任公平，那 輝，佟 雷，李華洋

（1.牡丹江醫(yī)學院紅旗醫(yī)院，黑龍江牡丹江 157011；2.黑龍江幼兒師范高等?？茖W校，黑龍江牡丹江 157011；3.牡丹江醫(yī)學院藥學院，黑龍江牡丹江 157011）

辣椒素通過下調(diào)COX－2和mPGES－1抑制IL－1β誘導的NCI－H460細胞PGE2含量的實驗研究

任公平1，那 輝2，佟 雷3，李華洋1

（1.牡丹江醫(yī)學院紅旗醫(yī)院，黑龍江牡丹江 157011；2.黑龍江幼兒師范高等?？茖W校，黑龍江牡丹江 157011；3.牡丹江醫(yī)學院藥學院，黑龍江牡丹江 157011）

目的 觀察辣椒素對IL－1β誘導的人肺腺癌NCI－H460細胞PGE2含量的影響，并且進一步觀察其對COX－2和mPGES－1的影響，探討其抗非小細胞肺癌（NSCLC）的可能機制。方法 體外培養(yǎng)NCI－H460細胞，采用MTT比色分析法，觀察辣椒素對NCI－H460細胞增殖抑制作用，計算IC50；采用IL－1β刺激的方法構(gòu)建炎癥模型，ELISA法檢測辣椒素對NCI－H460細胞PGE2含量和COX－2活性的影響；Western blot法檢測辣椒素對NCI－H460細胞COX－2、mPGES－1蛋白表達的影響；Real－time PCR法檢測辣椒素對NCI－H460細胞COX－2mRNA和mPGES－1mRNA表達的影響。結(jié)果 MTT比色分析結(jié)果表明，辣椒素對NCI－H460細胞增殖具有明顯抑制作用，與對照組比較，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05或P＜0.01）。辣椒素明顯降低NCI－H460細胞COX－2活性和PGE2濃度，而且明顯降低NCIH460細胞COX－2、mPGES－1蛋白及其mRNA的表達，且呈劑量依賴性，與模型組比較，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。結(jié)論 辣椒素通過降低NCI－H460細胞COX－2和mPGES－1mRNA表達從而抑制PGE2釋放，可能是其抗NSCLC的機制之一。

辣椒素；非小細胞肺癌；環(huán)氧化酶－2（COX－2）；微粒體型前列腺素E合成酶－1（mPGES－1）；前列腺素E2（PGE2）

肺癌是如今最常見的惡性腫瘤，也是發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤。在中國，肺癌每年大約致40萬例患者死亡，已經(jīng)成為嚴重的社會問題［1－2］。在肺癌的病理學分型中，80％是非小細胞肺癌（non－small cell lung cancer，NSCLC），包括腺癌、鱗狀上皮細胞癌和大細胞癌，為當今對人類健康和生命危害最大的惡性腫瘤之一［3］，給患者和社會帶來極大的經(jīng)濟負擔。近年來，關(guān)于辣椒素（capsaicin，CAP）抗癌作用的研究在國內(nèi)外日益受到學者的高度重視。辣椒素是紅辣椒的一種活性成分。有研究表明，辣椒素可以抑制癌癥細胞的增殖，促進凋亡，提示可以作為一種化療藥物或化療輔助用藥［4－5］。雖然辣椒素具有抗癌作用，但是其有關(guān)于NSCLC的研究依然鮮見報道。研究發(fā)現(xiàn)，肺癌可能源自慢性炎癥反應(yīng)［6］。前列腺素E2（prostaglandin E2，PGE2）是人體中表達量最高的前列腺素，在機體炎癥和發(fā)熱的病理生理過程中起著關(guān)鍵作用。而環(huán)氧化酶－2（cyclooxygenase－2，COX－2）作為PGE2合成通路的限速酶與肺癌的關(guān)系非常密切，但是PGE2合成通路上的其他酶，尤其是下游微粒體型前列腺素E合成酶－1（microsomal prostaglandin E synthase－1，mPGES－1）是否參與了肺癌的發(fā)生過程則少見報道。故此，本研究采用體外IL－1β刺激人肺腺癌NCI－H460細胞的方法，構(gòu)建炎癥模型，旨在觀察辣椒素對NCI－H460細胞PGE2含量、COX－2活性及對mPGES－1的影響，探討其抗NSCLC的可能機制。

1 材料與方法

1.1 細胞與試劑 人大細胞肺癌細胞NCI－H460購自中科院上海細胞庫；辣椒素（純度＞99％）購自美國Sigma公司；選擇性COX－2抑制劑尼美舒利和mPGES－1抑制劑MK886購自美國Biomol公司；RPMI－1640培養(yǎng)基購自美國HyClone公司；牛血清白蛋白（BSA）購自PAA公司；二甲基亞砜（DMSO）和白細胞介素－1β（IL－1β）購自徐州試劑二廠；COX－2和PGE2ELISA測定試劑盒購自美國Cayman Chemical公司；兔抗人COX－2抗體和兔抗人mPGES－1抗體購自美國Santa Cruz公司；辣根過氧化物酶標記抗鼠IgG二抗購自美國Santa Cruz公司。其他試劑均為國產(chǎn)或進口分析純。

1.2 細胞培養(yǎng) NCI－H460細胞保存在含有100 mL/L BSA的RPMI－1640營養(yǎng)培養(yǎng)基（含L－谷氨酰胺、青霉素100U/mL和鏈霉素100μg/mL），37℃、50mL/L CO2及飽和濕度下培養(yǎng)。當NCI－H460細胞達80％匯合度時，用0.5g/L胰蛋白酶/0.5g/L EDTA消化。按照2×106個細胞/孔接種于超低吸附6孔板中，37℃、50mL/L CO2及飽和濕度下培養(yǎng)48h。收集懸浮的細胞經(jīng)EDTA處理制備成單細胞懸液，然后用RPMI－1640培養(yǎng)液洗滌細胞。收集對數(shù)生長期細胞，備用。

1.3 實驗藥物 辣椒素溶解于DMSO，配成300 μmol/L溶液，－20℃保存。臨用時，以完全培養(yǎng)液稀釋到所需濃度。

1.4 炎癥模型的構(gòu)建 取對數(shù)生長期NCI－H460細胞，按照1×104個細胞/孔接種于96孔板中，37℃、50mL/L CO2及飽和濕度下過夜培養(yǎng)。實驗分為5組，模型組：每孔加入DMSO和30μg/L的IL－1β；低劑量組：每孔加入100μmol/L辣椒素和30μg/L的IL－1β；中劑量組：每孔加入200μmol/L辣椒素和30 μg/L的IL－1β；高劑量組：每孔加入300μmol/L辣椒素和30μg/L的IL－1β；對照組：每孔加入等體積DMSO。每組設(shè)6個平行孔。37℃、50mL/L CO2及飽和濕度下培養(yǎng)24h后，用于除MTT比色分析外的實驗。

1.5 MTT比色法測定細胞抑制率 取對數(shù)生長期NCI－H460細胞，按照1×104個細胞/孔接種于96孔板中，總體積為200μL，過夜培養(yǎng)。次日，實驗組每孔加入終濃度為100、200、300、400、500μmol/L的辣椒素，對照組除未加辣椒素外，其余條件與實驗組完全一致。每組設(shè)6個平行孔，將培養(yǎng)板置于37℃、50mL/L CO2及飽和濕度下培養(yǎng)，分別培養(yǎng)24、48h后，每孔加入MTT溶液（5g/L）20μL，37℃、50mL/L CO2及飽和濕度下繼續(xù)培養(yǎng)4h終止培養(yǎng)，小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液，然后每孔加入DMSO，振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解，570nm波長處，以空白培養(yǎng)液調(diào)零點，酶標儀測定吸光度（A）值，取6孔平均值。抑制率＝（1－A實驗組/A對照組）×100％。在Graphpad prism 5統(tǒng)計軟件中計算出半數(shù)抑制濃度（IC50）。

1.6 PGE2濃度的測定 NCI－H460細胞經(jīng)辣椒素和IL－1β處理24h后，加入10μmol/L花生四烯酸，37℃、50mL/L CO2及飽和濕度下培養(yǎng)30min，按照PGE2ELISA試劑盒說明書步驟操作，490nm波長，9602G酶標儀測定吸光度（A）值。每份樣品檢測3次。

1.7 COX－2活性的測定 NCI－H460細胞經(jīng)藥物處理24h后，加入預冷的1mmol/L EDTA溶液（含10mL/L BSA），4℃、2 000r/min（R＝8.5cm）離心10min，取沉渣加入10mmol/L Tris－HCl（pH＝7.5）100μL，冰浴超聲3×4s后，4℃1 0000r/min（R＝8.5cm）離心15 min，取上清。按照COX－2ELISA試劑盒說明書檢測COX－2活性。每份樣品檢測3次。

1.8 Western blot檢測 NCI－H460細胞經(jīng)藥物處理24h后，用細胞裂解液（20mmol/L Tris－HCl，1.5 mL/L Triton X－100，150mmol/L NaCl，10％甘油，1mmol/L Na4P2O7，50 mmol/L NaF，1 mmol/L PMSF）和蛋白酶抑制劑（5μmol/L AEBSF－HCl，5μmol/L EDTA，10mmol/L leupeptin，1.5mmol/L E－64，pH＝7.4）裂解細胞后，收集裂解液，Bradford法測定蛋白質(zhì)含量。取20μg蛋白質(zhì)加入2×上樣緩沖液，95℃變性5min。隨后進行75g/L SDS－PAGE凝膠電泳。電泳后，電轉(zhuǎn)至0.45μm硝酸纖維素膜，用含50g/L的脫脂奶粉PBST（25mmol/L Tris，pH ＝7.5，150mmol/L NaCl，1g/L Tween20）封閉1h，分別加入兔抗人COX－2抗體，兔抗人mPGES－1抗體（1∶1 000稀釋）4℃孵育過夜，PBST洗滌3次，每次5min。加入HRP標記的二抗（1∶2 000稀釋）室溫孵育2h，PBST洗滌3次，每次5min。按同樣的方法與β－actin抗體孵育。ECL化學發(fā)光試劑顯色，通過Bio－Rad凝膠成像進行目的條帶的表達檢測及分析。蛋白的相對表達強度＝目標蛋白表達強度/βactin蛋白表達強度。每份樣品檢測3次。

1.9 Real－time PCR檢測 NCI－H460細胞經(jīng)藥物處理24h后，按照Trizol試劑盒說明書抽提總RNA。Nanodrop2000檢測RNA純度。使用M－MLV逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（Reverse transcriptase kit promega，Japan）進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，成單鏈的cDNA，操作按照試劑盒說明書進行。利用PubMed查找相關(guān)基因序列，并利用引物合成軟件Primer Premier 5.0設(shè)計引物，引物序列見表1。使用Quant SYBR Green PCR kit按照PCR引物進行擴增，用Applied Biosystems 7500型定量PCR儀測出ΔC值及熔解曲線，計算出相對基因表達量。每份樣品檢測3次。

表1 Real－time PCR序列Tab.1 Real－time PCR sequence

1.10 統(tǒng)計學分析 采用Graphpad5.0軟件進行描述性統(tǒng)計。計量資料用珔x±s表示。資料呈正態(tài)分布且方差齊性時，多組間均數(shù)比較，采用One－way－ANOWA分析，組間兩兩比較，采用SNK－q檢驗；資料呈非正態(tài)分布或（和）方差不齊時，進行變量變換后采用One－way－ANOWA分析或SNK－q檢驗。檢驗水準α＝0.05。

2 結(jié)果

2.1 辣椒素對NCI－H460細胞增殖的影響 MTT結(jié)果顯示，不同終濃度（100～500μmol/L）的辣椒素分別作用于NCI－H460細胞24h和48h后，隨著終濃度的增大和作用時間的延長，其對細胞的抑制率也明顯增強，呈濃度和時間依賴性，終濃度為200～500 μmol/L的辣椒素與對照組比較，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05或P＜0.01，表2）。辣椒素作用24h和48h的IC50分別為366.2μmol/L和328.2μmol/L。因24h的IC50＞300μmol/L，故此后續(xù)實驗均采用≤300μmol/L為辣椒素處理濃度。

表2 辣椒素對NCI－H460細胞增殖的影響Tab.2 The effect of capsaicin on the proliferation of NCI－H460cells （珔x±s，n＝6）

2.2 辣椒素對NCI－H460細胞PGE2含量的影響模型組PGE2濃度顯著升高，與對照組比較，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；中劑量組和高劑量組PGE2濃度顯著降低，且呈劑量依賴性，與模型組比較，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05或P＜0.01）；低劑量組PGE2濃度雖然降低，但是與模型組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05，表3）。

表3 辣椒素對NCI－H460細胞PGE2含量及COX－2活性的影響Tab.3 The effect of capsaicin on PGE2 concentration and COX－2activity of NCI－H460cells （珔x±s，n＝3）

2.3 辣椒素對NCI－H460細胞COX－2活性的影響模型組COX－2活性顯著增強，與對照組比較，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；中劑量組和高劑量組COX－2活性顯著減弱，且呈劑量依賴性，與模型組比較，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05，P＜0.01）；低劑量組COX－2活性雖然減弱，但是與模型組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05，表3）。

2.4 辣椒素對NCI－H460細胞COX－2和mPGES－1蛋白表達的影響 Western blot結(jié)果顯示，模型組COX－2和mPGES－1蛋白表達升高，與對照組比較，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；中劑量組和高劑量組COX－2和mPGES－1蛋白表達顯著降低，且呈劑量依賴性，與模型組比較，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05，P＜0.01）；低劑量組COX－2和mPGES－1蛋白表達雖然降低，但是與模型組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05，圖1）。

圖1 辣椒素對NCI－H460細胞COX－2和mPGES－1蛋白表達的Western blot結(jié)果Fig.1Western blot analysis results of capsicin’s effect on COX－2 and mPGES－1protein expression in NCI－H460cells

2.5 辣椒素對NCI－H460細胞COX－2mRNA和mPGES－1mRNA表達的影響 Real－time PCR分析顯示，模型組COX－2mRNA和mPGES－1mRNA的表達顯著上調(diào)，與對照組比較，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；中劑量組和高劑量組COX－2mRNA和mPGES－1mRNA的表達顯著下調(diào)，且呈劑量依賴性，與模型組比較，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05，P＜0.01）；低劑量組COX－2mRNA和mPGES－1mRNA的表達雖然下調(diào)，但是與模型組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05，圖2）。

圖2 辣椒素對NCI－H460細胞COX－2mRNA和mPGES－1 mRNA表達的Real－time PCR結(jié)果Fig.2Real－time PCR analysis results of capsaicin’s effect on COX－2 mRNA and mPGES－1 mRNA expression in NCIH460cells

3 討論

肺癌是癌癥患者死亡的頭號殺手，5年生存率很低，僅為15％，對人類健康和生命危害極大［7］。因此，尋找治療和預防肺癌的新方法尤為必要。慢性炎癥反應(yīng)在肺癌的發(fā)病過程中可能起到關(guān)鍵性作用。

PGE2是花生四烯酸代謝產(chǎn)物，是一種重要的細胞生長和調(diào)節(jié)因子，在機體炎癥、發(fā)熱、疼痛等病理生理過程中起重要作用。研究證實，PGE2與腫瘤關(guān)系十分密切，不僅起封閉因子作用，還可以促進腫瘤血管生成、誘導腫瘤細胞增生、抑制腫瘤細胞凋亡而促進腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移［8］。環(huán)氧化酶（cyclooxygenase，COX）會使花生四烯酸大量轉(zhuǎn)變?yōu)镻GE2，是催化花生四烯酸轉(zhuǎn)化為PGE2的限速酶［9］。COX－2和mPGES－1是PGE2合成過程中兩個重要的限速酶，二者均是誘導型酶，在正常組織中均不表達或者很少表達，一般只在應(yīng)激后（如感染、缺氧、致瘤物質(zhì)刺激等）表達增加，參與炎癥、疼痛、腫瘤等多種病理生理過程［10－11］。

COX－2是COX兩種同工酶中的一種，在多種腫瘤組織中高表達，能促進癌細胞的增殖，延緩凋亡，致使癌癥患者預后較差［12］。COX－2陽性表達，可促進NSCLC的發(fā)生、發(fā)展及侵襲轉(zhuǎn)移［13］。而COX－2下游一個重要的基因是mPGES－1。mPGES－1是PGE2合成過程中最后一個催化酶，會被IL－1β、TNF－α等前炎癥因子誘導而過表達，從而提高PGE2的生成［11］。由COX－2介導的一些病理過程，如發(fā)熱反應(yīng)、風濕性關(guān)節(jié)炎、組織再生和老年性癡呆等都與mPGES－1相關(guān)［14］。目前，mPGES－1被認為是一個優(yōu)于COX－2的藥物靶標，倍受關(guān)注［15］。另有研究證實，在肺癌中mPGES－1表達明顯升高［16］。COX－2 和mPGES－1可以作為腫瘤治療新型靶點，在臨床治療腫瘤中必將顯示其治療意義和價值，成為一條更理想更安全的干預途徑。

辣椒素可通過多種途徑在體內(nèi)外發(fā)揮抗癌癥作用，如誘導人結(jié)腸癌HCT116細胞和胰腺癌BxPC－3細胞凋亡［17－18］，抑制小細胞肺癌細胞H69和H82增殖［19］。另外還有報道稱，辣椒素可下調(diào)VEGF而抑制NSCLC血管生成［20］。本研究采用MTT檢測辣椒素對NCI－H460細胞增殖的影響。結(jié)果表明，辣椒素具有明顯的NCI－H460細胞毒性作用，降低NCIH460細胞的增殖能力。本結(jié)果提示，辣椒素也表現(xiàn)出抑制NCI－H460細胞增殖的能力。

為證實辣椒素抑制NCI－H460細胞增殖作用是否與PGE2途徑有關(guān)。本研究通過體外IL－1β刺激NCI－H460細胞，構(gòu)建炎癥模型，觀察辣椒素對PGE2及COX－2和mPGES－1的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在IL－1β的誘導下，NCI－H460細胞PGE2含量、COX－2活性、COX－2和mPGES－1蛋白表達及mRNA的表達均升高，本實驗結(jié)果與王靜媛等［15］報道相一致。給予辣椒素干預后顯示，辣椒素可以降低NCI－H460細胞PGE2含量，抑制COX－2活性，進一步Western blot分析和RT－PCR分析證實，辣椒素還可以降低NCIH460細胞COX－2和mPGES－1蛋白表達和mRNA表達。以上結(jié)果提示，辣椒素可能通過下調(diào)NCIH460細胞COX－2和mPGES－1表達抑制PGE2生成而發(fā)揮抗NSCLC作用。

綜上所述，COX－2和mPGES－1可能成為阻止NSCLC發(fā)生、發(fā)展的新靶點。辣椒素可降低NCIH460細胞PGE2生成而發(fā)揮抗NSCLC作用，其機制可能與下調(diào)NCI－H460細胞COX－2和mPGES－1表達有關(guān)。

（致謝：本研究在數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析過程中得到黑龍江幼兒師范高等?？茖W校那輝老師的熱情指導和幫助，特此表示感謝?。?/p>

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Experimental study of the inhibitory effect of capsaicin on PGE2concentration of IL－1βinduced NCI－H460cells by downregulating COX－2and mPGES－1

REN Gong－ping1，NA Hui2，TONG Lei3，LI Hua－yang1
（1.Hongqi Hospital of Mudanjiang Medical University，Mudanjiang 157011；2.Heilongjiang Preschool Education College，Mudanjiang 157011；3.School of Pharmacy，Mudanjiang Medical College，Mudanjiang 157011，China）

Objective To observe the effects of capsaicin on PGE2concentration of IL－1β－induced human large cell carcinoma NCI－H460 cells，and further observe its effect on COX－2 and mPGES－1 so as to explore the possible mechanisms against non－small cell lung cancer.Methods NCI－H460 cells were cultured in vitro；the effect of capsaicin in inhibiting NCI－H460 cells proliferation was observed.The 50％inhibitory concentration（IC50）was measured by MTT assay.IL－1βstimulation method was used to construct inflammation model，and the effects of capsaicin on COX－2 activity and PGE2concentration in NCI－H460 cells were measured by ELISA.The effects of capsaicin on COX－2 and mPGES－1 protein level in NCI－H460 cells were analyzed by Western blot；the effects of capsaicin on COX－2 mRNA and mPGES－1 mRNA expressions in NCI－H460 cells were analyzed by Real－time PCR.Results MTT assay results showed that the growth of NCI－H460 cells treated with capsaicin was significantly inhibited compared with the control group（P＜0.05 or P＜0.01）.Capsaicin could significantly decrease COX－2 activity and PGE2concentration in NCI－H460 cells，and significantly decrease COX－2，mPGES－1 protein levels as well as COX－2，mPGES－1 mRNA expressions in NCI－H460 cells in a dose－dependent manner compared with the control group（P＜0.05）.Conclusion Capsaicin inhibits the release of PGE2 by downregulating COX－2 and mPGES－1 mRNA expressions in NCI－H460 cells，which may be one mechanism of its effect against non－small cell lung cancer.

capsaicin；non－small cell lung cancer；cyclooxygenase－2（COX－2）；microsomal prostaglandin E synthase－1（mPGES－1）；prostaglandin E2（PGE2）

R585.5

A

10.7652/jdyxb201602028

2014－12－31

2015－11－17

李華洋.E－mail：lihy1979@foxmail.com

優(yōu)先出版：http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1399.R.20160202.1646.024.html（2016－02－02）

◇技術(shù)方法研究◇