張淑琴，譚　斌，程世鵬

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所，長春130122）

·簡報(bào)·

牛病毒性腹瀉病毒基因2型毒株的分離與鑒定

張淑琴，譚斌，程世鵬

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所，長春130122）

本研究采用特異性RT-PCR從某實(shí)驗(yàn)室送檢MDBK細(xì)胞中分離到1株牛病毒性腹瀉病毒（Bovine viral diarrhea virus，BVDV），命名為BVDV-C1。通過免疫熒光、電鏡觀察和5'UTR 序列測定及分子進(jìn)化分析，結(jié)果表明其在MDBK 細(xì)胞中無細(xì)胞病變產(chǎn)生，應(yīng)用牛病毒性腹瀉病毒2型特異性單克隆抗體檢測，在感染細(xì)胞胞漿內(nèi)呈現(xiàn)特異性熒光信號(hào)，而牛病毒性腹瀉病毒1型特異性單克隆抗體未檢測到熒光。電鏡觀察病毒粒子呈圓形，有囊膜，直徑約為50 nm。5'UTR 序列分析表明該毒株屬于BVDV-2b 基因亞型。BVDV-C1 株的分離對(duì)進(jìn)一步開展疫苗研發(fā)、流行病學(xué)調(diào)查以及致病機(jī)理等方面的研究具有重要意義。

牛病毒性腹瀉病毒；細(xì)胞病變；分離；鑒定

牛病毒性腹瀉粘膜病是由牛病毒性腹瀉病毒（Bovine viral diarrhea virus，BVDV）引起的一種牛的重要傳染病。BVDV已經(jīng)在世界范圍內(nèi)成為養(yǎng)牛業(yè)一個(gè)危害性極大的病原，它的感染已造成養(yǎng)牛業(yè)的巨大經(jīng)濟(jì)損失。據(jù)估算，在美國，每100 萬犢牛中，由BVDV 感染造成的損失為2000～5700 萬美元[1]。BVDV 的感染可引發(fā)多種臨床疾病，包括呼吸系統(tǒng)疾病、生殖系統(tǒng)疾病、以及免疫抑制。還可以為其他致病原侵染動(dòng)物創(chuàng)造條件，造成繼發(fā)感染。

BVDV屬于黃病毒科（Flaviviridae）、瘟病毒屬（Pestivirus），與豬瘟病毒和邊界病毒同屬，抗原存在交叉反應(yīng)[2]。BVDV可以感染牛、羊和豬等多種家畜和野生動(dòng)物?；寂１憩F(xiàn)發(fā)熱、白細(xì)胞減少、腹瀉、流產(chǎn)、黏膜糜爛潰瘍等急性感染癥狀及小牛先天持續(xù)性感染[3]。同時(shí)由于BVDV常常污染牛血清，而牛血清在生物制品行業(yè)有著廣泛應(yīng)用，因此生物制品行業(yè)涉及到的細(xì)胞、胰酶、血清甚至疫苗均存在BVDV污染的可能[4]。

依據(jù)可否在培養(yǎng)細(xì)胞上產(chǎn)生細(xì)胞病變，將BVDV分為兩種生物型：致細(xì)胞病變型（cytopathic，CP）和非致細(xì)胞病變型（noncytopathic，NCP）。CP型可在接種后24～48 h內(nèi)造成細(xì)胞病變，表現(xiàn)為形成空泡、核固縮、細(xì)胞融合、拉網(wǎng)等現(xiàn)象。NCP型在細(xì)胞中復(fù)制不具有致細(xì)胞病變效應(yīng)，因此污染細(xì)胞也很難發(fā)現(xiàn)，被污染細(xì)胞再用于其他診斷或疫苗生產(chǎn)，很容易影響診斷結(jié)果的真實(shí)性及疫苗的免疫效果。

本研究從某實(shí)驗(yàn)室送檢的MDBK細(xì)胞中分離到1株病毒，該病毒株在MDBK 細(xì)胞中繁殖，但不產(chǎn)生細(xì)胞病變，通過特異性RT-PCR、免疫熒光和電鏡觀察試驗(yàn)，證明其為BVDV-2型病毒。

1　材料與方法

1.1病毒株及細(xì)胞BVDV JL株、BVDV陰性MDBK細(xì)胞均為中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所特種動(dòng)物分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存；細(xì)胞在含有6%的馬血清的DMEM培養(yǎng)基（購自Hyclone公司）中培養(yǎng)。

1.2主要試劑ExTaq DNA 聚合酶、PCR 試劑、pMD18-T 載體均購自寶生物工程（大連）有限公司；膠回收試劑盒購自AXY 生物工程有限公司；E. coli DH5α 由本實(shí)驗(yàn)室保存；抗BVDV-1和 BVDV-2單克隆抗體（MAb）由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所自制[5]。

1.3分子生物學(xué)鑒定取疑似污染細(xì)胞，按照Trizol 試劑盒說明書提取病毒RNA，用隨機(jī)引物將其反轉(zhuǎn)錄為c D N A，以鑒定引物進(jìn)行RT-PCR 擴(kuò)增，所用引物參照文獻(xiàn)[5]合成。BLT：5′-CATGCCCATAGTAGGAC-3′；BRT：5′-CCATGTGCCATGTACAG-3′。目的片段大小約為280 bp。同時(shí)設(shè)不加模板為陰性對(duì)照，以BVDVJL 株為模板的陽性對(duì)照。PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，膠回收目的片段，連接于pMD18-T載體中，轉(zhuǎn)化E. coli DH5α 感受態(tài)細(xì)胞，篩選重組質(zhì)粒，送交上海英駿公司測序。所測序列采用DNAStar軟件與BVDV 其他毒株序列進(jìn)行基因序列比對(duì)，并用Mega 繪制進(jìn)化樹。

1.4免疫熒光檢測（immunofluorescene assay，

IFA）將BVDV陰性MDBK細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板，細(xì)胞長成單層后，接種疑似污染MDBK細(xì)胞凍融液，并以BVDV-JL作陽性對(duì)照。置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d后，采用本實(shí)驗(yàn)室制備的BVDV-1型和BVDV-2型抗體進(jìn)行免疫熒光試驗(yàn)。

1.5病毒的電鏡觀察將疑似污染細(xì)胞凍融后，接種于長至80%單層的BVDV陰性MDBK 細(xì)胞，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 d后，凍融通過離心去除細(xì)胞碎片，取上清用2%磷鎢酸負(fù)染，透射電鏡下觀察。

1.7病毒TCID50測定取培養(yǎng)5 d的污染細(xì)胞凍融液經(jīng)10倍系列稀釋，接種于在96 孔培養(yǎng)板上已長至單層的MDBK 細(xì)胞。每個(gè)稀釋度接種8個(gè)孔，100μL/孔，同時(shí)設(shè)不接種病毒的正常清凈細(xì)胞對(duì)照孔，置于37℃、5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 d后固定，加入BVDV-2型熒光抗體染色后判定，記錄熒光陽性孔，按照Reed-Muench法計(jì)算病毒毒價(jià)。

2　結(jié)果與討論

2.1分子生物學(xué)鑒定應(yīng)用BVDV 特異性鑒定引物BLT 和BRT進(jìn)行擴(kuò)增，在疑似污染細(xì)胞培養(yǎng)液中擴(kuò)增出約280 bp 的單一目的片段（圖1），擴(kuò)增片段序列與GenBank進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果證實(shí)為BVDV 序列，命名為BVDV C-1 株。應(yīng)用BVDV C-1的5′UTR與瘟病毒屬參考毒株相應(yīng)序列進(jìn)行進(jìn)化樹分析，BVDV C-1與BVDV-1、BVDV-3參考毒株均不在一簇，親緣關(guān)系遠(yuǎn)，而與BVDV-2b參考株在一簇，親緣關(guān)系近。所以BVDV-C1應(yīng)屬于BVDV-2b基因亞型（圖2）。依據(jù)BVDV 5′UTR 序列不同可將BVDV分為2種基因型，目前，又有學(xué)者提出將Th/04_KhonKaen、D32/00-‘HoBi’和CHKaHo/cont等病毒歸為BVDV-3基因型[6]。在我國BVDV-1流行廣泛， BVDV-2 型僅有少量報(bào)道[7.8]。本研究通過5′UTR 序列比對(duì)及基因進(jìn)化分析，結(jié)果表明BVDV-C1屬于BVDV-2b 亞型，該毒株的分離為我國BVDV流行病學(xué)調(diào)查以及致病機(jī)理等方面研究具有重要意義。

圖1　牛病毒性腹瀉病毒BVDV-C1 株5′UTR 的PCR鑒定Fig.1　PCR identifi cation result of 5′UTR from BVDV-C1

圖2　牛病毒性腹瀉病毒BVDV-C1 株5′UTR基因進(jìn)化分析Fig.2　Phylogenetic analysis based on 5′UTR gene of BVDV-C1

2.2免疫熒光鑒定將疑似污染細(xì)胞和BVDV JL株的細(xì)胞培養(yǎng)液接種于MDBK單層細(xì)胞，培養(yǎng)3 d后固定，分別與BVDV-1和BVDV-2特異性單抗反應(yīng)，熒光顯微鏡觀察。應(yīng)用BVDV-1抗體檢測BVDV JL株感染細(xì)胞出現(xiàn)特異性熒光，病毒抗原主要分布于細(xì)胞漿中（圖3A），BVDV-2抗體檢測則沒有熒光。應(yīng)用BVDV-1抗體檢測疑似污染細(xì)胞無熒光，應(yīng)用BVDV-2抗體檢測可見細(xì)胞胞漿中出現(xiàn)特性熒光，而未接種病毒的MDBK 細(xì)胞無反應(yīng)（圖3C）。

圖3　牛病毒性腹瀉病毒BVDV-C1 株的免疫熒光鑒定（200×）Fig.3　Immunofluorescence assay (IFA) identification of BVDV-C1 in MDBK cells (200×)

2.3病毒的電鏡觀察BVDV-C1細(xì)胞培養(yǎng)上清用2%磷鎢酸進(jìn)行負(fù)染，透射電鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，病毒粒子略呈圓形，有囊膜，直徑約50 nm（圖4）。

圖4　BVDV-C1 電鏡圖片F(xiàn)ig.4　Electron microscope of negatively stained cell suspension

2.4病毒TCID50測定疑似污染細(xì)胞凍融液接種于96孔培養(yǎng)板測定病毒的TCID50，培養(yǎng)4 d后固定，通過BVDV-2熒光抗體染色后判定，按照Reed-Muench法計(jì)算病毒毒價(jià)為104.5TCID50/mL 。

[1] Houe H. Economic impact of BVDV infection in dairies[J]. Biologicals, 2003, 31: 137-143.

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ISOLATION AND IDENTIFICATION OF BOVINE VIRAL DIARRHEA VIRUS-2 FROM THE ESTABLISED MDCK CELL LINE

ZHANG Shu-qin, TAN bin, CHENG Shi-peng

(Institute of Special Economic Animal and Plant Sciences ,CAAS, Changchun 130122, China)

Bovine viral diarrhea virus 2 was isolated from the suspected contaminative MDBK cells. The virus isolate replicated in MDBK cells but did not induce cytopathogenic effect after fi ve passages. Eventually, the virus isolate was identifi ed in specifi c indirect immunofl uorescent assay, RT-PCR, electron microscopy and was designated as BVDV-C1. The MDBK cells infected with BVDV-C1 showed strong fl uorescent signal with BVDV-2 antibody. DNA fragment was amplifi ed in RT-PCR from 5'-UTR of the BVDV-C1. The homology comparison and phylogenetic analysis showed that it belonged to BVDV-2b. Under electron microscopy, virus particles were near round and enveloped with size of 50 nm in diameter. The isolation of BVDV-C1 provided a basis for further research on vaccination, epidemiology and pathogenecity of BVDV in China.

Bovine viral diarrhea virus; cytopathogenic; isolation; identifi cation

S 852.659.6

B

1674-6422（2016）03-0083-04

2015-09-29

中央級(jí)公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金項(xiàng)目（0032014016）

張淑琴，女，碩士研究生，預(yù)防獸醫(yī)學(xué)專業(yè)

程世鵬，E-mail：chengshipeng@caas.cn