張清，楊靜，陳經(jīng)勇，李鐘，張鵬，畢夢(mèng)娜，張上上，朱江偉，魯麗莎(四川省骨科醫(yī)院老年骨科，四川成都　610000)

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miRNA146a對(duì)軟骨細(xì)胞VEGF表達(dá)的影響

張清，楊靜*，陳經(jīng)勇，李鐘，張鵬，畢夢(mèng)娜，張上上，朱江偉，魯麗莎
(四川省骨科醫(yī)院老年骨科，四川成都610000)

摘要:目的研究在正常軟骨細(xì)胞及中期和晚期骨關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis，OA)軟骨細(xì)胞中激活或抑制miRNA146a后血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial groxth factor，VEGF)表達(dá)的變化規(guī)律，探索miRNA146a在OA發(fā)生、發(fā)展中的作用。方法收集正常人膝關(guān)節(jié)軟骨4例，OA患者膝關(guān)節(jié)軟骨12例。OA組又依據(jù)Kellgren-Lawrence的放射學(xué)診斷標(biāo)準(zhǔn)分為中期和晚期OA。通過(guò)化學(xué)轉(zhuǎn)染的方法轉(zhuǎn)染miRNA146amimic或miRNA146a inhibitor于各組軟骨細(xì)胞，測(cè)定激活或抑制miRNA146a后，VEGF蛋白水平表達(dá)的變化。結(jié)果正常人軟骨細(xì)胞中激活miRNA146a后，VEGF的蛋白水平較對(duì)照組及抑制組均出現(xiàn)明顯的上升，結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0．05);抑制miRNA146a后，VEGF蛋白水平下降，結(jié)果沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P≥0．05)。中期OA軟骨細(xì)胞表達(dá)VEGF水平高于晚期OA軟骨細(xì)胞，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0．05)。中期OA軟骨細(xì)胞激活miRNA146a后，VEGF的蛋白水平上升，結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0．05);抑制miRNA146a后，VEGF的蛋白水平下降，結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0．05)。晚期OA軟骨細(xì)胞激活miRNA146a后，VEGF的蛋白水平上升，結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0．05);晚期OA軟骨細(xì)胞抑制miRNA146a后，VEGF的蛋白水平下降，結(jié)果不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P≥0．05)。結(jié)論miRNA146a可調(diào)控軟骨細(xì)胞VEGF表達(dá)，從而參與OA的發(fā)生、發(fā)展。

關(guān)鍵詞:骨關(guān)節(jié)炎;miRNA146a;血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子;RNA干擾

骨關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis，OA)是由全身易感因素和局部機(jī)械因素相互作用導(dǎo)致的一種以關(guān)節(jié)軟骨退變?yōu)橹鞯某Ｒ?jiàn)老年性骨與關(guān)節(jié)退行性疾病。其主要的臨床表現(xiàn)為:關(guān)節(jié)疼痛、腫脹、畸形、活動(dòng)受限，X線片的主要表現(xiàn)為關(guān)節(jié)間隙變窄、軟骨下骨硬化、周?chē)琴樞纬伞Ｔ谲浌前l(fā)育過(guò)程中，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial groxth factor，VEGF)在促進(jìn)新生血管形成、維持軟骨細(xì)胞存活和軟骨基質(zhì)代謝等方面具有十分重要的作用。

近年來(lái)，生物醫(yī)學(xué)研究發(fā)現(xiàn)真核生物普遍存在miRNAs的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控作用。研究顯示［1］成人關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞中激活miRNA146a后可以引起VEGF表達(dá)水平升高，并且誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞肥大化最終發(fā)生凋亡，促使軟骨退變。miRNA146a調(diào)控VEGF與人類(lèi)OA軟骨細(xì)胞退變的作用機(jī)制尚不明確。本研究旨在探討miRNA146a調(diào)控VEGF在正常軟骨細(xì)胞及不同階段OA軟骨細(xì)胞中的作用及機(jī)制，對(duì)探索OA的發(fā)病機(jī)理及為將來(lái)基因治療提供理論依據(jù)。

1資料與方法

1．1對(duì)象于因外傷行截肢的患者取膝關(guān)節(jié)正常軟骨4例，根據(jù)病史、X線片、術(shù)中肉眼觀察、術(shù)后鏡下病理學(xué)排除標(biāo)本退行性變、腫瘤、結(jié)核、感染、明顯骨質(zhì)疏松以及合并免疫系統(tǒng)疾病、糖尿病等全身性疾病。根據(jù)美國(guó)風(fēng)濕病學(xué)會(huì)1995年修訂的膝關(guān)節(jié)OA診斷標(biāo)準(zhǔn)診斷為膝關(guān)節(jié)OA需行全膝關(guān)節(jié)置換術(shù)患者股骨髁軟骨12例，并根據(jù)Kellgren-Lawrence的放射學(xué)診斷標(biāo)準(zhǔn)分為中期OA組(3級(jí))6例和晚期OA組(4級(jí))6例。

收集患者一般資料，其中正常組男性4例，平均32．2歲(29～37歲)，左側(cè)1例，右側(cè)3例;OA組12例，男4例，女8例，平均68．1歲(57～85歲)，左側(cè)8例，右側(cè)4例。

1．2方法

1．2．1軟骨細(xì)胞培養(yǎng)用含青霉素(100 U/mL)、鏈霉素(100μg/mL)的PBS緩沖液沖洗膝關(guān)節(jié)軟骨組織數(shù)次后，在盛有DMEM/F12培養(yǎng)基的無(wú)菌培養(yǎng)皿中將軟骨修剪至1mm3大小;軟骨碎片放入50mL離心管中，低溫離心(1 000 r/min)5min;去除上清液，加入3倍體積的胰蛋白酶，于37℃消化振蕩40min，去除上清液，加雙抗的PBS液沖洗3次;然后添加3倍體積的Ⅱ型膠原酶消化，于37℃振蕩4～6 h后，低溫離心(2 800 r/min)5 min，去除上清液，再用DMEM/F12培養(yǎng)液沖洗3次;加入含10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基終止消化，用吸管輕輕吹打，使細(xì)胞懸液分布均勻;將細(xì)胞接種于25 cm2培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)(5mL/瓶)，將培養(yǎng)瓶置于37℃，5% CO2，飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。此后定期于倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)和貼壁生長(zhǎng)情況，待細(xì)胞貼壁后換液，以后每2～3天換液一次。原代培養(yǎng)細(xì)胞的覆蓋面積超過(guò)瓶子底部的80%時(shí)即可傳代。傳代時(shí)，PBS液清洗2次，加入0．25%胰蛋白酶1．5mL，在室溫下振蕩2～5 min;倒置相差顯微鏡下觀察貼壁細(xì)胞有收縮，成圓形，一些細(xì)胞開(kāi)始漂浮時(shí)即加入含胎牛血清培養(yǎng)液終止消化;加入新的培養(yǎng)液，輕輕吹打以使細(xì)胞分布均勻，從培養(yǎng)瓶的底壁使細(xì)胞完全脫落，收集細(xì)胞混合液，低溫離心(1 000 r/min)3min;去除上清液，PBS液清洗兩次，轉(zhuǎn)入含有10%胎牛血清DMEM/F12培養(yǎng)基，將細(xì)胞懸浮液接種于培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)繼續(xù)培養(yǎng)以用于進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)。

1．2．2轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)染前一天，于細(xì)胞培養(yǎng)板接種適當(dāng)數(shù)量的細(xì)胞，細(xì)胞培養(yǎng)板每孔中加入不含抗生素的培養(yǎng)基，使細(xì)胞密度達(dá)到30%～50%，以便轉(zhuǎn)染;在1 500μL培養(yǎng)基含有細(xì)胞的培養(yǎng)孔中加入miRNA146amimic/inhibitor-lipo 2 000混合液混合均勻;培養(yǎng)6 h后將含mimic/inhibitor-lipo 2 000混合液的培養(yǎng)基移去，更換新鮮培養(yǎng)基;于37℃的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48～96 h。

各組使用的試劑及劑量:對(duì)照組:含10%FBS的DMEM (L)培養(yǎng)基培養(yǎng);上調(diào)組:miRNA146a mimic 2．5μg+Lipo2000 5μg+10%的DMEM(L)2 mL;下調(diào)組:miRNA146a inhibitor 75pmol+Lipo2000 7．5μL+10%的DMEM(L)2mL。1．2．3 Western-Blot檢測(cè)VEGF蛋白表達(dá)每條泳道以40 μg蛋白量上樣，行7．5%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，濕法轉(zhuǎn)移將蛋白電轉(zhuǎn)到聚偏二氟乙烯(polyvinylidene di fluoride，PVDF)膜上，用5%脫脂奶粉封閉1 h，加入指定的一抗4℃孵育過(guò)夜，雜交反應(yīng)。以GADPH為內(nèi)參。

1．3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析每組實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次及以上，所有數(shù)據(jù)均以(±s)表示，采用SPSS17．0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行方差分析，P＜0．05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)　　果

2．1正常軟骨細(xì)胞干擾miRNA146a后VEGF的表達(dá)變化正常人類(lèi)軟骨細(xì)胞中，上調(diào)miRNA146a后，VEGF的蛋白水平較正常及抑制組均出現(xiàn)明顯的上升，結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;抑制miRNA146a后，VEGF蛋白水平下降，結(jié)果沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(見(jiàn)圖1)。

圖1　干擾正常軟骨細(xì)胞miRNA146a后VEGF變化

2．2中期和晚期OA軟骨細(xì)胞干擾miRNA146a后VEGF的表達(dá)變化中期OA軟骨細(xì)胞表達(dá)VEGF水平高于晚期OA軟骨細(xì)胞，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(見(jiàn)圖2)。中期和晚期OA軟骨細(xì)胞中，上調(diào)miRNA146a后，VEGF的蛋白水平較對(duì)照組及抑制組均出現(xiàn)相應(yīng)的上升，結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。且晚期OA軟骨細(xì)胞的VEGF的上升幅度大于中期OA軟骨細(xì)胞。中期OA軟骨細(xì)胞中，抑制miRNA146a后，VEGF的蛋白水平較對(duì)照組及激活組均出現(xiàn)相應(yīng)的下降，結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。晚期OA軟骨細(xì)胞中，抑制miRNA146a后，VEGF的蛋白水平叫對(duì)照組下降，結(jié)果不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(見(jiàn)圖3)。

圖2　上調(diào)中期、晚期OA軟骨細(xì)胞miRNA146a后VEGF變化

3討　　論

Taganov等［2］通過(guò)篩查人單核細(xì)胞中表達(dá)的200個(gè)miRNAs，發(fā)現(xiàn)miRNA146a/b是內(nèi)毒素響應(yīng)性基因，可被微生物基質(zhì)和前炎癥因子等所誘導(dǎo);通過(guò)啟動(dòng)子的分析，發(fā)現(xiàn)miRNA146a是依賴(lài)NF-κB的基因;通過(guò)miRNAs數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)miRNA146a/b與IL-1受體相關(guān)激酶1(Interleukin 1 receptor related kinases，IRAK1)和TNF受體相關(guān)因子6(tumor necrosis factor receptor-associated factor，TRAF6)的3'端不翻譯區(qū)(untranslated region，UTRs)匹配，這些UTRs抑制了相連報(bào)告基因的表達(dá)，它們編碼了兩個(gè)關(guān)鍵銜接分子:Toll樣受體和細(xì)胞因子受體的下游區(qū)，同時(shí)發(fā)現(xiàn)IRAK1和TRAF6基因是miRNA146a/b體內(nèi)轉(zhuǎn)錄后抑制的靶點(diǎn)。另外，Yamasaki等［3］對(duì)OA患者軟骨細(xì)胞miRNA146a的基因表達(dá)譜的研究發(fā)現(xiàn)，miRNA146a在患輕度OA的軟骨細(xì)胞有很高的表達(dá)，并且miRNA146a的表達(dá)同樣受白介素1(interleukin-1，IL-1)的影響。高表達(dá)miRNA146可以減少I(mǎi)L-1β調(diào)控的表達(dá)產(chǎn)物腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)，炎癥因子作為分解代謝因子在OA軟骨的退變中發(fā)揮著重要的作用。因此，miRNA146a在OA軟骨中表達(dá)，并參與了OA軟骨的分解代謝與合成代謝平衡。研究結(jié)果表明，miRNA146a是OA發(fā)生中軟骨病變的基因作用靶點(diǎn)。此外，Li［4］研究還證實(shí)miRNA146a對(duì)維持膝關(guān)節(jié)軟骨和滑膜的代謝平衡起著重要作用，并且通過(guò)調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)對(duì)OA所產(chǎn)生的疼痛起著重要作用，從而認(rèn)為miRNA146a是OA軟骨退變和關(guān)節(jié)疼痛的潛在治療靶點(diǎn)。

圖3　下調(diào)中期、晚期OA軟骨細(xì)胞miRNA146a后VEGF變化

有研究顯示，VEGF參與了OA中軟骨細(xì)胞的退變。VEGF在較低Mankin評(píng)分(Mankin評(píng)分小于8分)的OA患者脛骨平臺(tái)軟骨的淺表層中存在較高表達(dá)，而在較高M(jìn)ankin評(píng)分(Mankin評(píng)分9～14分)的OA患者軟骨中卻極少發(fā)現(xiàn)由VEGF誘導(dǎo)的血管化［6］，這一表達(dá)規(guī)律與miRNA146a的表達(dá)規(guī)律相符合。那么，miRNA的能否影響VEGF的表達(dá)水平呢?我們的結(jié)果顯示，上調(diào)正常軟骨細(xì)胞miRNA146a后，［5］VEGF的蛋白水平較正常及抑制組均出現(xiàn)明顯的上升;中期和晚期OA軟骨細(xì)胞中，上調(diào)miRNA146a后，VEGF的蛋白水平出現(xiàn)相應(yīng)的上升;而抑制miRNA146a后，中期OA軟骨細(xì)胞VEGF的蛋白水平出現(xiàn)相應(yīng)的下降。從而說(shuō)明miRNA146a可以影響VEGF水平，進(jìn)一步提示miRNA46a可以通路此途徑對(duì)OA的一系列病理過(guò)程產(chǎn)生影響。

有學(xué)者通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，軟骨內(nèi)VEGF表達(dá)水平與OA的嚴(yán)重程度成正比［7］。同時(shí)Saito發(fā)現(xiàn)，VEGF是OA病理過(guò)程中骨贅形成的最主要調(diào)節(jié)因子之一［8］。VEGF能促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞分化、增生、遷移、浸潤(rùn)，維持內(nèi)皮細(xì)胞功能，調(diào)控血管生成，并可增加血管通透性等。在OA軟骨中可以檢測(cè)出大量促炎因子和血管形成因子，這些因子作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞誘導(dǎo)產(chǎn)生水解酶并使血管基底膜降解，這一過(guò)程是新生血管形成的最基本過(guò)程，其中VEGF是最重要的調(diào)控血管形成因子［9］。

正常的成熟關(guān)節(jié)軟骨少量VEGF表達(dá)。而OA患者的軟骨和滑膜中VEGF及其受體的表達(dá)均明顯升高，參與血管化和炎癥反應(yīng)［9］。當(dāng)發(fā)生OA時(shí)，關(guān)節(jié)軟骨中抗血管生成因子的數(shù)量明顯減少，促血管生成因子如VEGF的數(shù)量明顯增加。關(guān)節(jié)軟骨中抗血管生成因子和促血管生成因子之間的平衡被破壞，導(dǎo)致血管從軟骨下骨長(zhǎng)入到關(guān)節(jié)軟骨中，進(jìn)一步加劇了OA的發(fā)展。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，VEGF在中期OA軟骨細(xì)胞的表達(dá)水平高于晚期OA，這可能是因?yàn)镺A的較早階段，炎癥反應(yīng)劇烈，VEGF等因子大量表達(dá)，參與血管化進(jìn)程，而到了OA晚期，軟骨已發(fā)生不可逆轉(zhuǎn)的變化，相關(guān)因子數(shù)量下降。miRNA146a調(diào)控的VEGF可能在OA病理過(guò)程中的炎癥反應(yīng)和病理性血管化具有重要作用［10］。

許多因子均可影響VEGF水平，例如LI-1、IL-17、TNFα、一氧化氮、活性氧等［11］，這些因子可能通過(guò)不同的途徑調(diào)節(jié)VEGF的表達(dá)。除了血管內(nèi)皮細(xì)胞和軟骨細(xì)胞，成骨細(xì)胞也是VEGF的靶點(diǎn)，其誘導(dǎo)成骨細(xì)胞趨化運(yùn)動(dòng)和增殖［12］，從而參與OA骨贅形成。Hashimoto［13］使用免疫組化檢測(cè)得出骨贅中的肥大軟骨細(xì)胞表達(dá)VEGF，也得出VEGF在骨贅形成的血管化中產(chǎn)生作用。另有文獻(xiàn)報(bào)道，VEGF可在體外水平上調(diào)軟骨細(xì)胞基質(zhì)金屬蛋白酶-1、3、13水平，下調(diào)基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑-1、2水平，引起細(xì)胞外基質(zhì)降解增加［14］。

VEGF在OA患者的滑膜和軟骨細(xì)胞中表達(dá)升高。一方面，升高的VEGF參與了OA病程的炎癥反應(yīng)和病理性血管化;另一方面，VEGF也可導(dǎo)致軟骨細(xì)胞肥大化、軟骨基質(zhì)降解和軟骨細(xì)胞凋亡，這些均是OA的重要病理表現(xiàn)。肥大軟骨細(xì)胞高表達(dá)VEGF，參與調(diào)控血管侵入軟骨、分泌MMPs和細(xì)胞外基質(zhì)重建，最終導(dǎo)致軟骨細(xì)胞凋亡。可見(jiàn)VEGF可上調(diào)基質(zhì)金屬蛋白酶并參與了骨贅的生成，在此低氧、機(jī)械應(yīng)力等情況下，抑制VEGF有望成為OA治療的途徑。本次試驗(yàn)結(jié)果也得出，miRNA146a可對(duì)VEGF的表達(dá)產(chǎn)生影響，可能具有重要的意義。抑制miRNA146a后，中期OA軟骨細(xì)胞VEGF的蛋白水平出現(xiàn)相應(yīng)的下降，為miRNA146a通過(guò)VEGF干預(yù)OA的病程提供了依據(jù)，探索了OA的基因治療的可能性。

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The M echanism ofm iRNA 146a Regulating VEGF in the Degenerative Process of OA Chondrocyte

Zhang Qing，Yang Jing，Chen Jingyong，et al
(Department of Elderly Orthopaedics，Sichuan Orthpaedics Hospital，Chengdu 610000，China)

Abstract:Objective To Study the expression changes of VEGF after up-regulated or down-regulated themiRNA146a in the normal chondrocytes and themiddle and late stage of the OA chondrocytes．To explore the role ofmiRNA146a in the development and progression of osteoarthritis．Methods We collected 4 cases of normal cartilage and 12 cases of arthritic cartilage which were divided intomiddle stage and late stage by Kellgren-Lawrence Imaging protocol．miRNA146amimic ormiRNA146a inhibitorwas chemically transfected to every group of chondrocyes．Then，we studied the changes of VEGF after up-regulating or down-regulating themiRNA146a chondrocytes．Results miRNA146a mimic increased the expression level of VEGF in the normal chondrocytes．The resultwas stastically significant(P＜0．05)．While miRNA146a inhibitor acted in a conversemanner．The resultwas not statistically significant(P≥0．05)．The protein expression level of VEGFwas higher in themiddle stage OA chondrocytes than that of the late OA stage chondrocytes，and the resultwas statistically significant(P＜0．05)．miRNA-book=238,ebook=50146amimic increased the expression level of VEGF inmiddle and late stage of the OA chondrocytes．The resultwas stastically significant(P＜0．05)．While miRNA146a inhibitor acted in a converse manner，and the result was stastically significant in middle stage of OA chondrocytes but isn't stastically significant in late stage of OA chondrocytes．ConclusionmiRNA146a may contribute to OA pathogenesis by regulating VEGF levels in chondrocytes．

Key words:osteoarthritis;miRNA146a;vascular endothelial groxth factor;RNA interference

作者簡(jiǎn)介:張清(1987－)，男，醫(yī)師，四川省骨科醫(yī)院老年骨科，610000。

收稿日期:2015-07-06

中圖分類(lèi)號(hào):R329．2+5

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A

基金項(xiàng)目:四川省科技廳科技支撐項(xiàng)目(2011FZ0040);*本文通訊作者:楊靜