耿曉英，張愛(ài)香，騫 健，郭 剛，張璐璐，王 靜

（西安交通大學(xué)附屬?gòu)V仁醫(yī)院，西安市第四醫(yī)院，陜西西安 710004）

姜黃素和腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子對(duì)阿爾茨海默病記憶的改善作用

耿曉英，張愛(ài)香，騫 健，郭 剛，張璐璐，王 靜

（西安交通大學(xué)附屬?gòu)V仁醫(yī)院，西安市第四醫(yī)院，陜西西安 710004）

目的 研究姜黃素對(duì)阿爾茨海默?。ˋlzheimer’s disease，AD）模型大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響及其作用機(jī)制。方法 采用腦室內(nèi)注射Aβ1－42的方法，制備AD動(dòng)物模型。單次腹腔注射（急性治療組）或連續(xù)6d腹腔注射（慢性治療組）50、100、300mg/kg劑量的姜黃素，結(jié)合海馬內(nèi)微量注射腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（brain－derived neurotrophic factor，BDNF）（每側(cè)1.0μg）、BDNF shRNA慢病毒（每側(cè)2.0×105單位），分析大鼠Y迷宮、Morris水迷宮及曠場(chǎng)行為變化，并應(yīng)用Western blot檢測(cè)海馬BDNF表達(dá)變化。結(jié)果 姜黃素急性治療對(duì)AD模型大鼠自主改變行為、總活動(dòng)距離、水迷宮潛伏期沒(méi)有顯著作用。300mg/kg姜黃素慢性治療后AD大鼠自主改變行為（P＜0.000 1）及在水迷宮測(cè)試中記憶能力（P＜0.05）比鹽水對(duì)照組顯著增高。100和300mg/kg姜黃素慢性治療組海馬BDNF表達(dá)和鹽水對(duì)照組相比顯著上升（P分別＜0.05和＜0.000 1）。海馬內(nèi)注射BDNF的AD大鼠水迷宮潛伏期顯著下降（F4，295＝5.813，P＜0.01）。姜黃素慢性治療＋shBDNF組大鼠在2號(hào)象限內(nèi)的游泳時(shí)間與鹽水對(duì)照組無(wú)差異（P＝0.657），而100 mg/kg姜黃素組、BDNF組、假手術(shù)組大鼠的停留時(shí)間比鹽水對(duì)照組顯著增高（P值分別＜0.05、＜0.05、＜0.000 1）。結(jié)論 姜黃素可能通過(guò)上調(diào)BDNF的表達(dá)繼而激活下游信號(hào)通路，最終對(duì)Aβ誘導(dǎo)的AD大鼠學(xué)習(xí)記憶能力起到改善作用。

阿爾茨海默??；姜黃素；海馬；腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子；Y迷宮；Morris水迷宮；曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)；shRNA

阿爾茨海默?。ˋlzheimer’s disease，AD）是臨床最常見(jiàn)的一種癡呆（dementia）病癥，是老年人常見(jiàn)的神經(jīng)退行性疾病。AD患者典型的主要臨床表現(xiàn)為進(jìn)行性的認(rèn)知障礙、記憶功能減退、日常生活能力降低及人格改變［1］。其典型的組織學(xué)改變包括神經(jīng)毒素淀粉質(zhì)β多肽（amyloid beta peptide，Aβ）在細(xì)胞外大量沉淀，減低突觸可塑性，引起突觸丟失，促成氧化損傷，進(jìn)而引起神經(jīng)元內(nèi)的tau蛋白超磷酸化［2］，然而AD的病因和確切發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明。

姜黃素（curcumin，Cur）是一種傳統(tǒng)草藥姜黃（Curcuma longa）的主要多酚類成分提取物。其功能有抗細(xì)菌、抗病毒、廣泛的分子靶向作用、抗氧化、類蛋白激酶作用，從而影響信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，改善認(rèn)知［3－4］。腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（brain－derived neurotrophic factor，BDNF）是神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子家族的一員，在人的大腦皮質(zhì)和海馬組織有高水平表達(dá)，并能在功能和形態(tài)上調(diào)節(jié)突觸可塑性。目前尚未見(jiàn)報(bào)道姜黃素對(duì)AD治療作用是否與BDNF有關(guān)。本研究采用向大鼠腦室內(nèi)注射Aβ1－42，建立AD模型，用姜黃素治療及/或BDNF干預(yù)或改變其活性時(shí)，觀察模型大鼠行為學(xué)改變，以揭示姜黃素治療AD發(fā)病的部分機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與試劑 成年Sprague－Dawley（SD）雄性大鼠共150只，體質(zhì)量200～220g。姜黃素及Aβ1－42標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自Sigma－Aldrich公司。BDNF全長(zhǎng)蛋白質(zhì)及兔抗BDNF多克隆抗體購(gòu)自Abcam公司。小鼠抗GAPDH抗體購(gòu)自Millipore公司。BDNF shRNA慢病毒顆粒、非靶向性對(duì)照慢病毒顆粒、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔或山羊抗小鼠IgG二抗皆購(gòu)自Santa Cruz公司。

1.2 AD模型建立 采用腦室內(nèi)注射Aβ1－42的方法制備AD動(dòng)物模型。用生理鹽水配制Aβ1－42為5mg/mL溶液，于37℃孵育72h進(jìn)行活化。大鼠腹腔注射350mg/kg體質(zhì)量的水合氯醛麻醉后置于腦立體定位裝置（深圳沃瑞德生命科技公司）上固定。大鼠頭部去毛并消毒皮膚，頭頂正中切開皮膚，充分暴露前囟，依照大鼠腦立位圖譜（坐標(biāo)為：AP＝－1.9mm，ML＝±1.4mm，DV＝－2.9mm），鉆開顱骨并以微量注射器自腦表面垂直進(jìn)針，向側(cè)腦室內(nèi)緩慢注入2μL配制好的5mg/mL預(yù)激活的Aβ1－42。注射時(shí)間不少于5min，注射后繼續(xù)留針2min以確保Aβ1－42溶液充分?jǐn)U散至腦室。部分需進(jìn)行海馬內(nèi)藥物注射的大鼠按照大鼠腦立位圖譜（坐標(biāo)為：AP＝－3.6mm，ML＝±2.0mm，DV＝－2.8mm）顱骨打孔并置入微量注射導(dǎo)管，以牙科水泥封閉固定。所有步驟均無(wú)菌操作，術(shù)后大鼠連續(xù)6d腹腔注射青霉素防止感染。模型組注射等量生理鹽水代替Aβ1－42，假手術(shù)組不進(jìn)行注射，其余操作均與造模組相同。

1.3 分組 實(shí)驗(yàn)共分3部分進(jìn)行。第一部分為姜黃素急性給藥，大鼠隨機(jī)分為5組，每組12只：假手術(shù)組、模型組、AD模型＋急性姜黃素50、100、300mg/kg組（僅在行為學(xué)實(shí)驗(yàn)前30min腹腔注射1次相應(yīng)劑量姜黃素）。

第二部分為姜黃素慢性給藥，大鼠隨機(jī)分為5組，每組12只：假手術(shù)組、模型組、AD模型＋慢性姜黃素50、100、300mg/kg組（連續(xù)給藥6d，每天腹腔注射1次相應(yīng)劑量姜黃素，第6天最后1次注射30min后進(jìn)行各項(xiàng)行為測(cè)試）。

第三部分為海馬內(nèi)BDNF干預(yù)，大鼠隨機(jī)分為5組，每組12只：假手術(shù)組、模型組、AD模型＋慢性姜黃素（100mg/kg）組、AD模型＋BDNF組、AD模型＋慢性姜黃素（100mg/kg）＋海馬內(nèi)注射shBDNF慢病毒組（注射姜黃素同時(shí)海馬內(nèi)微量注射每側(cè)1.0 μg BDNF蛋白，并設(shè)對(duì)照組，即每側(cè)注射約2.0×105單位shBDNF慢病毒顆?；虻润w積生理鹽水作為對(duì)照，注射體積為1.0μL每側(cè)；注射時(shí)使用10μL規(guī)格的微量進(jìn)樣器，將針頭插進(jìn)微量注射導(dǎo)管緩慢進(jìn)行注射，注射時(shí)間不少于5min。

實(shí)驗(yàn)期間大鼠自由飲食，室溫22～25℃，每日12h/12h循環(huán)光照。

1.4 曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn) 曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)箱體為黑色正方形（100cm ×100cm×60cm），頂部敞開。大鼠置于曠場(chǎng)中央并自由探索60min，由視頻追蹤軟件記錄并分析其總活動(dòng)距離。

1.5 Y迷宮實(shí)驗(yàn) Y迷宮為黑色的3個(gè)塑料長(zhǎng)臂組成，每個(gè)臂之間相隔120°角。每個(gè)臂長(zhǎng)30cm，寬10cm，高25cm。實(shí)驗(yàn)室中等強(qiáng)度光照，實(shí)驗(yàn)開始時(shí)，大鼠置于Y迷宮中心并自由探索5min，Anymaze視頻追蹤軟件（美國(guó)Stoelting公司）記錄并分析各臂的進(jìn)入順序、進(jìn)入次數(shù)及進(jìn)入時(shí)間。根據(jù)TYPLT等［5］的描述，大鼠進(jìn)行1次不重復(fù)探索完3個(gè)臂為1次“自主改變行為”，其占各臂總進(jìn)入次數(shù)的百分比反映了工作記憶的強(qiáng)度。

1.6 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn) Morris水迷宮直徑150cm，高60cm，室溫及水溫均保持在（22±2）℃。整個(gè)迷宮劃分為等面積的4個(gè)扇形象限，每個(gè)象限附近設(shè)有1個(gè)特征顯著的標(biāo)識(shí)物。在2號(hào)象限內(nèi)放有1個(gè)10cm ×10cm大小的透明平臺(tái)，平臺(tái)頂部低于水面1.0cm。平臺(tái)僅在訓(xùn)練期放置于迷宮中，測(cè)試期則取出平臺(tái)。

各組大鼠分別于術(shù)后進(jìn)行Morris水迷宮訓(xùn)練，每天上下午各訓(xùn)練1次，連續(xù)5d。訓(xùn)練時(shí)固定1個(gè)入水點(diǎn)，將大鼠面向池壁放入水中，觀察并記錄大鼠平均游泳速度、尋找并爬上平臺(tái)的路線及所需時(shí)間（潛伏期）。如果大鼠在120s內(nèi)未找到平臺(tái)，需將其引導(dǎo)至平臺(tái)并停留10s。于第6天進(jìn)行空間定位航行測(cè)試（navigation probe－task），測(cè)試期間移除平臺(tái)，大鼠自由探索120s并記錄大鼠游至原平臺(tái)所在位置的次數(shù)、所需時(shí)間及2號(hào)象限的游泳距離和時(shí)間。數(shù)據(jù)采集和處理由視頻追蹤軟件自動(dòng)監(jiān)視處理完成。

1.7 Western blot檢測(cè)BDNF表達(dá) 大鼠斷頭處死，冰上剝離大腦并切取海馬組織，經(jīng)預(yù)冷RIPA組織裂解液（含磷酸酶抑制劑及蛋白酶抑制劑）提取蛋白。在100g/L SDS－PAGE凝膠中電泳，半干法轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，TBST室溫封閉1h，分別加入BDNF、抗GAPDH抗體（抗體稀釋比例均為1∶1 000），4℃孵育過(guò)夜。TBST洗膜后再用相應(yīng)的二抗室溫孵育1h。洗膜后化學(xué)發(fā)光，凝膠圖像處理系統(tǒng)照相并分析目標(biāo)帶的灰度值。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用統(tǒng)計(jì)軟件包GraphPad Prism 5.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，實(shí)驗(yàn)結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。各組之間用單因素方差分析或重復(fù)測(cè)量的雙因素方差分析，結(jié)合Dunnet’s多重檢驗(yàn)（設(shè)定AD模型＋鹽水組為對(duì)照），進(jìn)行數(shù)據(jù)的處理和比較。以P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 姜黃素急性治療對(duì)AD模型大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的作用 姜黃素急性治療各劑量組大鼠進(jìn)行曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果進(jìn)行雙因素方差分析表明，急性治療對(duì)各組大鼠總活動(dòng)距離無(wú)顯著影響（治療：F4，210＝1.403，P＝0.234；時(shí)間：F5，210＝22.16，P＜0.000 1），各組大鼠活動(dòng)能力均無(wú)差異（圖1A）。大鼠在曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)束1h后進(jìn)行Y迷宮測(cè)試結(jié)果（圖1B）顯示，模型組自主改變行為顯著低于假手術(shù)組（P＜0.000 1），表明AD模型大鼠工作記憶能力明顯受損。而50、100、300 mg/kg急性姜黃素組大鼠的自主改變行為與模型組相比無(wú)顯著差異（分別為P＝0.341、P＝0.411和P＝0.427），表明急性姜黃素未能改善大鼠工作記憶能力。

大鼠單獨(dú)進(jìn)行水迷宮訓(xùn)練及測(cè)試時(shí)，在實(shí)驗(yàn)開始后的前5d不注射任何藥物，進(jìn)行Morris水迷宮訓(xùn)練。訓(xùn)練結(jié)果（圖1C）顯示，隨著訓(xùn)練次數(shù)增多，大鼠水迷宮游泳潛伏期均呈現(xiàn)降低趨勢(shì)（時(shí)間：F4，190＝4.216，P＜0.01），而模型組大鼠潛伏期則普遍高于假手術(shù)對(duì)照組（Aβ1－42：F1，190＝19.80，P＜0.000 1）。在probe測(cè)試前大鼠急性腹腔注射姜黃素的結(jié)果（圖1D）顯示，模型組與假手術(shù)組相比，在2號(hào)象限內(nèi)的停留時(shí)間百分比顯著降低（P＜0.000 1），表明AD模型大鼠空間參考記憶明顯受損。而50、100、300mg/kg急性姜黃素組大鼠在2號(hào)象限內(nèi)的停留時(shí)間與模型組相比無(wú)顯著差異（分別為P＝0.341、P＝0.411和P＝0.427），說(shuō)明50、100、300mg/kg急性姜黃素治療對(duì)AD模型大鼠空間參考記憶能力沒(méi)有顯著作用。

2.2 姜黃素慢性治療對(duì)AD模型大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的作用 姜黃素慢性治療實(shí)驗(yàn)中，在連續(xù)6d腹腔注射姜黃素后進(jìn)行曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果（圖2A）顯示，慢性姜黃素對(duì)大鼠總活動(dòng)距離無(wú)顯著影響（給藥：F4，210＝1.637，P＝0.421；時(shí)間：F5，210＝19.31，P＜0.000 1）。Y迷宮測(cè)試結(jié)果（圖2B）顯示，50mg/kg慢性姜黃素組大鼠自主改變行為與模型組相比無(wú)顯著改變P＝0.097），然而100、300mg/kg慢性姜黃素組大鼠的自主改變行為比模型組顯著增高（分別為P＜0.05和P＜0.000 1），表明100和300mg/kg慢性姜黃素治療改善了大鼠工作記憶能力。

在水迷宮訓(xùn)練及測(cè)試實(shí)驗(yàn)期間，連續(xù)6d腹腔注射姜黃素并進(jìn)行訓(xùn)練。結(jié)果（圖2C）顯示，100、300 mg/kg慢性姜黃素組大鼠潛伏期下降顯著（時(shí)間：F4，295＝4.824，P＜0.01）。Probe測(cè)試大鼠典型游泳軌跡（圖2D）顯示，50mg/kg姜黃素組與模型組大鼠在2號(hào)象限內(nèi)的停留時(shí)間無(wú)差異（P＝0.518），而100、300mg/kg慢性姜黃素組大鼠在平臺(tái)象限內(nèi)的游泳時(shí)間顯著高于模型組（分別為P＜0.000 1和P＜0.01），說(shuō)明100mg/kg以上劑量的姜黃素慢性治療能顯著改善AD模型大鼠空間參考記憶能力。

圖1 姜黃素急性給藥后AD模型大鼠學(xué)習(xí)記憶實(shí)驗(yàn)中的行為變化Fig.1Behavioral changes in the learning and memory tests in AD model rats after acute curcumin injection

圖2 姜黃素慢性給藥后AD模型大鼠學(xué)習(xí)記憶實(shí)驗(yàn)中的行為變化Fig.2Behavioral changes in the learning and memory tests in AD model rats after chronic curcumin injection

2.3 姜黃素慢性治療對(duì)海馬內(nèi)BDNF表達(dá)的影響大鼠在連續(xù)6d腹腔注射姜黃素后斷頭處死，檢測(cè)海馬內(nèi)BDNF表達(dá)變化，結(jié)果（圖3）進(jìn)行單因素方差分析顯示，姜黃素對(duì)海馬BDNF表達(dá)有顯著影響（F4，35＝12.445，P＜0.000 1）。多重檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)50mg/kg姜黃素組BDNF表達(dá)與模型組無(wú)差異（P＝0.768），而100、300mg/kg姜黃素組的海馬BDNF表達(dá)則比模型組表達(dá)水平顯著增高（分別為P＜0.05、P＜0.000 1）。

2.4 姜黃素慢性治療及海馬內(nèi)BDNF對(duì)AD模型大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響 為研究姜黃素慢性治療是否通過(guò)影響海馬內(nèi)BDNF表達(dá)繼而調(diào)控AD進(jìn)展，采用注射BDNF蛋白和shBDNF慢病毒顆粒兩種方法，分別上調(diào)/下調(diào)海馬內(nèi)BDNF水平。訓(xùn)練期結(jié)果（圖4A）顯示各藥物處理均未對(duì)大鼠游泳速度造成影響（藥物因素：F4，167＝0.169 1，P＝0.927；時(shí)間因素：F4，167＝0.103 4，P＝0.969 7），表明大鼠運(yùn)動(dòng)能力正常。100mg/kg姜黃素慢性組和海馬BDNF注射組大鼠的潛伏期下降顯著（時(shí)間：F4，295＝5.813，P＜0.01；圖4B），而海馬內(nèi)注射BDNF－shRNA慢病毒組潛伏期與模型組相比無(wú)差異，表明完全消除了慢性姜黃素治療的記憶改善作用。Probe測(cè)試中AD模型＋慢性姜黃素＋shBDNF組大鼠在2號(hào)象限內(nèi)的游泳時(shí)間與模型組無(wú)差異（P＝0.657），而AD模型＋BDNF組、AD模型＋100mg/kg姜黃素組、假手術(shù)組大鼠的停留時(shí)間比模型組顯著增高（P值分別＜0.01、＜0.05、＜0.000 1，圖4C），說(shuō)明海馬內(nèi)BDNF可能介導(dǎo)了慢性姜黃素治療對(duì)記憶能力的改善作用。此外，各組大鼠平臺(tái)穿越次數(shù)也有顯著改變（F4，35＝12.813，P＜0.05；圖4D）。

圖3 姜黃素慢性治療對(duì)海馬內(nèi)BDNF表達(dá)的影響Fig.3Effects of chronic curcumin injection on hippocampal BDNF expression

圖4 姜黃素慢性治療及海馬內(nèi)注射BDNF對(duì)AD模型大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響Fig.4Effects of chronic curcumin and hippocampal BDNF protein injection on the learning and memory abilities of the AD model rats

3 討論

大量在體及體外相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，Aβ在AD病理發(fā)生發(fā)展過(guò)程中具有重要作用。AD患者腦內(nèi)Aβ水平增高與其認(rèn)知能力的降低有顯著關(guān)聯(lián)［6－7］。向嚙齒類動(dòng)物側(cè)腦室內(nèi)直接注射Aβ1－42可以引起明顯記憶缺陷，從而模擬出AD患者的認(rèn)知能力減弱，因此，腦室內(nèi)注射Aβ成為一種重要的AD動(dòng)物模型建立手段［8］。本研究在大鼠腦室內(nèi)注射Aβ1－42后，在運(yùn)動(dòng)能力未受影響的情況下表現(xiàn)出訓(xùn)練潛伏期長(zhǎng)，在原平臺(tái)象限內(nèi)的時(shí)間顯著減少，說(shuō)明腦室內(nèi)注射Aβ1－42使大鼠空間認(rèn)知和記憶能力嚴(yán)重受損，較成功建立了大鼠AD模型。

有研究報(bào)道，姜黃素具有改善老齡相關(guān)的認(rèn)知能力降低、癡呆和其他情緒障礙的功效，并且介導(dǎo)了突觸內(nèi)多種蛋白的合成［9－10］。HOPPE等［11］在最近的研究中報(bào)道，Aβ對(duì)海馬腦切片中的神經(jīng)元突觸傳導(dǎo)造成損害，而姜黃素則可通過(guò)調(diào)控突觸內(nèi)的蛋白活性如突觸素Ⅰ（synapsinⅠ）和鈣離子/鈣調(diào)蛋白依賴的蛋白激酶Ⅱ（Ca2＋/calmodulin－dependent protein kinaseⅡ，CaMKⅡ）的激活，消除Aβ的有害效果。AD模型動(dòng)物通常會(huì)表現(xiàn)出明顯的海馬依賴的短時(shí)和長(zhǎng)時(shí)空間學(xué)習(xí)和記憶能力缺陷［12－13］。Y迷宮是經(jīng)典的工作記憶（working memory）檢測(cè)手段之一，其自主改變行為反映了大鼠的短時(shí)記憶能力，而Morris水迷宮則是最廣泛使用的檢測(cè)長(zhǎng)時(shí)空間參考記憶的實(shí)驗(yàn)方法［8］。因此，本研究分別采用了Y迷宮和Morris水迷宮檢測(cè)姜黃素急性、慢性治療對(duì)大鼠認(rèn)知能力的影響。結(jié)果表明，急性治療和50mg/kg姜黃素慢性治療對(duì)AD大鼠短時(shí)記憶和長(zhǎng)時(shí)記憶均無(wú)顯著作用，而100～300mg/kg姜黃素慢性治療可以顯著逆轉(zhuǎn)Aβ所造成的學(xué)習(xí)記憶損害。此外，各組大鼠在曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)中的結(jié)果均無(wú)差別，進(jìn)一步說(shuō)明大鼠迷宮實(shí)驗(yàn)中的記憶能力改變確實(shí)為藥物作用的結(jié)果，與其活動(dòng)能力無(wú)關(guān)。

血清中的BDNF被認(rèn)為反映了大腦中BDNF的總體水平，研究發(fā)現(xiàn)AD患者血清中BDNF比同齡對(duì)照人群顯著減少，而高水平的血清BDNF則與AD病情嚴(yán)重程度成負(fù)相關(guān)［14］。對(duì)AD患者腦組織檢查發(fā)現(xiàn)海馬內(nèi)BDNF出現(xiàn)顯著降低，這一結(jié)果在動(dòng)物模型中也被證實(shí)［15－16］。本研究結(jié)果與此一致，即Aβ抑制了海馬內(nèi)BDNF表達(dá)，而姜黃素（100～300mg/kg）慢性治療可以提高海馬內(nèi)BDNF的表達(dá)，這提示姜黃素可能是通過(guò)調(diào)控BDNF來(lái)發(fā)揮其記憶改善作用。

隨后，通過(guò)海馬內(nèi)微量注射BDNF蛋白來(lái)增強(qiáng)BDNF信號(hào)通路，海馬內(nèi)微量注射BDNF shRNA來(lái)特異性阻斷BDNF基因表達(dá)，研究BDNF在姜黃素治療效應(yīng)中的作用。結(jié)果顯示，各組大鼠平均游泳速度沒(méi)有差別，說(shuō)明大鼠活動(dòng)能力正常。水迷宮結(jié)果發(fā)現(xiàn)注射BDNF蛋白完全模擬了姜黃素對(duì)長(zhǎng)時(shí)程記憶的改善作用，而阻斷BDNF表達(dá)后姜黃素的治療作用也被阻斷，這提示BDNF可能是姜黃素的必要調(diào)控分子。有證據(jù)表明BDNF可通過(guò)結(jié)合于其受體TrkB，繼而激活諸多下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，例如CaMKII、ERK等，調(diào)控海馬神經(jīng)元突觸可塑性并加強(qiáng)學(xué)習(xí)記憶能力。無(wú)論是在AD患者［17］還是AD動(dòng)物模型中［18］，均有報(bào)道腦內(nèi)ERK的mRNA和蛋白表達(dá)異常。TONG等［19］曾報(bào)導(dǎo)Aβ能抑制許多BDNF誘導(dǎo)的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子的激活，例如，Aβ通過(guò)Ras－MAPK/ERK或PI3K/Akt通路抑制cAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白（cAMP response element binding protein，CREB）的激活，而這些通路都可被BDNFTrkB所調(diào)控。據(jù)此推測(cè)，姜黃素可能是通過(guò)上調(diào)BDNF的表達(dá)，繼而激活BDNF－TrkB－ERK－CREB信號(hào)通路，最終對(duì)Aβ誘導(dǎo)的AD大鼠學(xué)習(xí)記憶能力起到改善作用。這還需要更多實(shí)驗(yàn)證據(jù)進(jìn)行驗(yàn)證。

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Therapeutic effect of curcumin and hippocampal brain－derived neurotrophic factor on a rat model of Alzheimer’s disease

GENG Xiao－ying，ZHANG Ai－xiang，QIAN Jian，GUO Gang，ZHANG Lu－lu，WANG Jing
（Guangren Hospital Affiliated to Xi’an Jiaotong University；the Fourth Hospital of Xi’an，Xi’an 710004，China）

Objective To study the effect of curcumin on the learning and memory ability in a rat model of Alzheimer’s disease（AD）.Methods AD rat model was prepared using intraventricular injection of Aβ1－42.Curcumin was acutely（single injection before the behavioral tests）or chronically（injected for 6 consecutive days）injected intraperitoneally at doses of 50，100 or 300 mg/kg.Brain－derived neurotrophic factor（BDNF）protein （1μg/side）or BDNF shRNA（2×105units/side）was infused into the hippocampus.The behavioral changes in Y－maze，open field test and Morris water maze and the expression of BDNF in the hippocampus were analyzed.Results Acute treatment with curcumin had no significant effects on the spontaneous alteration，locomotor activity or water maze latency of AD rats.AD rats treated chronically with curcumin（300 mg/kg）showed significant elevation in the spontaneous alternation（P＜0.000 1）in Y－maze and memory ability in the water maze test（P＜0.05）compared with those in the saline group.Chronic treatment with 100 and 300 mg/kg of curcumin induced an increased level of BDNF in the hippocampus as compared with the saline controls（P＜0.05 and＜0.000 1）.Intrahippocampal injection of BDNF significantly decreased the escape latency of AD rats in the water maze（F4，295＝5.813，P＜0.01）.Rats chronically injected with curcumin combined with shBDNF showed no difference in the swimming time inⅡquadrant as compared with saline controls（P＝0.657）.However，rats in100 mg/kgcurcumin group，BDNF group and sham group had significantly increased swimming time than the saline controls（P＜0.05，P＜0.05 and P＜0.000 1，respectively）.Conclusion Curcumin may activate the downstream signaling pathways by upregulating the expression of BDNF and ultimately contribute to the improvement of learning and memory in AD rats.

Alzheimer’s disease；curcumin；hippocampus；brain－derived neurotrophic factor；Y maze；Morris water maze；open field test；shRNA

R741

A

10.7652/jdyxb201602026

2015－03－03

2015－04－21

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（No.31100900）Supported by the National Natural Science Foundation of China（No.31100900）

耿曉英.E－mail：gengxiaoying001@163.com

優(yōu)先出版：http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1399.R.20160202.1529.018.html（2016－02－02）