魏樹強(qiáng)，孫振元，代小梅，錢永強(qiáng)

(中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院林業(yè)研究所，國(guó)家林業(yè)局林木培育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100091)

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多年生黑麥草LpGCS基因克隆及其在煙草中的初步功能驗(yàn)證

魏樹強(qiáng)，孫振元*，代小梅，錢永強(qiáng)

(中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院林業(yè)研究所，國(guó)家林業(yè)局林木培育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100091)

摘要：本研究以多年生黑麥草‘高帽2號(hào)’葉片為試材，根據(jù)同源基因的CDS序列設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物，采用RT-PCR和RACE技術(shù)，克隆了多年生黑麥草γ-谷氨?；腚装彼岷铣擅富騆pGCS。該基因全長(zhǎng)為1674 bp(GenBank登錄號(hào)：KJ551844)，具有完整的開放閱讀框(ORF)，共1125 bp；對(duì)其氨基酸序列特性、結(jié)構(gòu)以及與其他8種同源基因氨基酸序列間的同源性進(jìn)行了研究，預(yù)測(cè)該蛋白分子量為42.86 kDa，屬于不穩(wěn)定類蛋白質(zhì)，其蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)以α-螺旋為主；蛋白質(zhì)氨基酸序列與其他8種同源基因氨基酸序列間同源性都比較高；此外，成功構(gòu)建了該基因的正、反義植物表達(dá)載體pCAMBIA-Ubi-LpGCS+和pCAMBIA-Ubi-LpGCS-，并通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法獲得轉(zhuǎn)正、反義基因煙草。對(duì)轉(zhuǎn)基因植株和野生型煙草進(jìn)行鎘離子脅迫試驗(yàn)，生理生化指標(biāo)測(cè)試結(jié)果表明鎘離子脅迫處理10 d后，轉(zhuǎn)LpGCS+植株中MDA含量低于野生型，光合色素含量與POD、SOD、CAT活性均高于野生型；而轉(zhuǎn)LpGCS-植株中MDA含量高于野生型，光合色素含量與POD、SOD、CAT活性均低于野生型。綜上所述，LpGCS基因在煙草中的過量表達(dá)可以提高植株的耐鎘脅迫能力，為進(jìn)一步利用該基因轉(zhuǎn)化多年生黑麥草培育抗重金屬植株奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：多年生黑麥草；γ-谷氨?；腚装彼岷铣擅福换蚩寺?；功能驗(yàn)證

在植物抗氧化系統(tǒng)中，谷胱甘肽(glutathione， GSH)是植物應(yīng)對(duì)活性氧引起的氧化破壞中最為重要的細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)，其在硫的運(yùn)輸調(diào)控、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、代謝物質(zhì)的結(jié)合、外源化學(xué)物質(zhì)的解毒[1]和一些植物懸浮培養(yǎng)細(xì)胞和葉片中脅迫響應(yīng)基因(例如，PR1，GST，GPX，CHS，PAL，SOD等)的表達(dá)中起到了重要的調(diào)控作用[2]。谷胱甘肽是植物螯合肽合成的底物[3-4]，在低溫、重金屬、氧化等環(huán)境脅迫下，GSH的積累水平隨著脅迫時(shí)間延長(zhǎng)而增加[5-6]，而植物螯合肽富含Cys，通過其巰基與金屬結(jié)合而形成硫醇鹽，能夠提高植物對(duì)重金屬的抗性，解除重金屬對(duì)植物的毒害作用，并維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境中金屬離子濃度的相對(duì)穩(wěn)定[3,7-9]。因此，通過在植物中過量表達(dá)GSH合成相關(guān)基因能夠提高植物對(duì)非生物脅迫的抗性。

谷胱甘肽的合成是以氨基酸和ATP為底物，在γ-谷氨?；腚装彼岷铣擅?γ-glutamylcysteine synthetase，γ-ECS)和谷氨酸合成酶(GSH synthetase，GS)催化條件下完成的，其中γ-谷氨酰基半胱氨酸的合成是谷胱甘肽合成過程中的限速步驟[3]。在煙草(Nicotianatabacum)[10]、番茄(Lycopersiconesculentum)[11]、豌豆(Pisumsativum)[12]和水稻(Oryzasativa)[13]中過量表達(dá)γ-ECS或GS基因，能夠提高它們對(duì)非生物脅迫的抗性，并且其體內(nèi)谷胱甘肽的含量決定了其對(duì)逆境的抵抗能力，而當(dāng)谷胱甘肽合成被抑制時(shí)，高山離子芥(Chorisporabungeana)愈傷組織對(duì)冷害的抵抗能力下降[14]。

在重金屬脅迫下，草坪草的生長(zhǎng)受到顯著抑制[15]。本研究以多年生黑麥草(Loliumperenne)為材料，利用γ-谷氨酰基半胱氨酸合成酶(又稱作谷氨酸半胱氨酸連接酶，GCS)基因的同源保守序列設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物，采用RACE(rapid-amplification of cDNA ends)法克隆了GSH合成的關(guān)鍵酶基因，對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)分析及預(yù)測(cè)，并利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化煙草驗(yàn)證該基因的功能，為進(jìn)一步培育具有抗重金屬等非生物脅迫特性的多年生黑麥草新種質(zhì)資源奠定良好基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

1.1.1植物材料將多年生黑麥草‘高帽2號(hào)’成熟種子播種于中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院溫室大棚，2個(gè)月后取其新鮮葉片作為總RNA提取的實(shí)驗(yàn)材料，用液氮速凍，置于-80℃超低溫冰箱保存。

1.1.2菌株和載體普通連接載體pEASY-T3 Cloning Kit和感受態(tài)trans1-t1(Trans1-T1 Phage Resistant Chemically Competent Cell)均購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司。載體pCAMBIA1301-Ubi、根癌農(nóng)桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)菌種EHA105均由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.3主要生化試劑Qiagen RNeasy MiNi Kit(50)、DNase I、TakaRa LA Taq DNA 聚合酶、EcorI、Kpn I、QuickCut BamH I、T4DNA連接酶、SMARTerTMRACE cDNA Amplification Kit均購(gòu)自TaKaRa 公司。QuantScript RT Kit、D2000 DNA Marker、普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒購(gòu)自北京天根科技有限公司。寡核苷酸引物合成和所克隆基因片段測(cè)序均由北京華大生物技術(shù)有限公司完成。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1總RNA的提取與cDNA第一鏈的合成采用Qiagen RNeasy MiNi Kit(50)RNA提取試劑盒(TaKaRa 公司)提取多年生黑麥草葉片總RNA。經(jīng)DNase I(TaKaRa 公司)處理后，利用NanoDrop8000檢測(cè)在260，280及230 nm處的吸光值，確定總RNA的純度及濃度，利用1.2%的瓊脂糖電泳檢測(cè)總RNA的完整性。檢測(cè)獲得的高質(zhì)量總RNA，在Quant Reverse Transcriptase的作用下，以O(shè)ligo(dT)15為引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，合成cDNA第一鏈(QuantScript RT Kit試劑盒，天根)，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2LpGCS中間片段的克隆根據(jù)GenBank上已注冊(cè)的印度芥菜(Brassicajuncea)(AJ005587.1)、小麥(Triticumaestivum)(AY864064.1)、日本水稻(O.sativaJaponica Group)(AJ508916.2)、玉米(Zeamays)(AJ302783.1)、蘆葦(Phragmitesaustralis)(FJ463872.1)GCS基因的CDS序列設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物L(fēng)pGCS-Z51[5′-T(T/C)GAAACATTACATCAAACTTGTGC-3′]和LpGCS-Z31[5′-ACCAACCTCCTTGTA(T/C)CCTCTTC-3′]進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增參數(shù)為94℃ 3 min，94℃ 30 s，52℃ 30 s，72℃ 2 min；30次循環(huán)。回收目的片段分別連接到pEASY-T3克隆載體，并轉(zhuǎn)化至Trans1-T1 Phage Resistant Chemically Competent Cell，取陽性克隆進(jìn)行菌液PCR、酶切鑒定并測(cè)序。

1.2.3LpGCS5′端和3′端的克隆根據(jù)測(cè)序得到的序列信息設(shè)計(jì)RACE引物L(fēng)pGCS-S51(5′-CCCTTGGGCATTATTGGTATCTCACTC-3′)和LpGCS-X31(5′-GTCGGGTTGCTGTATGATGAGGAGT-3′)，使用SMARTerTMRACE cDNA Amplification Kit所提供的UPM引物(5′-CTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3′)經(jīng)PCR獲得兩端片段序列。PCR擴(kuò)增參數(shù)為94℃ 3 min，94℃ 30 s，68℃ 30 s，72℃ 2 min，25個(gè)循環(huán)。

1.2.4LpGCS全長(zhǎng)的克隆將獲得的基因序列進(jìn)行拼接，在NCBI網(wǎng)站進(jìn)行比對(duì)，確認(rèn)為目的基因序列后，利用NCBI網(wǎng)站上的ORF Finder軟件獲取ORF序列，在ORF ATG前設(shè)計(jì)5′端特異引物L(fēng)pGCS-51(5′-AAGGAGAACTGGAGAATCGGCACA-3′)，ORF 3′端TAG之后設(shè)計(jì)3′序列保守區(qū)引物L(fēng)pGCS-31(5′-GCCGCAAGACCAGAAGGAAGT-3′)。PCR擴(kuò)增參數(shù)為94℃ 3 min，94℃ 30 s，56℃ 30 s，72℃ 2 min，30個(gè)循環(huán)。PCR產(chǎn)物經(jīng)回收、連接、轉(zhuǎn)化、菌斑PCR、酶切檢測(cè)鑒定和測(cè)序。

1.2.5序列分析利用NCBI網(wǎng)站Protein Conservation Domain程序?qū)pGCS編碼的蛋白質(zhì)序列進(jìn)行蛋白質(zhì)保護(hù)域和保守性分析；利用在線軟件ExPASyProtParam tool(http://www.expasy.org)預(yù)測(cè)基因所編碼蛋白質(zhì)的氨基酸組成、分子量、理論等電點(diǎn)，利用SOPMA(http://npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat. pl?page=npsa_sopma.html)預(yù)測(cè)其蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)。

1.2.6植物表達(dá)載體的構(gòu)建首先對(duì)基因全長(zhǎng)和載體進(jìn)行酶切位點(diǎn)分析，選擇目的基因內(nèi)部沒有相應(yīng)酶切位點(diǎn)的酶BamH I和Kpn I，在目的基因上游PCR引物5′端加上BamH I酶切位點(diǎn)，設(shè)計(jì)構(gòu)建正義載體所用上游引物ZB(5′-GGATCCATGGAAGAAGGCCATG-3′)；在下游PCR引物5′端加上Kpn I酶切點(diǎn)，設(shè)計(jì)構(gòu)建正義載體所用下游引物ZK(5′-GGTACCTCAGTATAACAATTCCTCGA-3′)；在上游PCR引物5′端加上Kpn I酶切位點(diǎn)，設(shè)計(jì)構(gòu)建反義載體所用上游引物FK(5′-GGTACCATGGAAGAAGGCCATGT-3′)；下游PCR引物5′端加上BamH I酶切位點(diǎn)，設(shè)計(jì)構(gòu)建反義載體所用下游引物FB(5′-GGATCCTCAGTATAACAATTCCTCGA-3′)。用攜帶LpGCS基因的T載體質(zhì)粒作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增參數(shù)為94℃ 3 min，94℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 2 min，30個(gè)循環(huán)。對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行膠回收，重新連接到pEASY-T3載體上，經(jīng)轉(zhuǎn)化、過夜培養(yǎng)、質(zhì)粒DNA酶切、測(cè)序，確定獲得含酶切位點(diǎn)的目的基因正、反義片段，分別將其連接入pCAMBIA1301-Ubi植物表達(dá)載體上，經(jīng)雙酶切鑒定目的基因的正反義植物表達(dá)載體是否構(gòu)建成功。

1.2.7葉盤法轉(zhuǎn)化煙草及抗性植株的篩選制備根癌農(nóng)桿菌EHA105感受態(tài)細(xì)胞，利用獲得的無菌、生長(zhǎng)良好的‘珊西’煙草幼苗(無菌培養(yǎng)30 d)葉盤進(jìn)行轉(zhuǎn)化。將剪好的煙草葉盤在含目的基因的農(nóng)桿菌液中侵染15 min，用無菌濾紙吸干液體后，將侵染后的葉盤置于鋪有一層無菌濾紙的MS培養(yǎng)基(MS+2.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L IAA， pH 5.8)上黑暗條件下28℃共培養(yǎng)2 d后，將葉盤轉(zhuǎn)入含有抗生素的再生培養(yǎng)基(MS+2.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L IAA+500 μg/mL Carb+50 μg/mL Kan，pH 5.8)進(jìn)行分化培養(yǎng)，以未轉(zhuǎn)化的煙草葉盤作對(duì)照；待再生芽長(zhǎng)至2 cm高時(shí)，切下移入生根培養(yǎng)基(MS+200 μg/mL Carb+75 μg/mL Kan，pH 5.8)誘導(dǎo)生根；3周后獲得再生植株；繼續(xù)培養(yǎng)30 d后，去封口膜，室內(nèi)煉苗3～5 d后，移栽至營(yíng)養(yǎng)土∶草炭∶蛭石(3∶1∶1)花盆中培養(yǎng)，然后置于溫室常規(guī)管理。

1.2.8轉(zhuǎn)基因植株的分子檢測(cè)采用Trizol法提取抗性煙草植株和野生型煙草的總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA第一鏈后，利用引物ZB(5′-GGATCCATGGAAGAAGGCCATG-3′)、ZK(5′-GGTACCTCAGTATAACAATTCCTCGA-3′)和FK(5′-GGTACCATGGAAGAAGGCCATGT-3′)、FB(5′-GGATCCTCAGTATAACAATTCCTCGA-3′)進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增鑒定轉(zhuǎn)基因煙草植株。以煙草NtActin為內(nèi)參，NtActinF引物(5′→3′)：TAGTAAGCAACTGGGACG，NtActinR引物(5′→3′)：CTCTGAGCCAATGGTAAT。

1.2.9T0代煙草表型觀測(cè)對(duì)野生型煙草和轉(zhuǎn)基因煙草的生長(zhǎng)狀況進(jìn)行觀察。2個(gè)月后，分別隨機(jī)選取8株野生型煙草(CK)和 T0代陽性正、反義轉(zhuǎn)基因株系進(jìn)行株高測(cè)量。

1.2.10轉(zhuǎn)正、反義LpGCS煙草耐鎘脅迫試驗(yàn)設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)在中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院科研溫室內(nèi)進(jìn)行。正、反義轉(zhuǎn)基因煙草和野生型煙草植株由無菌苗移栽于溫室草炭土基質(zhì)中，常規(guī)養(yǎng)護(hù)管理。生長(zhǎng)2個(gè)月后，隨機(jī)選取野生型煙草(CK)和T0代陽性正反義轉(zhuǎn)基因株系(L+、L-)進(jìn)行重金屬Cd2+處理，Cd2+由CdCl2·2.5H2O(分析純)提供。處理液CdCl2溶液濃度為5 mg/L，每3 d澆灌1次。每處理3次重復(fù)。分別在處理0和8 d后測(cè)定野生型煙草(CK)和T0代陽性正反義轉(zhuǎn)基因株系(L+、L-)的光合色素含量、丙二醛含量、抗壞血酸過氧化物酶(APX)活性、過氧化物酶(POD)活性和過氧化氫酶(CAT)活性，參照劉俊祥[16]的方法測(cè)定。選取煙草同一部位上生長(zhǎng)葉齡相似的葉子，取樣時(shí)間為早晨 8:00-9:00，每個(gè)株系3個(gè)重復(fù)。

1.3統(tǒng)計(jì)分析

利用Excel 2007進(jìn)行數(shù)據(jù)整理、標(biāo)準(zhǔn)差的計(jì)算和作圖，利用SPSS 13.0進(jìn)行Duncan多重對(duì)比。

2結(jié)果與分析

圖1　LpGCS克隆電泳圖　　Fig.1　Agarose gel electrophoresis for the clone of LpGCS　　　A：中間片段PCR產(chǎn)物；B：5′端酶切產(chǎn)物；C：3′端酶切產(chǎn)物；D：基因全長(zhǎng)酶切產(chǎn)物； M：Marker(D2000)；1：PCR產(chǎn)物；2，3，4：酶切產(chǎn)物。A:The product of middle sequence; B:The digested product of 5′ sequence; C: The digested product of 3′ sequence; D: The digested product of full-length sequence; M: DNA Marker (D2000);1:Product of PCR; 2,3,4:The digested product.

2.1LpGCS中間片段的克隆

從多年生黑麥草葉片中提取，獲得高質(zhì)量總RNA，利用設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行中間片段擴(kuò)增，瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果如圖1A所示，獲得約900 bp大小的核苷酸序列，與預(yù)計(jì)目的條帶大小相符；經(jīng)膠回收、載體連接、轉(zhuǎn)化，挑取陽性克隆、搖菌過夜，經(jīng)菌落PCR，選取攜帶目的條帶的陽性克隆菌液進(jìn)行測(cè)序，獲得長(zhǎng)911 bp的核苷酸序列。將測(cè)序獲得的cDNA核苷酸序列，用Blast軟件將其與GenBank中的所有序列進(jìn)行同源性比對(duì)，發(fā)現(xiàn)其與小麥、高粱γ-谷氨?；腚装彼岷铣擅傅囊恢滦约s在91%，與日本水稻、玉米的一致性為90%，并初步確定其為GCS2超級(jí)家族基因序列的一部分。這表明已經(jīng)從多年生黑麥草葉片中分離出γ-谷氨?；腚装彼岷铣擅富虻闹虚g片段。

2.2LpGCS5′端和3′端的克隆

根據(jù)已獲得的中間片段核苷酸序列，設(shè)計(jì)特異性引物L(fēng)pGCS-S51進(jìn)行5′RACE PCR擴(kuò)增，如圖1B，獲得403 bp的DNA片段。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)膠回收、載體連接、轉(zhuǎn)化，挑取陽性克隆、搖菌過夜后，提取質(zhì)粒DNA并酶切，將具有單一目的條帶的陽性克隆菌液送交公司測(cè)序。在NCBI網(wǎng)站上用Blast軟件將測(cè)序結(jié)果與GenBank中的所有序列進(jìn)行同源性比對(duì)(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastx&PAGE_TYPE=BlastSearch&LINK_LOC=blasthome)，發(fā)現(xiàn)其與二穗短柄草(Brachypodiumdistachyon)的一致性達(dá)到91%，與印度水稻、日本水稻、玉米、短花藥野生稻γ-谷氨?；腚装彼岷铣擅傅囊恢滦远歼_(dá)到了88%，并初步確定其為GCS2超級(jí)家族基因序列的一部分。以上結(jié)果表明已從多年生黑麥草中獲得了目的基因的5′端片段。

根據(jù)已獲得的中間片段核苷酸序列，設(shè)計(jì)特異性引物L(fēng)pGCS-S31進(jìn)行3′RACE PCR擴(kuò)增，如圖1C，獲得約750 bp的DNA片段。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)膠回收、載體連接、轉(zhuǎn)化，挑取陽性克隆、搖菌過夜，提取質(zhì)粒DNA并酶切，選取攜帶單一目的條帶的陽性克隆菌液進(jìn)行測(cè)序。在NCBI網(wǎng)站上用Blast軟件將測(cè)序結(jié)果與GenBank中的所有序列進(jìn)行同源性比對(duì)，發(fā)現(xiàn)其與小麥、日本水稻、玉米、烏拉圖小麥、蘆葦γ-谷氨?；腚装彼岷铣擅傅囊恢滦远荚?0%以上，并初步確定其為GCS2超級(jí)家族基因序列的一部分。

2.3LpGCS的全長(zhǎng)克隆

利用DNAMAN軟件將克隆得到的LpGCS中間片段、3′端和5′端核苷酸序列進(jìn)行拼接，獲得了全長(zhǎng)為1674 bp的核苷酸序列。為檢驗(yàn)拼接是否準(zhǔn)確，設(shè)計(jì)了基因的特異引物L(fēng)pGCS-31和LpGCS-51，如圖1D，PCR擴(kuò)增出約1400 bp的條帶，將PCR產(chǎn)物回收、連接、測(cè)序，獲得長(zhǎng)為1398 bp的核苷酸序列， 經(jīng)測(cè)序發(fā)現(xiàn)與拼接結(jié)果一致。 對(duì)LpGCS全長(zhǎng)進(jìn)行分析， 如圖2所示，發(fā)現(xiàn)LpGCS全長(zhǎng)包含一個(gè)長(zhǎng)度為1125 bp的開放閱讀框(openg reading frame)，在145～1269 bp之間，推測(cè)編碼374個(gè)氨基酸；5′非翻譯區(qū)長(zhǎng)144 bp，3′非翻譯區(qū)長(zhǎng)405 bp。多年生黑麥草LpGCS基因在GenBank上獲得的核苷酸序列的登錄號(hào)為：KJ551844。

圖2　LpGCS全長(zhǎng)核苷酸與氨基酸序列Fig.2　The full-length sequence of cDNA nucleotide and amino acid for LpGCS

圖3　LpGCS蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)模型預(yù)測(cè)Fig.3　Secondary structure prediction models of LpGCS protein

將獲得的LpGCS的核苷酸序列在NCBI上經(jīng)BLAST分析發(fā)現(xiàn)，得分靠前的有小麥γ-谷氨酸半胱氨酸合成酶(GSH1)mRNA全長(zhǎng)序列、二穗短柄草γ-谷氨?；腚装彼徇B接酶B mRNA序列、日本水稻γ-谷氨酸半胱氨酸合成酶基因mRNA序列、蘆葦γ-谷氨酸半胱氨酸合成酶(GCS)mRNA全長(zhǎng)序列，LpGCS的核苷酸序列與它們的一致性都達(dá)到了88%以上，說明該基因?qū)儆诠劝彼岚腚装彼徇B接酶家族2(glutamate-cysteine ligase family 2，GCS2)，也被稱為γ-ECS，其催化谷胱甘肽從頭生物合成的第一步反應(yīng)，是谷胱甘肽合成的限速酶。

圖4　LpGCS所編碼氨基酸序列與其他8個(gè)物種同源氨基酸序列間的比對(duì)Fig.4　Homologous comparison of the deduced amino acid sequences of LpGCS with other 8 species

At：擬南芥Arabidopsisthaliana；Bd：二穗短柄草Brachypodiumdistachyon；Bj：印度芥菜Brassicajuncea;；Lj：百脈根Lotusjaponica；Lp：多年生黑麥草Loliumperenne；Nt：煙草Nicotianatabacum；Os：日本水稻OryzasativaJaponica Group；Ta：小麥Triticumaestivum；Zm：玉米Zeamays.

2.4LpGCS編碼蛋白質(zhì)性質(zhì)與結(jié)構(gòu)分析

LpGCS所編碼蛋白質(zhì)含有374個(gè)氨基酸，其親水性氨基酸占氨基酸總量的30.2%，疏水氨基酸占43.4%，堿性氨基酸占總氨基酸的12.8%，酸性氨基酸占總氨基酸含量的13.6%，其分子式為C1933H2986N510O555S19，推測(cè)其分子質(zhì)量為42859.2 Da， 理論等電點(diǎn)pI=5.39； 不穩(wěn)定系數(shù)為47.63，屬于不穩(wěn)定類蛋白質(zhì)。如圖3所示，LpGCS所編碼蛋白由46.26%的α-螺旋(alpha helix)、35.29%的無規(guī)則卷曲(random coil)、12.83%的延伸主鏈(extended strand)和5.61%的β-轉(zhuǎn)角組成，由此看出，α-螺旋是LpGCS蛋白的主要組成部分，其他二級(jí)結(jié)構(gòu)則散布LpGCS蛋白α-螺旋結(jié)構(gòu)之間。

圖5　基于GCS基因所編碼氨基酸序列9個(gè)物種的系統(tǒng)發(fā)生樹Fig.5　Phylogenetic tree based on amino acid sequences coding by GCS gene of 9 species

圖6　pEASY-T3-LpGCS正義、反義載體和pCAMBIA1301-Ubi載體的Kpn I、BamH I雙酶切電泳Fig.6　The sense/anti-sence of pEASY-T3-LpGCS and pCAMBIA1301-Ubi were digested with Kpn I and BamH I　　　M1：Marker DM10000；M2：Marker D2000；1：pCAMBIA1301-Ubi質(zhì)粒對(duì)照；2：pCAMBIA1301-Ubi質(zhì)粒雙酶切產(chǎn)物；3：pEASY-T3-LpGCS+質(zhì)粒對(duì)照；4：pEASY-T3-LpGCS+質(zhì)粒雙酶切產(chǎn)物；5：pEASY-T3-LpGCS-質(zhì)粒對(duì)照；6：pEASY-T3-LpGCS-質(zhì)粒雙酶切產(chǎn)物。1: CK of pCAMBIA1301-Ubi plasmid; 2: Product after pCAMBIA1301-Ubi plasmid was digested with Kpn I and BamH I; 3: CK of pEASY-T3-LpGCS+ plasmid; 4: Product after pEASY-T3-LpGCS+ plasmid was digested with Kpn I and BamH I; 5: CK of pEASY-T3-LpGCS- plasmid; 6:Product after pEASY-T3-LpGCS- plasmid was digested with Kpn I and BamH I.

2.5LpGCS蛋白同源性分析

將LpGCS的核苷酸序列翻譯成氨基酸序列，提交NCBI并進(jìn)行在線比對(duì)(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)，發(fā)現(xiàn)其與小麥γ-谷氨酸半胱氨酸合成酶、二穗短柄草γ-谷氨酰基半胱氨酸連接酶B、蘆葦γ-谷氨酸半胱氨酸合成酶序列一致性最高，達(dá)95%。如圖4所示，選擇與其氨基酸序列一致性較高和具有代表性的8個(gè)物種的氨基酸進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)該基因N端具有很強(qiáng)的保守性。

利用MEGA 4.0 版本 Kimura 雙參數(shù)模型，NJ法構(gòu)建進(jìn)化樹，結(jié)果如圖5所示，發(fā)現(xiàn)多年生黑麥草LpGCS基因所編碼蛋白質(zhì)氨基酸序列與同為禾本科小麥同源性最高，與擬南芥和印度芥菜的同源性最低。

圖7　pCAMBIA-Ubi-LpGCS正義和反義載體Kpn I和BamH I雙酶切檢測(cè)電泳Fig.7　The sense/anti-sence of pCAMBIA-Ubi-LpGCS were digested with Kpn I and BamH I　　　M：Marker DM10000；1：pCAMBIA-Ubi-LpGCS質(zhì)粒對(duì)照；2：pCAMBIA-Ubi-LpGCS+質(zhì)粒雙酶切產(chǎn)物；3：pCAMBIA-Ubi-LpGCS-質(zhì)粒雙酶切產(chǎn)物。1:CK of pCAMBIA-Ubi-LpGCS plasmid;2: Product after pCAMBIA-Ubi-LpGCS+plasmid was digested with Kpn I and BamH I;3: Product after pCAMBIA-Ubi-LpGCS- plasmid was digested with Kpn I and BamH I.

圖8　7個(gè)轉(zhuǎn)LpGCS+基因株系和4個(gè)轉(zhuǎn)LpGCS-基因株系的RT-PCR檢測(cè)結(jié)果 Fig.8　RT-PCR analysis of 11 transformed lines

圖9　轉(zhuǎn)LpGCS+/-煙草和野生型(CK)生長(zhǎng)2個(gè)月后株高對(duì)比Fig.9　The comparison of height for wild type tobacco and transgenic tobacco with LpGCS +/-　　　不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)；不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，下同。The different capital letters mean very significant differences at P<0.01; The different small letters mean significant differences at P<0.05， the same below.

2.6LpGCS基因正、反義植物表達(dá)載體的構(gòu)建

為構(gòu)建LpGCS基因正、反義植物表達(dá)載體，首先分別構(gòu)建pEASY-T3-LpGCS正義和反義載體。經(jīng)PCR擴(kuò)增獲得LpGCS的正義基因片段(5′與3′端加有酶切位點(diǎn)Kpn I、BamH I)和反義基因片段(5′與3′端加有酶切位點(diǎn)BamH I、Kpn I)，分別與克隆載體先后經(jīng)過Kpn I、BamH I酶切的IpEASY-T3大片段連接，經(jīng)轉(zhuǎn)化、涂板、挑單克隆、搖菌后，提取質(zhì)粒，分別再利用Kpn I、BamH I對(duì)含目的基因的重組載體pEASY-T3-LpGCS+和pEASY-T3-LpGCS-進(jìn)行質(zhì)粒雙酶切，電泳結(jié)果如圖6所示，從克隆載體pEASY-T3上分別切下帶酶切位點(diǎn)的長(zhǎng)約1.1 kb的正反義基因片段。

同時(shí)，利用Kpn I對(duì)pCAMBIA1301-Ubi載體進(jìn)行單酶切，1.2%瓊脂糖凝膠電泳后，對(duì)酶切產(chǎn)物進(jìn)行回收，用BamH I對(duì)回收產(chǎn)物再次進(jìn)行酶切，如圖6，獲得pCAMBIA1301-Ubi載體大片段；將上一步膠回收獲得的帶酶切位點(diǎn)的正、反義基因片段分別與膠回收獲得的pCAMBIA1301-Ubi載體大片段連接，經(jīng)轉(zhuǎn)化、涂板、挑單克隆、搖菌后，提取質(zhì)粒，分別再用Kpn I、BamH I對(duì)含目的基因的重組載體pCAMBIA1301-Ubi-LpGCS+和pCAMBIA1301-Ubi-LpGCS-進(jìn)行質(zhì)粒雙酶切，電泳結(jié)果如圖7所示，檢測(cè)發(fā)現(xiàn)1.1 kb左右的條帶，將陽性克隆送交華大公司測(cè)序，DNA 測(cè)序結(jié)果與目的基因序列一致，這表明LpGCS的正反義植物表達(dá)載體構(gòu)建成功。

2.7轉(zhuǎn)基因植株的分子檢測(cè)

農(nóng)桿菌侵染后的煙草葉盤，在抗性培養(yǎng)基上經(jīng)過分化再生形成抗性植株。據(jù)統(tǒng)計(jì)，抗性篩選共獲得7株轉(zhuǎn)正義基因植株和4株轉(zhuǎn)反義基因植株。采用Trizol法提取所有抗性煙草植株和野生型煙草的總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA第一鏈后，利用引物ZB、ZK和FK、FB進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，以煙草NtActin為內(nèi)參，鑒定抗性轉(zhuǎn)基因植株。如圖8所示，轉(zhuǎn)基因煙草擴(kuò)增出1 條約為1100 bp的LpGCS片段，而野生型對(duì)照無此條帶，由此篩選出5個(gè)轉(zhuǎn)正義基因陽性株系和3個(gè)轉(zhuǎn)反義基因陽性株系，表明LpGCS在轉(zhuǎn)錄水平正常表達(dá)。

2.8T0代煙草表型觀測(cè)

RT-PCR檢測(cè)為陽性的正反義轉(zhuǎn)基因煙草經(jīng)過擴(kuò)繁后，進(jìn)行常規(guī)養(yǎng)護(hù)管理，均能夠正常生長(zhǎng)。2個(gè)月后， 隨機(jī)分別選取8株野生型煙草(CK)和 T0代陽性正、反義轉(zhuǎn)基因株系進(jìn)行株高測(cè)量，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)LpGCS+基因煙草的平均高為(32.1±2.5) cm，顯著高于轉(zhuǎn)LpGCS-煙草和對(duì)照(圖9)，且轉(zhuǎn)LpGCS+煙草提前進(jìn)入花期，而轉(zhuǎn)LpGCS-煙草和對(duì)照均未開花(圖10)，這可能是因?yàn)長(zhǎng)pGCS+的過量表達(dá)促進(jìn)了轉(zhuǎn)基因煙草的生長(zhǎng)和發(fā)育。

圖10　生長(zhǎng)2個(gè)月的轉(zhuǎn)LpGCS+/-煙草和野生型(CK)植株Fig.10　Two months of wild type and transgenic tobacco with LpGCS+ and LpGCS-　　　A：2個(gè)月后3種類型的煙草的生長(zhǎng)狀況The growing condition of 2 months for three types of tobacco；B：轉(zhuǎn)LpGCS+煙草已形成的花序The forming inflorescence of transgenic tobacco with LpGCS+.

2.9轉(zhuǎn)正、反義LpGCS煙草耐鎘脅迫能力鑒定

分別在處理0和8 d后測(cè)定野生型煙草(CK)和T0代陽性正反義轉(zhuǎn)基因株系(L+、L-)的光合色素含量、丙二醛含量、抗壞血酸過氧化物酶活性、過氧化物酶(POD)活性和過氧化氫酶(CAT)活性。結(jié)果表明，脅迫前轉(zhuǎn)LpGCS-煙草植株中光合色素的含量顯著低于野生型(圖11A)，且于脅迫處理后，與野生型植株光合色素的含量均低于轉(zhuǎn)LpGCS+煙草；脅迫處理后的轉(zhuǎn)LpGCS+煙草MDA含量顯著低于野生型與轉(zhuǎn)LpGCS-煙草(圖11B)，表明其膜系統(tǒng)所受傷害小；脅迫處理后的LpGCS+煙草的抗氧化物質(zhì)活性APX、POD和CAT均顯著高于野生型與轉(zhuǎn)LpGCS-煙草(圖11C、D、E)，表明轉(zhuǎn)LpGCS+煙草的抗氧化能力增強(qiáng)。綜上所述，LpGCS基因在煙草中的過量表達(dá)可以提高植株的耐鎘脅迫能力，為進(jìn)一步利用該基因轉(zhuǎn)化多年生黑麥草培育抗重金屬植株奠定基礎(chǔ)。

圖11　鎘脅迫下轉(zhuǎn)正、反義LpGCS煙草與野生型植株

3結(jié)論與討論

本研究獲得全長(zhǎng)為1674 bp的基因LpGCS(GenBank登錄號(hào)：KJ551844)，并對(duì)其所編碼蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能進(jìn)行了分析和預(yù)測(cè)。所獲得的LpGCS序列以及該序列所編碼蛋白質(zhì)的性質(zhì)、二級(jí)結(jié)構(gòu)分析都表明，該基因?qū)儆诠劝彼岚腚装彼徇B接酶家族2，其催化谷胱甘肽從頭生物合成的第一步反應(yīng)，是谷胱甘肽合成的限速酶。LpGCS所編碼蛋白與小麥、煙草、水稻、印度芥菜中同源蛋白的同源性都達(dá)到了81%以上。通過該基因在煙草中過量表達(dá)以及鎘脅迫生理試驗(yàn)驗(yàn)證了該基因抗重金屬脅迫的功能，從而為通過基因工程方法提高多年生黑麥草對(duì)重金屬脅迫等非生物脅迫的抗性奠定了良好的基礎(chǔ)。

谷胱甘肽在植物應(yīng)對(duì)外界的非生物脅迫中有著非常重要的作用。重金屬超富集植物Thlaspigoesigense在自然條件下產(chǎn)生過量谷胱甘肽，被認(rèn)為是其能夠耐受由Cd2+和Ni2+所引起的氧化脅迫的一個(gè)重要特征。鎘超富集植物東南景天(Sedumalfredii)在被污染立地條件下的適應(yīng)性也是由于谷胱甘肽的過量生產(chǎn)，而不是植物螯合肽[17]。此外，谷胱甘肽生物合成的增加在遏蘭菜(Thlaspicaerulescens)對(duì)重金屬鎘的積累[18]和菥屬(Thlaspi)超富集植物對(duì)鎳的積累有著非常重要的作用[19]，而在轉(zhuǎn)基因楊樹中過量表達(dá)來源于細(xì)菌的γ-谷氨酸半胱氨酸合成酶基因，則提高了其谷胱甘肽的含量和對(duì)重金屬鋅的吸收能力[20]。谷胱甘肽二鎘復(fù)合物是釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)和一些并不產(chǎn)生植物螯合肽的外生菌根真菌有效的Cd2+轉(zhuǎn)運(yùn)載體，其細(xì)胞內(nèi)的Cd2+的解毒依賴于此將金屬排至液泡中[21]。在煙草[10]、水稻[13]、印度芥菜[22]中過量表達(dá)編碼γ-ECS或GS蛋白基因，能夠提高它們對(duì)非生物脅迫的抗性，且在印度芥菜中的過量表達(dá)還增加了其對(duì)谷胱甘肽、植物螯合肽、重金屬鎘的積累[23]。

然而，也有研究結(jié)果表明，提高谷胱甘肽的含量并不總會(huì)增加其對(duì)重金屬的抗性[24]，這可能是因?yàn)楣入赘孰莫?dú)自并不能支撐起由重金屬脅迫引起的復(fù)雜抗性機(jī)制[5]。植物螯合肽的過量產(chǎn)生會(huì)使得擬南芥中的谷胱甘肽耗盡，這于轉(zhuǎn)基因植株對(duì)Cd2+的抗性和積累能力具有負(fù)面影響[25]。在擬南芥中過量表達(dá)編碼酵母谷胱甘肽還原酶基因GSH1和大蒜(Alliumsativum)AsPCS1，單基因和雙基因轉(zhuǎn)基因植株對(duì)亞砷酸鹽和砷酸鹽的抗性及積累能力都得到了提高[26]；與轉(zhuǎn)AsPCS1單基因擬南芥相比，轉(zhuǎn)AsPCS1/GS雙基因的擬南芥對(duì)重金屬具有更高的抗性和積累量。這表明，植物螯合肽的合成能力和保持細(xì)胞溶質(zhì)狀態(tài)穩(wěn)定與氧化還原動(dòng)態(tài)平衡的能力賦予了植物對(duì)金屬的抗性和積累特性。

有研究表明，谷胱甘肽還參與調(diào)控植物細(xì)胞中的H2O2水平[27]，減輕了逆境對(duì)植物所造成的傷害。這與本研究的結(jié)果相似，脅迫處理后的轉(zhuǎn)LpGCS+煙草不僅光合色素含量增加，而且抗氧化物質(zhì)活性(SOD、POD和CAT)均顯著高于野生型與轉(zhuǎn)LpGCS-煙草，這表明LpGCS基因在煙草中的過量表達(dá)提高了煙草的抗氧化能力和光合色素的合成水平，從而增強(qiáng)植株的耐鎘脅迫能力。

此外，本研究發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)LpGCS+煙草的株高明顯高于轉(zhuǎn)LpGCS-煙草和對(duì)照，這表明LpGCS+的過量表達(dá)促進(jìn)了轉(zhuǎn)基因煙草的生長(zhǎng)。有研究表明，谷胱甘肽是谷氧還蛋白發(fā)揮作用的重要輔助因子，而谷氧還蛋白能夠調(diào)控花的發(fā)育[28]，而本研究也發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)LpGCS+煙草植株有早開花表型。也有研究報(bào)道雖然外施谷胱甘肽對(duì)煙草的生長(zhǎng)影響很小[29]，但是γ-ECS基因的過量表達(dá)提高了轉(zhuǎn)γ-ECS基因水稻的產(chǎn)量[30]。由此可以推測(cè)γ-ECS基因的過量表達(dá)不僅影響植物的抗重金屬能力，而且能夠影響植物的生長(zhǎng)發(fā)育。本研究為利用基因工程手段培育抗重金屬脅迫的多年生黑麥草新品種提供了重要的理論基礎(chǔ)。

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Molecular cloning and characterization in tobacco ofLpGCSfrom perennial ryegrass

WEI Shu-Qiang, SUN Zhen-Yuan*, DAI Xiao-Mei, QIAN Yong-Qiang

ResearchInstituteofForestry,ChineseAcademyofForestry,KeyLaboratoryofTreeBreedingandCultivation,StateForestryAdministration,Beijing100091,China

Abstract:Degenerate primers were designed using CDS sequences of homologous genes and the γ-glutamylcysteine synthetase gene LpGCS was cloned from perennial ryegrass (Loliumperenne) using RT-PCR and RACE techniques, with leaves of ‘Top hat Ⅱ’ as the test material. The full-length sequence of LpGCS gene was 1674 bp (GenBank accession number: KJ551844) with a complete open reading frame (ORF) of 1125 bp. Amino acid sequence identity, structure and homologous sequences with amino acids of 8 other homologous genes were studied and predicted. The protein molecular weight was 42.86 kDa (unstable protein) and its main secondary structure being an alpha helix. The protein amino acid sequence had relatively high homology with 8 other homologous amino acid sequences and had higher homology with graminaceous plants, such as wheat (Triticum aestivum), stiff brome (Brachypodium distachyon) and Japanese rice (Oryza sativa Japonica Group). In addition, sense and antisense plant expression vector pCAMBIA-Ubi-LpGCS+ and pCAMBIA-Ubi-LpGCS- were successfully constructed and transgenic tobacco obtained by agrobacterium mediated transformation. The transgenic tobacco with LpGCS+ grew faster and flowered earlier than the transgenic tobacco with LpGCS-. Exposed to Cd(2+) stress (10 days), physiological and biochemical tests of transgenic and wild-type tobacco showed that the MDA content of LpGCS+ transgenetic plants was lower than the wild type, and POD, SOD and CAT activity higher than those of the wild type. In contrast, the MDA content of LpGCS- transgenetic plants was higher than the wild type and POD, SOD and CAT activity lower. In summary, overexpression of the LpGCS gene in tobacco plants could improve resistance to Cd(2+) stress and lay the foundation for the genetic transformation of perennial ryegrass cultivars able to tolerate heavy metals.

Key words:perenial ryegrass; γ-glutamylcysteine synthetase; gene clone; characterization

*通信作者

Corresponding author. E-mail：sunzy@caf.ac.cn

作者簡(jiǎn)介：魏樹強(qiáng)(1983-)，男，山東臨沂人，在讀博士。E-mail：weishuqiang2008@163.com

基金項(xiàng)目：國(guó)家863項(xiàng)目(2011AA10020902)資助。

*收稿日期：2015-06-05；改回日期：2015-07-06

DOI：10.11686/cyxb2015288

http://cyxb.lzu.edu.cn

魏樹強(qiáng)，孫振元，代小梅，錢永強(qiáng). 多年生黑麥草LpGCS基因克隆及其在煙草中的初步功能驗(yàn)證.草業(yè)學(xué)報(bào), 2016, 25(4): 121-132.

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