張軍峰，史利利，張 力，楊蓬勃，張建水，劉 勇，祁存芳，徐 曦

（1.西安醫(yī)學(xué)院人體解剖學(xué)教研室，陜西西安 710021；2.西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部神經(jīng)生物學(xué)研究所，陜西西安 710061；3.青海大學(xué)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)部解剖學(xué)教研室，青海西寧 810001）

缺氧調(diào)控表達(dá)的NT－3逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的構(gòu)建及鑒定

張軍峰1，史利利1，張 力1，楊蓬勃2，張建水2，劉 勇2，祁存芳3，徐 曦1

（1.西安醫(yī)學(xué)院人體解剖學(xué)教研室，陜西西安 710021；2.西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部神經(jīng)生物學(xué)研究所，陜西西安 710061；3.青海大學(xué)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)部解剖學(xué)教研室，青海西寧 810001）

目的 構(gòu)建與鑒定含有5個拷貝缺氧反應(yīng)元件（five copies of hypoxia responsive elements，5HRE）的缺氧調(diào)控表達(dá)的神經(jīng)營養(yǎng)因子－3（neurotrophin－3，NT－3）的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。方法 用PCR、酶切和連接等分子克隆技術(shù)將5HRE和人來源NT－3片段克隆入逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pLNCX中，構(gòu)建重組逆轉(zhuǎn)錄病毒穿梭質(zhì)粒pLNCX－5HRE－SV40－NT3－IRES－EGFP。經(jīng)PT67包裝細(xì)胞包裝、高速離心純化和濃縮等方法，獲得逆轉(zhuǎn)錄病毒RV－5HRE－NT3；用逆轉(zhuǎn)錄病毒感染NIH 3T3細(xì)胞48h后，流式細(xì)胞儀檢測并計(jì)算出病毒滴度。結(jié)果 成功構(gòu)建了重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體質(zhì)粒pLNCX－5HRE－SV40－NT3－IRES－EGFP，并獲得相應(yīng)的逆轉(zhuǎn)錄病毒RV－5HRE－NT3，經(jīng)過高速離心純化和濃縮后，其滴度可達(dá)9.1×106cfu/mL。結(jié)論 成功構(gòu)建了缺氧調(diào)控表達(dá)的NT－3逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，為研究外源基因的缺氧調(diào)控特異性表達(dá)奠定了工作基礎(chǔ)。

逆轉(zhuǎn)錄病毒載體；缺氧調(diào)控表達(dá)；神經(jīng)營養(yǎng)因子－3

神經(jīng)營養(yǎng)因子－3（neurotrophin－3，NT－3）是一種具有多功能的神經(jīng)營養(yǎng)因子，除了具有維持神經(jīng)元存活、誘導(dǎo)神經(jīng)元分化和促進(jìn)神經(jīng)損傷修復(fù)的傳統(tǒng)神經(jīng)保護(hù)作用外，其還與血管發(fā)生密切相關(guān)，是治療缺血性卒中的理想選擇之一［1］。采用基因表達(dá)載體將NT－3導(dǎo)入腦組織或腦血管中，通過其在局部的表達(dá)可以對腦組織產(chǎn)生神經(jīng)保護(hù)作用。但是外源基因在腦內(nèi)過表達(dá)可能會引起癲癇和腫瘤等不良反應(yīng)。因此，構(gòu)建靶向性和可控性的基因載體對解決基因治療的安全性非常重要。

在缺血/缺氧疾病的病理生理發(fā)生過程中，缺氧誘導(dǎo)因子－1（hypoxia inducible factor 1，HIF－1）與缺氧反應(yīng)元件（hypoxia responsive element，HRE）相互作用，進(jìn)而誘導(dǎo)一系列缺氧相關(guān)基因表達(dá)。利用缺氧條件下HIF－1與HRE特異性結(jié)合機(jī)制，有研究發(fā)現(xiàn)將5個拷貝的血管內(nèi)皮生長因子來源的HRE （5HRE）作為調(diào)控元件，在缺氧條件下其可以有效地驅(qū)動下游基因高效表達(dá)。因此，本研究將5個拷貝的人血管內(nèi)皮生長因子來源的HRE與猴空泡病毒40最小啟動子（simian virus 40 minimal promoter，SV40mp）連接組成缺氧調(diào)控序列，與NT－3序列融合后構(gòu)建成重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，進(jìn)而為缺血性卒中治療提供研究工具。

1 材料與方法

1.1 材料 pMD18－T載體、TaKaRa Ex Taq HS、膠回收試劑盒、質(zhì)粒純化試劑盒、ExSciptTMRTase Regent Kit、Premix Taq聚合酶（Version 2.0）、DNA marker、T4DNA連接酶以及各種內(nèi)切酶購自大連TaKaRa公司；pGL3－control載體購自Promega公司；pIRES2－EGFP、pLNCX載體質(zhì)粒、PT67細(xì)胞、NIH 3T3細(xì)胞購自BD Biosciences clontech公司；酵母提取物、胰蛋白胨、瓊脂、瓊脂糖購自O(shè)XOID公司；溴化乙錠（EB）、胰蛋白酶購自Sigma公司；Chelex－100購自Bio－Rad公司；DMEM/高糖培養(yǎng)基、胎牛血清、青霉素、鏈霉素購自Gibico公司；Trizol Reagent、G418、脂質(zhì)體（LipofectamineTM2000）購自Invitrogen公司。

1.2 人NT－3基因的克隆和鑒定 用Chelex－100從人外周血中抽提人基因組DNA作為模板，根據(jù)GenBank中人NT－3序列（NM＿002527）設(shè)計(jì)NT－3上、下游引物（在上、下游引物中分別插入酶切位點(diǎn)BglⅡ、EcoRⅠ），擴(kuò)增NT－3全長序列，序列如下：

Forward primer：5′－GGCAGATCTGGTGATGTCCATCTTC－3′；

Reverse primer：5′－GCGAATTCCAATTCATGTTCTTCCG－3′。

按照TaKaRa Ex Taq HS操作說明進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)后，用TaKaRa凝膠回收試劑盒，將NT－3片段回收、純化、連接于pMD18－T載體，將連接反應(yīng)體系轉(zhuǎn)化至大腸桿菌JM109感受態(tài)細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行克隆、抽提出攜帶有人NT－3基因的重組質(zhì)粒pT－NT3。利用對NT－3基因的PCR擴(kuò)增和BglⅡ/EcoRⅠ的雙酶切對重組質(zhì)粒pT－NT3進(jìn)行初步鑒定，再篩選出可能的陽性克隆進(jìn)行測序鑒定，進(jìn)而篩選出含有完全正確序列的人NT－3基因的克隆。

1.3 重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體質(zhì)粒pLNCX－5HRESV40－NT3－IRES－EGFP的構(gòu)建 NT－3片段來自構(gòu)建的pT－NT3、SV40和IRES－EGFP片段分別來自質(zhì)粒pGL3和pIRES2－EGFP；HRE參照人來源的VEGF基因上游的HRE序列，5個HRE序列之間由Linker（CTGCAG）連接，并在其上、下游分別插入限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)BamHⅠ和HpaⅠ以及保護(hù)堿基“CGC”，由南京金思瑞生物科技有限公司合成，序列如下：

5′－CGCGGATCCCCACAGTGCATACGTGGGCTCCAACAGGTCCTCTTCTGCAGCCACAGTGCATACGTGGGCTCCAACAGGTCCTCTTCTGCAGCCACAGTGCATACG TGGGCTCCAACAGGTCCTCTTCTGCAGCCACAGTGCATACGTGGGCTCCAACAGGTCCTCTTCTGCAGCCACAGTGCATACGTGGGCTCCAACAGGTCCTCTTGTTAACCGG－3′。

將以上片段通過PCR擴(kuò)增、產(chǎn)物回收、酶切、連接等方法分別克隆入pLNCX質(zhì)粒中，獲得pLNCX－5HRE－SV40－NT3－IRES－EGFP（圖1A），通過PCR、酶切和測序鑒定。

1.4 重組逆轉(zhuǎn)錄病毒的包裝、鑒定、純化和濃縮以及滴度檢測

1.4.1 重組逆轉(zhuǎn)錄病毒的包裝、鑒定 用脂質(zhì)體Lipofectamine 2000將重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入PT67細(xì)胞中（DNA：Lipofectamine 2000＝1μg∶2.5μL）；在轉(zhuǎn)染完成48h后，將培養(yǎng)基更換為含有最佳篩選濃度的G418篩選培養(yǎng)基，篩選10～14d后，挑選并分離出多個狀態(tài)良好的克隆，分別轉(zhuǎn)移至另一個培養(yǎng)板中進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，當(dāng)融合達(dá)80％時，在熒光顯微鏡下挑取EGFP全陽性的細(xì)胞克隆作為穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞克隆，命名為PT67－5HRE－NT3；用熒光顯微鏡觀察篩選的細(xì)胞克隆中外源報(bào)告基因EGFP的表達(dá)情況和反轉(zhuǎn)錄PCR的方法對PT67－5HRE－NT3進(jìn)行鑒定。

1.4.2 病毒的收集、純化、濃縮 當(dāng)PT67－5HRENT3細(xì)胞融合度達(dá)60％～80％時，將條件培養(yǎng)基收集至離心管，每隔24h收集1次，直至細(xì)胞狀態(tài)不良，棄細(xì)胞；將條件培養(yǎng)基以500×g的轉(zhuǎn)速離心10min，收集病毒上清轉(zhuǎn)移至另一新的離心管內(nèi)，棄細(xì)胞碎片；將收集的條件培養(yǎng)基以50 000×g轉(zhuǎn)速，4℃離心2h，棄上清，加入0.5％～1％（體積分?jǐn)?shù)）的TNE，完成純化和濃縮，并命名為RV－5HRE－NT3。

1.4.3 病毒滴度檢測 病毒感染前1d，將NIH 3T3細(xì)胞以2×105/mL的密度接種；用完全培養(yǎng)基將病毒上清連續(xù)倍比稀釋；將細(xì)胞上清吸棄，加入不同稀釋度的病毒上清；每孔加入ploybrene，使其終濃度為4μg/mL；感染4h后，用完全培養(yǎng)基換液一次；在37℃、50mL/L CO2條件下培養(yǎng)48h后，收集NIH 3T3細(xì)胞，用流式細(xì)胞儀檢測EGFP的陽性百分比，按以下公式計(jì)算病毒滴度：

病毒滴度（cfu/mL）＝（2×105靶細(xì)胞）×（％ EGFP＋細(xì)胞）/上層液體積（mL）。

2 結(jié)果

2.1 人NT－3基因的克隆及鑒定 將含有人NT－3基因的質(zhì)粒pT－NT3經(jīng)過BglⅡ和EcoRⅠ雙酶切后得到與NT－3片段大小相近的片段，同時用NT－3特異性引物經(jīng)過PCR后也可以擴(kuò)增出目的基因NT－3，初步鑒定證實(shí)pT－NT3質(zhì)粒構(gòu)建成功（圖1B）。然后將經(jīng)過雙酶切和PCR鑒定正確的質(zhì)粒進(jìn)一步測序鑒定，結(jié)果與GenBank序列完全一致，確定NT－3基因克隆成功。

2.2 重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體質(zhì)粒pLNCX－5HRE－SV40－NT3－IRES－EGFP的鑒定 將重組的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體質(zhì)粒pLNCX－5HRE－SV40－NT3－IRES－EGFP，經(jīng)過BamHⅠ和HindⅢ雙酶切后得到與SV40－NT3－IRES－EGFP片段大小相近的片段，經(jīng)過BamHⅠ和HpaⅠ雙酶切后得到與5HRE片段大小相近的片段，同時用針對NT－3的特異性引物經(jīng)過PCR后也可以擴(kuò)增出目的基因NT－3（823bp），初步鑒定證實(shí)pLNCX－5HRESV40－NT3－IRES－EGFP質(zhì)粒構(gòu)建成功（圖1C）。然后將經(jīng)過雙酶切和PCR鑒定正確的質(zhì)粒送往TaKa－Ra公司進(jìn)行進(jìn)一步測序鑒定，比對結(jié)果顯示，測序結(jié)果與預(yù)期序列完全一致，說明已成功構(gòu)建了重組的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體質(zhì)粒pLNCX－5HRE－SV40－NT3－IRES－EGFP。

圖1 質(zhì)粒圖譜及鑒定結(jié)果Fig.1Schematic diagram and identification of the plasmids

2.3 穩(wěn)定出毒的包裝細(xì)胞鑒定及病毒滴度檢測 將構(gòu)建的重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)染PT67細(xì)胞，經(jīng)過G418篩選約3周后，用熒光顯微鏡觀察報(bào)告基因EGFP的表達(dá)情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，存活下來的細(xì)胞（PT67－5HRENT3）幾乎全為EGFP陽性細(xì)胞（圖2A），而在未進(jìn)行質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的正常PT67細(xì)胞中未觀察到EGFP表達(dá)（圖2B）。通過反轉(zhuǎn)錄PCR檢測發(fā)現(xiàn)，在PT67－5HRE－NT3中檢測到外源基因SV40mRNA表達(dá)（圖2C），但在正常的PT67細(xì)胞中未檢測到外源基因SV40（圖2D），說明已成功將外源基因轉(zhuǎn)導(dǎo)入包裝細(xì)胞PT67細(xì)胞中。為了進(jìn)一步確定獲得的細(xì)胞可以穩(wěn)定出毒，將培養(yǎng)的包裝細(xì)胞（PT67－5HRE－NT3）上清收集后感染NIH 3T3細(xì)胞，觀察包裝細(xì)胞的出毒情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，用PT67－5HRENT3培養(yǎng)上清處理的NIH 3T3細(xì)胞中有EGFP表達(dá)，說明上清中含有病毒顆粒RV－5HRE－NT3。經(jīng)過流式細(xì)胞儀檢測分析后，計(jì)算出其病毒滴度為6.87×105cfu/mL。將含病毒的上清進(jìn)一步經(jīng)過高速離心純化和濃縮后，其滴度可達(dá)9.1×106cfu/mL（圖3）。

圖2 穩(wěn)定出毒的包裝細(xì)胞鑒定Fig.2Identification of stable package cell lines and virus titer

3 討論

缺氧特異性調(diào)節(jié)系統(tǒng)可以實(shí)現(xiàn)靶基因在正常的常氧組織中不表達(dá)或者低表達(dá)，而在缺氧組織中高表達(dá)［2－4］，因此已經(jīng)被廣泛地用來進(jìn)行缺氧組織中的基因治療的缺氧特異性調(diào)控表達(dá)的研究。迄今，許多研究已經(jīng)使用不同拷貝的HRE從轉(zhuǎn)錄水平對治療基因的表達(dá)進(jìn)行缺氧特異性調(diào)控。雖然HRE的拷貝數(shù)不同，但是它們都可以調(diào)節(jié)靶基因在缺氧條件下特異性高表達(dá)。有些研究發(fā)現(xiàn)，5個拷貝的人VEGF來源的HRE可以有效介導(dǎo)靶基因的缺氧特異性表達(dá)調(diào)控［5］；但是也有研究認(rèn)為9個拷貝的人EPO來源的HRE較為合適［4］。這種差異可能是由于他們所使用的啟動子不同所引起的，迄今在HRE調(diào)節(jié)的缺氧特異性表達(dá)系統(tǒng)中主要所用的啟動子有CMVmp和SV40mp［3－5］。根據(jù)前期研究結(jié)論［2］，本研究選擇5個拷貝的人VEGF來源的HRE和SV40mp作為調(diào)節(jié)NT－3缺氧反應(yīng)性高表達(dá)的表達(dá)框。

圖3 病毒滴度檢測Fig.3Identification of virus titer

逆轉(zhuǎn)錄病毒載體DNA可以穩(wěn)定的整合入宿主基因組中，這是基因轉(zhuǎn)導(dǎo)的一種優(yōu)勢，通過基因整合，外源基因可以長期穩(wěn)定的表達(dá)，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)理想的治療效果［6］。此外，與腺病毒和慢病毒等其他種類病毒相比較，逆轉(zhuǎn)錄病毒在包裝生產(chǎn)技術(shù)上相對比較容易。

目前將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)導(dǎo)入真核細(xì)胞的方法主要有顯微注射法、電穿孔法、DEAE－葡聚糖轉(zhuǎn)染法、磷酸鈣轉(zhuǎn)染法和脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法［7］。脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法最早是WEINSTEIN等［8］于1984年開始使用的。目前普遍認(rèn)為Lipofectamine 2000的轉(zhuǎn)染效果最好，其具有感染宿主細(xì)胞范圍廣、轉(zhuǎn)染效率高和細(xì)胞毒性小等優(yōu)點(diǎn)［9］。此外，在脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染DNA過程中還受到很多其他因素的影響，如細(xì)胞狀態(tài)、DNA質(zhì)量、培養(yǎng)基中有無血清、轉(zhuǎn)染的DNA量和脂質(zhì)體量的比例、抗生素等［10］。因此，本研究選擇了Lipofectamine 2000進(jìn)行轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)。

在病毒的應(yīng)用研究中有效的滴度是非常重要的，因此尋求一種簡單方便的病毒上清濃縮方法是有效地利用病毒進(jìn)行基因轉(zhuǎn)導(dǎo)的關(guān)鍵。梯度離心法是傳統(tǒng)的病毒濃縮方法，但是其操作復(fù)雜。因此，我們采取了一種簡易的濃縮方法：將收集的病毒上清以50 000×g轉(zhuǎn)速，4℃離心2h，棄上清，加入0.5％～1％（體積分?jǐn)?shù)）的TNE。有研究報(bào)道與傳統(tǒng)的梯度離心法相比，這種簡易的濃縮方法獲得的病毒滴度無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異［11］。在本研究中，通過此方法濃縮后的病毒滴度可達(dá)9.1× 106cfu/mL。

在基因轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)的研究中，報(bào)告基因常被用來監(jiān)測外源基因的表達(dá)情況或者監(jiān)測順式反應(yīng)元件的調(diào)控能力。常用的報(bào)告基因有氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶、β－半乳糖苷酶、蟲熒光素酶、堿性磷酸酶和綠熒光蛋白（GFP）［12］。GFP是由SHIMOMURA于1962年從水母光蛋白中分離純化出來的一種熒光蛋白，其具有自發(fā)熒光的特性，而且熒光性質(zhì)穩(wěn)定，不易淬滅。EGFP是GFP的增強(qiáng)變異體，通過改變GFP氨基酸序列中的氨基酸殘基，用人來源的密碼子替代野生型密碼子，從而大大提高了其在哺乳動物細(xì)胞中的兼容性，而且熒光強(qiáng)度比GFP強(qiáng)35倍［13］。因此，本研究選擇了EGFP作為本研究的報(bào)告基因。

缺血/缺氧－特異性基因表達(dá)體系對安全的和有效的基因治療都非常重要，隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，有效的缺血/缺氧反應(yīng)基因調(diào)節(jié)體系將被開發(fā)出來。這些調(diào)節(jié)體系將會結(jié)合轉(zhuǎn)錄、翻譯和翻譯后水平的調(diào)節(jié)，通過各種努力開發(fā)出高缺血/缺氧－特異性的基因表達(dá)體系，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)包括缺血性卒中在內(nèi)的缺血性疾病安全和有效的基因治療。

［1］CAI J，HUA F，YUAN L，et al.Potential therapeutic effects of neurotrophins for acute and chronic neurological diseases ［J］.Biomed Res Int，2014，2014：601084.

［2］SHI Q，ZHANG P，ZHANG J，et al.Adenovirus－mediated brain－derived neurotrophic factor expression regulated by hypoxia response element protects brain from injury of transient middle cerebral artery occlusion in mice［J］.Neurosci Lett，2009，465（3）：220－225.

［3］KIM HA，LIM S，MOON HH，et al.Hypoxia－inducible vascular endothelial growth factor gene therapy using the oxygen－dependent degradation domain in myocardial ischemia［J］.Pharm Res，2010，27（10）：2075－2084.

［4］SHEN F，F(xiàn)AN Y，SU H，et al.Adeno－associated viral vectormediated hypoxia－regulated VEGF gene transfer promotes angiogenesis following focal cerebral ischemia in mice［J］.Gene Ther，2008，15（1）：30－39.

［5］SHITABA T，GIACCIA AJ，BROWN JM.Hypoxia－inducible regulation of a prodrug－activating enzyme for tumor－specific gene therapy［J］.Neoplasia，2002，4（1）：40－48.

［6］MILLER AD.Retroviral vector production［J］.Curr Protoc Hum Genet，2014，80：12－15.

［7］BRANDL M.Liposomes as drug carriers：a technological approach［J］.Biotechnol Annu Rev，2001，7：59－85.

［8］WEINSTEIN JN.Liposomes as drug carriers in cancer therapy ［J］.Cancer Treat Rep，1984，68（1）：127－135.

［9］BARTEAU B，CHEVRE R，LETROUBONNEVAL E，et al.Physicochemical parameters of non－viral vectors that govern transfection efficiency［J］.Curr Gene Ther，2008，8（5）：313－323.

［10］CHEN JL，WANG H，GAO JQ，et al.Liposomes modified with polycation used for gene delivery：preparation，characterization and transfection in vitro［J］.Int J Pharm，2007，343（1－2）：255－261.

［11］馬進(jìn)財(cái)，劉吉勇，劉紹玲.兩種重組逆轉(zhuǎn)錄病毒濃縮方法的比較［J］.山東醫(yī)藥，2006，46（7）：20－21.

［12］NAYLOR LH.Reporter gene technology：the future looks bright ［J］.Biochem Pharmacol，1999，58（5）：749－757.

［13］LIPPINCOTT－SCHWARTZ J，PATTERSON GH.Development and use of fluorescent protein markers in living cells［J］.Science，2003，300（5616）：87－91.

（編輯 卓選鵬）

Construction and identification of the recombinant retroviral vector to carry out hypoxia－regulated expression of neurotrophin－3

ZHANG Jun－feng1，SHI Li－li1，ZHANG Li1，YANG Peng－bo2，ZHANG Jian－shui2，LIU Yong2，QI Cun－fang3，XU Xi1
（1.Department of Anatomy，Xi’an Medical College，Xi’an 710021；2.Institute of Neurobiology，Xi’an Jiaotong University Health Science Center，Xi’an 710061；3.Department of Anatomy，Qinghai University School of Medicine，Xining 810001，China）

Objective To construct and identify the recombinant retroviral vector containing five copies of hypoxia responsive elements（5HRE）and neurotrophin－3（NT－3）.Methods Using PCR，enzyme digestion and DNA ligase，5HRE and human derived NT－3 were cloned into the retroviral vector plasmid（pLNCX）to construct the recombinant retroviral vector plasmid pLNCX－5HRE－SV40－NT3－IRES－EGFP.The retrovirus RV－5HRE－NT3 was packaged in the PT67 cells，and then it was purified and concentrated by high－speed centrifugation.After infected for 48 h with the concentrated retrovirus，the number of the EGFP positive cells in the NIH3T3 cells was counted by fluorescence activated cells and sorted to calculate the retrovirus titer.Results The retroviral vector plasmid，pLNCX－5HRE－SV40－NT3－IRES－EGFP，was successfully constructed，and the retrovirus was packaged and defined as RV－5HRE－NT3.After purification and concentration，the retrovirus titer reached 9.1×106cfu/mL.Conclusion The recombinant retroviral vector which carried out hypoxia－regulated expression of NT－3 was successfully constructed.It may provide basis for studies on hypoxia－regulated expression of the exogenous genes.

retroviral vector；hypoxia－regulated expression；neurotrophin－3（NT－3）

R338；R741.02

A

10.7652/jdyxb201602009

2015－02－13

2015－06－04

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（No.81301041）；陜西省青年科技新星項(xiàng)目（No.2015KJXX－43）；陜西省優(yōu)勢學(xué)科建設(shè)經(jīng)費(fèi)資助［No.陜教辦（2014）3－1001］；陜西省教育廳專項(xiàng)科研計(jì)劃項(xiàng)目（No.2013JK0756、14JK1614）；青海省應(yīng)用基礎(chǔ)研究資助項(xiàng)目（No.2013－Z－727）Supported by the National Natural Science Foundation of China（No.81301041），Scientific Research Program Funded by the Department of Science and Technology of Shaanxi Province（No.2015KJXX－43），the Leading Disciplines Development Government Foundation of Shaanxi（No.［2014］3－1001），the Scientific Research Program Funded by Shaanxi Provincial Education Department（No.2013JK0756，14JK1614），and Basic Application Research Program Funded by Qinghai Science ＆Technology Department（No.2013－Z－727）

徐曦.E－mail：xmux@qq.com

優(yōu)先出版：http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1399.R.20150929.0909.014.html（2015－09－29）