèi)的生長發(fā)育，然而血吸蟲中存在哪些凋亡相關(guān)基因及凋亡通路? 哪些凋亡相關(guān)基因可能影響血吸蟲的生長發(fā)育？相關(guān)文獻(xiàn)報道較少。本研究構(gòu)建了日本血吸蟲全基因組本地BLAST數(shù)據(jù)庫，利用人的凋亡基因為索引搜索到了15個日本血吸蟲凋亡相關(guān)基因。 同時收集了大、小鼠來源32 d日本血吸蟲，利用熒光定量PCR分析了32 d蟲體中凋亡相關(guān)基因的表達(dá)情況，鑒定了大鼠和小鼠兩種不同適宜性宿主來源32 d日本血吸蟲差異表達(dá)的凋亡相關(guān)分子，為探討日本血吸蟲與不同適宜性宿主的相互作用機(jī)制提供了基礎(chǔ)。

細(xì)胞凋亡；凋亡基因；本地BLAST

日本血吸蟲?。⊿chistosomiasis）是我國動物疫病防控長期規(guī)劃中優(yōu)先防控的重要疾病之一[1]。日本血吸蟲具有逃避宿主免疫攻擊的機(jī)制，可在免疫系統(tǒng)正常的宿主體內(nèi)正常生存[2]。日本血吸蟲的生活史比較復(fù)雜，這也增加了血吸蟲病防治的難度。

細(xì)胞凋亡是細(xì)胞程序性死亡的一種方式，在機(jī)體清除受損或無用的細(xì)胞中發(fā)揮重要作用。近幾年，細(xì)胞凋亡在癌癥治療方面被給予了高度關(guān)注[3]。與正常細(xì)胞相比，凋亡基因在癌細(xì)胞中的表達(dá)水平存在顯著的差異，因此利用細(xì)胞自身帶有的“自殺”機(jī)制，即凋亡機(jī)制來治療癌癥具有相當(dāng)誘人的前景。從某種程度上說寄生蟲病也是一種“癌癥”[4]，因此對日本血吸蟲細(xì)胞凋亡的研究具有重要意義。

在中國，日本血吸蟲可自然感染包括人在內(nèi)的40余種哺乳動物[5]。早期流行病學(xué)調(diào)查時發(fā)現(xiàn)不同宿主對日本血吸蟲的感染具有不同的敏感性，如與大鼠相比，小鼠具有更高的易感性。盡管有研究表明細(xì)胞凋亡影響了日本血吸蟲在不同宿主體內(nèi)的生長發(fā)育[6]，然而對哪些凋亡相關(guān)基因和通路影響血吸蟲的生長發(fā)育仍鮮有報道。本研究利用日本血吸蟲非適宜性宿主Wistar大鼠和適宜宿主BALB/c小鼠為動物模型，收集了大、小鼠來源的32 d日本血吸蟲蟲體，利用RT-PCR技術(shù)分析不同宿主來源日本血吸蟲凋亡相關(guān)基因的表達(dá)情況，為進(jìn)一步闡明日本血吸蟲與不同適宜性宿主的相互作用機(jī)制及日本血吸蟲新藥物靶點(diǎn)的篩選提供了基礎(chǔ)。

1　材料和方法

1.1材料Wistar大鼠（5周齡、雄性）和BALB/c小鼠（5周齡、雄性）均購自上海斯萊克實驗動物有限公司；中國大陸株日本血吸蟲陽性釘螺由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所釘螺室提供；Trizol 購自Invitrogen公司; DEPC水、One-Step PrimeScript RTPCR Kit 和 SYBR?Premix EX TaqTMkit（Perfect Real-Time）均購自TaKaRa公司。

1.2日本血吸蟲全基因組本地BLAST數(shù)據(jù)庫建立首先從NCBI網(wǎng)站下載最新版本的本地BLAST程序包（Version BLAST-2.2.29+），然后從GeneDB下載日本血吸蟲全基因組數(shù)據(jù)庫（SchistoDB v3.0, http:// SchistoDB.net），最后按照本地BLAST數(shù)據(jù)庫建立方法建立日本血吸蟲全基因組本地BLAST數(shù)據(jù)庫。

1.3日本血吸蟲凋亡相關(guān)基因的搜索利用建好的日本血吸蟲全基因組本地BLAST數(shù)據(jù)庫，人的凋亡基因（表1）為Query sequence搜索日本血吸蟲的凋亡相關(guān)基因。

表1　人的凋亡基因Table 1　Human apoptosis genes

1.4大、小鼠來源32 d日本血吸蟲的收集將5只Wistar 大鼠和5只BALB/c小鼠采用腹部貼片法人工感染日本血吸蟲尾蚴。每只大鼠感染600條尾蚴，每只小鼠感染100條尾蚴。感染后32 d剖殺，利用37℃預(yù)熱的檸檬生理鹽水通過靜脈灌注法收集蟲體，用PBS緩沖液充分洗滌后液氮保存?zhèn)溆谩?/p>

1.532 d日本血吸蟲cDNA模板的制備取液氮保存的大、小鼠來源32 d蟲體，轉(zhuǎn)移至無RNA酶的EP管中，每管約150 mg。 加入1 mL Trizol并按照說明書提取各組日本血吸蟲蟲體總RNA。利用DNA酶去除基因組DNA后，用PrimeScript?RT reagent Kit反轉(zhuǎn)錄試劑盒將各組蟲體RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6熒光定量PCR檢測凋亡相關(guān)基因的表達(dá)量以1.5制備的大、小鼠來源14 d和32 d蟲體cDNA為模板，以日本血吸蟲SjNADH為內(nèi)參基因，利用SYBR ? Premix EX TaqTM（Perfect Real-Time）kit 試劑盒檢測大、小鼠來源32 d蟲體凋亡相關(guān)基因的表達(dá)水平，并進(jìn)行比較分析。日本血吸蟲凋亡相關(guān)基因的熒光定量PCR引物如表2所示。數(shù)據(jù)用2-ΔΔCT計算處理，用x±s表示，利用one-way ANOVA進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。實驗進(jìn)行3次獨(dú)立重復(fù)。

2　結(jié)果

2.1日本血吸蟲基因組本地BLAST數(shù)據(jù)庫建立按照NCBI本地BLAST數(shù)據(jù)庫手冊，成功建立了日本血吸蟲全基因組本地BLAST數(shù)據(jù)庫（結(jié)果未顯示）。

2.2日本血吸蟲凋亡相關(guān)基因的搜索以人的凋亡基因氨基酸序列為Query sequence，利用建好的日本血吸蟲基因組本地BLAST數(shù)據(jù)庫搜索日本血吸蟲的凋亡相關(guān)基因。結(jié)果共在日本血吸蟲基因組中找到15個與日本血吸蟲凋亡相關(guān)的基因，結(jié)果見表3。

2.3大、小鼠來源132 d日本血吸蟲凋亡相關(guān)基因的表達(dá)分析通過RT-PCR分析日本血吸蟲15個凋亡相關(guān)基因，結(jié)果顯示大、小鼠來源32 d蟲體中凋亡相關(guān)基因中，有4個基因（API、BAX、BIRP和CYC）在32 d大、小鼠來源蟲體中的表達(dá)差異無顯著性統(tǒng)計學(xué)意義；有11個基因（CASP7、IAP、BCL-2、TNFR、AIF、ATM、CASP3、CASP9、APAF、BAK和CIAP）在大、小鼠來源的蟲體中的表達(dá)差異具有顯著性統(tǒng)計學(xué)意義，其中有10個基因（BCL-2、TNFR、AIF、ATM、API、CASP3、CASP9、APAF、BAK和CIAP）在大鼠來源蟲體中高表達(dá)，僅1個基因（CASP7）在小鼠來源蟲體中高表達(dá)（圖1）。

3　討論

日本血吸蟲全基因組數(shù)據(jù)在2009年完成并發(fā)表在Nature雜志上[7]，這為日本血吸蟲細(xì)胞凋亡的研究提供了許多有利資源。盡管細(xì)胞凋亡在人等模式生物中的研究已經(jīng)比較透徹，但是關(guān)于日本血吸蟲凋亡基因及凋亡機(jī)制的研究仍處于起步階段。因此，可以借鑒人的凋亡基因相關(guān)信息進(jìn)行比對，尋找日本血吸蟲相應(yīng)的凋亡相關(guān)基因。通過建立日本血吸蟲本地BLAST數(shù)據(jù)庫和相似性搜索，我們發(fā)現(xiàn)相比于人類復(fù)雜的凋亡通路，日本血吸蟲的凋亡通路可能比較簡單，許多存在于人類中的凋亡基因在日本血吸蟲全基因組數(shù)據(jù)庫中搜索不到對應(yīng)的完整開放閱讀框。其次，通過BLAST搜索，我們發(fā)現(xiàn)日本血吸蟲凋亡相關(guān)基因與人類相應(yīng)的凋亡基因的相似性大都在30%左右，在進(jìn)化上屬于親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，但仍屬于同源的范疇。最終，我們共找到15個日本血吸蟲與凋亡相關(guān)的基因。通過對鑒定獲得的15個基因的進(jìn)一步分析，可以明確日本血吸蟲至少存在一條完整但相對簡單的內(nèi)源性凋亡通路，即線粒體通路。雖然日本血吸蟲也存在外源性通路的相關(guān)受體，如SjTNFR，但我們還沒有發(fā)現(xiàn)與TNFR胞內(nèi)區(qū)相互作用的接頭分子，仍無法確定日本血吸蟲是否存在一條外源性的凋亡通路，Lee等[8]也得出相似的結(jié)論。因此更多關(guān)于日本血吸蟲外源性凋亡通路分子的鑒定仍需要進(jìn)一步深入的研究。

圖1　大、小鼠來源日本血吸蟲凋亡相關(guān)基因表達(dá)量Fig. 1　Apoptosis-associated genes of S. japonicum from Wistar rats and BALB/c mice respectively

流行病學(xué)調(diào)查顯示大鼠為日本血吸蟲的非適宜性宿主，相比于適宜性宿主小鼠來說，大鼠體內(nèi)的蟲體生長發(fā)育狀況差，對宿主的病理性損傷小。研究表明不同適宜性宿主來源日本血吸蟲呈現(xiàn)的細(xì)胞凋亡差別是造成上述差異的重要原因之一[6]，然而其中哪些凋亡相關(guān)基因和凋亡通路參與及其作用機(jī)制仍鮮有報道。本研究通過熒光定量PCR對大、小鼠來源的32d日本血吸蟲的凋亡相關(guān)基因的表達(dá)情況進(jìn)行了比較分析，為填補(bǔ)這方面的空白積累了知識。

我們發(fā)現(xiàn)15個凋亡相關(guān)基因僅有4個（API、BAX、BIRP和CYC）在大、小鼠來源的32 d日本血吸蟲蟲體中的表達(dá)差異不具有顯著統(tǒng)計學(xué)意義，其余11個基因在兩種宿主來源的32 d日本血吸蟲中表達(dá)水平差異均具有顯著統(tǒng)計學(xué)意義。前期研究表明大鼠和小鼠來源日本血吸蟲細(xì)胞凋亡存在差異[9]，這些凋亡相關(guān)基因的差異表達(dá)可能是造成兩種宿主來源蟲體細(xì)胞凋亡現(xiàn)象不同的分子機(jī)制之一。進(jìn)一步分析表明，32 d日本血吸蟲凋亡相關(guān)基因有11個基因（CASP7、IAP、BCL-2、TNFR、AIF、ATM、CASP3、CASP9、APAF、BAK和CIAP）在大、小鼠來源的蟲體中的表達(dá)差異具有顯著性統(tǒng)計學(xué)意義，其中有10個基因（BCL-2、TNFR、AIF、ATM、API、CASP3、CASP9、APAF、BAK和CIAP）在大鼠來源蟲體中高表達(dá)，僅1個基因（CASP7）在小鼠來源蟲體中高表達(dá)。結(jié)果說明在日本血吸蟲32 d成蟲過程中，凋亡相關(guān)基因的差異表達(dá)可能是影響日本血吸蟲在非適宜性宿主—大鼠體內(nèi)生長發(fā)育的重要因素之一。通過對這些差異表達(dá)的凋亡相關(guān)基因的深入研究可能有助于我們進(jìn)一步了解日本血吸蟲的生長發(fā)育機(jī)制，同時這些凋亡相關(guān)基因也可能作為治療血吸蟲病的新藥物靶標(biāo)。本研究中凋亡相關(guān)基因序列比對分析表明，日本血吸蟲凋亡相關(guān)基因與人類相應(yīng)的凋亡基因的相似性，大都在30%左右，一些基因在蛋白結(jié)構(gòu)或表達(dá)量上與宿主存在的差異，使它們具有了作為血吸蟲新藥物靶標(biāo)的潛力。Kumar等[10]通過生物信息學(xué)分析表明血吸蟲CASP3/7與人類的CASP3/7在蛋白結(jié)構(gòu)上存在一定的差異，分析得出這些結(jié)構(gòu)上的差異正是血吸蟲CASP3/7作為新藥靶的基礎(chǔ)。

本研究建立了日本血吸蟲全基因組本地BLAST數(shù)據(jù)庫，并搜索到15個與日本血吸蟲凋亡相關(guān)的基因。通過分析大鼠和小鼠來源的32 d日本血吸蟲中15個凋亡相關(guān)基因的表達(dá)情況，進(jìn)一步鑒定了不同宿主來源的日本血吸蟲中細(xì)胞凋亡的差異表達(dá)基因，為進(jìn)一步闡明日本血吸蟲與不同適宜性宿主的相互作用機(jī)制及日本血吸蟲新藥物靶點(diǎn)的篩選提供了基礎(chǔ)。

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COMPARISON OF APOPTOSIS-ASSOCIATED GENES IN SCHISTOSOSMA JAPONICUM FROM WISTAR RAT AND BALB/C MOUSE

WANG Tao, HONG Yang, FU Zhi-qiang, CAO Xiao-dan, LV Chao, DOU Xue-feng, XU Rui, HAN Qian, JIA Bing-guang, ZHAO Zhi-xin, LIN Jiao-jiao

(Key Laboratory of Animal Parasitology of the Ministry of Agriculture, Shanghai Veternary Research Institute, CAAS, Shanghai 200241, China)

Schistosoma japonicum (S. japonicum) could infect more than 40 species of animals naturally. of which Mice are susceptible host to S. japonicum while rats are less-susceptible. Previous study have showed that apoptosis was one of the most important factors affect the development of S. japonicum in different susceptible host. However, what genes involved in the apoptosis pathway of S. japonicum? Which apoptosis associated genes might affect the development of S. japonicum. Still few study focused on these questions. The study built the whole genome BLAST database of S. japonicum fi rstly and dig out 15 apoptosis genes of S. japonicum using similarity search with human apoptosis genes. Meanwhile, 32 d S. japonicum worms from Wistar rats and BALB/c mice were collected separately. Real-time PCR analysis the expression level of these apoptosis associated genes in those worms. The results further identifi ed the different expression apoptosis associate genes in S. japonicum worms from different susceptible host and provided the foundation for proceeding further research on parasite-host interaction.

Apoptosis; apoptosis genes; local BLAST

S852.735

A

1674-6422（2016）03-0055-05

2016-03-18

國家自然科學(xué)基金（81271871、31172315）

王濤，男，碩士研究生，預(yù)防獸醫(yī)學(xué)專業(yè)

林矯矯，E-mail：jjlin@shvri.ac.cn