馬文鵬，裴芳霞，任海偉，張丙云（.新疆農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，新疆昌吉8300；.蘭州理工大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅蘭州730050）

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雙酶復(fù)合水解酒糟制備可發(fā)酵糖的工藝研究

馬文鵬1，裴芳霞2，任海偉2，張丙云2
（1.新疆農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，新疆昌吉831100；2.蘭州理工大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅蘭州730050）

摘要：為將酒糟中纖維素和半纖維素組分轉(zhuǎn)化成可發(fā)酵糖，從酶添加量、酶解時(shí)間和固液比等角度分別研究了纖維素酶和木聚糖酶的酶解參數(shù)，并考察2種酶不同添加方式對(duì)酒糟酶解糖化得率的影響，篩選適宜的酶解條件。結(jié)果表明，與纖維素酶或半纖維素酶單一酶水解相比，2種酶復(fù)合酶解效果較好，且2種酶同時(shí)添加的酶解得率最高。2種酶復(fù)合同步酶解的最優(yōu)參數(shù)為纖維素酶添加量5 %，木聚糖酶添加量4 %，酶解時(shí)間為48 h，固液比為1∶20（m/v)，該條件下的還原糖和木糖得率分別為30.75 %和23.59 %。

關(guān)鍵詞：酒糟；纖維素酶；木聚糖酶；酶解糖化；還原糖；木糖

中國(guó)是白酒生產(chǎn)和消費(fèi)大國(guó)，白酒釀造會(huì)產(chǎn)生大量的廢棄酒糟，每生產(chǎn)1 t白酒會(huì)產(chǎn)生鮮酒糟2～4 t。由于鮮酒糟酸度大，水分含量較高，極易腐敗變質(zhì)，若不能有效轉(zhuǎn)化利用，會(huì)造成嚴(yán)重的廠區(qū)環(huán)境污染和資源浪費(fèi)[1]。目前，酒糟除了直接用作家畜飼料外，還可用于生產(chǎn)有機(jī)肥、蛋白飼料、食用菌、燃料棒、活性炭和食醋等[2-3]。

酒糟是一種來(lái)源廣泛的木質(zhì)纖維生物質(zhì)，富含纖維素、半纖維素和木質(zhì)素等組分，通過(guò)酶解可以轉(zhuǎn)化成葡萄糖和木糖等可發(fā)酵糖，進(jìn)而作為生產(chǎn)乙醇、乳酸等生化產(chǎn)品的微生物發(fā)酵碳源。近年來(lái)，酶法水解木質(zhì)纖維生物質(zhì)因其降解徹底、無(wú)環(huán)境污染、副產(chǎn)物少、條件溫和等優(yōu)點(diǎn)而備受關(guān)注。歐陽(yáng)嘉等[4]發(fā)現(xiàn)，纖維素酶Celluclast 1.5 L在酶用量10 FPIU/g、底物濃度50 g/L的條件下水解低聚木糖生產(chǎn)廢渣48 h后，酶解得率為74.9 %，葡萄糖得率為35.1 %。朱新娜[5]研究發(fā)現(xiàn)，纖維素酶在酶濃度90 FPU/g、底物濃度47.2 g/L、溫度50℃、pH4.8條件下作用棉花秸稈72 h后，還原糖產(chǎn)量為486.9 mg/g。余先純等[6]研究發(fā)現(xiàn)，在溫度51.15℃、反應(yīng)時(shí)間42.08 h、纖維素酶用量28.75 U/g的優(yōu)化條件下，玉米秸稈糖化得率能達(dá)到42.15 %。師靜等[7]研究表明，巨菌草在纖維素酶用量44.8 U/g、底物濃度10 g/L、pH5.0和45℃條件下酶解60 h后，酶解液中還原糖含量為95.51 mg/g。上述研究主要集中于纖維素組分的專(zhuān)一性降解，但由于商業(yè)化的纖維素酶主要包括外切β-1,4-葡聚糖酶、內(nèi)切β-1,4-葡聚糖酶和β-1,4-葡萄糖苷酶3個(gè)組分[8]，使酶解后降解產(chǎn)物多以葡萄糖為主。

隨著乙醇發(fā)酵基因工程菌的構(gòu)建與研究，木糖等單糖也能被基因重組酵母等代謝利用[9]，因此，為進(jìn)一步將除纖維素之外的半纖維素組分糖化降解為木糖等單糖，多酶復(fù)配進(jìn)行酶解糖化的方法愈發(fā)受到重視。趙超等[10]采用纖維素酶、β-葡萄糖苷酶和木聚糖酶等組成的復(fù)合酶系對(duì)預(yù)處理后的玉米芯進(jìn)行酶解，糖化得率為85.0 %。Zhao等[11]研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)酶添加量為10 FPU/g時(shí)，用纖維素酶和β-葡萄糖苷酶同步糖化甘蔗渣24 h，其多糖轉(zhuǎn)化率高達(dá)80 %。Zhao等[12]進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，甘蔗渣經(jīng)NaOH-過(guò)氧乙酸預(yù)處理脫除木質(zhì)素后，添加15 FPU/g的纖維素酶酶解120 h，還原糖得率升至92.04 %。Tabka 等[13]以麥秸為原料，發(fā)現(xiàn)10 U/g纖維素酶和3 U/g木聚糖酶是酶解呈協(xié)同作用的臨界點(diǎn)。但是對(duì)多酶復(fù)配用于白酒糟糖化降解的報(bào)道還很少，國(guó)內(nèi)僅有劉高梅[14]、陳喆[15-16]、劉躍紅[17]進(jìn)行了相關(guān)研究。

本研究以白酒糟為原料，從酶添加量、酶解時(shí)間和固液比等角度，在考察纖維素酶和木聚糖酶酶解參數(shù)的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步研究2種酶不同添加復(fù)配方式對(duì)酒糟酶解糖化得率的影響，從而篩選得到最佳的酶解方式，為酒糟酶解糖化的轉(zhuǎn)化利用奠定理論依據(jù)。

1　材料與方法

1. 1材料與設(shè)備

白酒糟：甘肅金徽酒股份有限公司，自然風(fēng)干粉碎過(guò)40目篩，蛋白質(zhì)16.42 %、纖維素33.17 %、半纖維素21.86 %。

試劑與耗材：纖維素酶（濾紙酶活10萬(wàn)U/g，最適溫度50℃，最適pH4.8)和木聚糖酶（濾紙酶活5萬(wàn)U/g，最適溫度50℃，最適pH4.8)，購(gòu)自寧夏和氏璧生物技術(shù)有限公司；3,5-二硝基水楊酸等試劑均為分析純。

儀器設(shè)備：HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋，國(guó)華電器有限公司；TDL-5-A離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠；GZX-9240 MBE數(shù)顯鼓風(fēng)干燥箱，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；Cary 50紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，上海精密科學(xué)儀器有限公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1理化指標(biāo)的測(cè)定

蛋白質(zhì)含量測(cè)定參照GB 5009.5—2010；纖維素和半纖維素含量測(cè)定參照國(guó)標(biāo)GB/T 20805—2006、GB/T 20806—2006、GB/T 23881—2009；淀粉含量測(cè)定參照GB/T 5009.9—2008；還原糖的測(cè)定采用DNS法；木糖的測(cè)定采用間苯三酚比色法[18]。

1.2.2酒糟的酶解實(shí)驗(yàn)方案篩選

為確定纖維素酶和木聚糖酶適宜的酶添加量、酶解時(shí)間和料液比，首先進(jìn)行了單因素實(shí)驗(yàn)，分別考察酶添加量（1 %、2 %、3 %、3 %、4 %、5 %和6 %，w/w)，酶解時(shí)間（12 h、24 h、36 h、48 h、60 h和72 h），料液比(1∶5、1∶10、1∶15、1∶20和1∶25，w/v）對(duì)酶解效果的影響。

具體方法：準(zhǔn)確稱(chēng)取5.0 g酒糟置于一定體積的pH4.8乙酸-乙酸鈉緩沖液，按照實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的酶添加量分別加入一定量的纖維素酶和木聚糖酶，混勻后置于50℃振蕩培養(yǎng)箱中進(jìn)行酶解實(shí)驗(yàn)。酶解結(jié)束后，沸水浴滅酶10 min，快速冷卻后于3900 r/min下離心20 min，取上清液定容至100 mL，分別測(cè)定其還原糖和木糖濃度，計(jì)算糖得率。

在此基礎(chǔ)上，按照表1的酶添加順序進(jìn)行雙酶組合酶解方案的篩選，酶添加量和時(shí)間等參數(shù)與單因素實(shí)驗(yàn)一致，分步酶解過(guò)程中酶1水解結(jié)束、滅酶后方可再加入酶2繼續(xù)作用。組合酶解結(jié)束后測(cè)定其還原糖濃度和木糖濃度，計(jì)算糖得率。

還原糖得率（X，%）和木糖得率（Y，%）的計(jì)算公式如下：

式中：v——酶解液的體積，L；

c1、c2——酶解液中的還原糖和木糖濃度，g/L；

m——酒糟質(zhì)量，g；

w1、w2——酒糟中的纖維素和半纖維素質(zhì)量分?jǐn)?shù)，%。

表1 酶添加順序組合方案設(shè)計(jì)

2　結(jié)果與分析

2.1單一酶酶解參數(shù)的篩選

2.1.1酶添加量對(duì)酶解效果的影響

由圖1可知，不同的纖維素酶用量對(duì)酶解效率有較大影響，當(dāng)纖維素酶用量從1 %增加到5 %，酶解24 h后，酶解液中還原糖得率從16.87 %增加到21.46 %，進(jìn)一步提高纖維素酶用量，酶解得率的上升幅度趨于平緩。從盡可能降低纖維素酶成本的經(jīng)濟(jì)角度考慮，纖維素酶的適宜添加量為5 %。而木聚糖酶在添加量為4 %，酶解時(shí)間36 h時(shí)，木糖得率達(dá)到最大值17.46 %。這是由于在酶解初期，纖維素酶的酶切位點(diǎn)主要作用于無(wú)定形區(qū)，酶與無(wú)定形區(qū)的纖維分子結(jié)合產(chǎn)生催化酶解作用，酶解速度快。而隨著酶解反應(yīng)的進(jìn)行，酶難以滲入纖維分子結(jié)晶區(qū)的致密結(jié)構(gòu)，造成酶解速率降低，而酶解產(chǎn)物也會(huì)對(duì)酶解反應(yīng)產(chǎn)生抑制作用[19]。

圖1 酶添加量和時(shí)間對(duì)酶解得率的影響

2.1.2固液比對(duì)酶解效果的影響

由圖2可知，纖維素酶和木聚糖酶在酶解過(guò)程中，隨著固液比的減小，還原糖和木糖得率均呈逐漸上升的趨勢(shì)，且在1∶20時(shí)達(dá)到最大值，分別為23.29 %和12.37 %。當(dāng)繼續(xù)增加液體比例，得率反而下降。這是由于料液比較高時(shí)，體系濃度和黏度值較高，酶解反應(yīng)的傳熱傳質(zhì)進(jìn)程易受高黏度影響，而液體體積的增加可以降低體系黏度，增加傳質(zhì)過(guò)程，同時(shí)增大了酶和底物的接觸機(jī)率，但液體過(guò)量又會(huì)對(duì)酶解作用造成“稀釋”，降低酶與底物的作用機(jī)率，故選擇1∶20為最佳固液比。

圖2 固液比對(duì)還原糖和木糖得率的影響

2.2酶添加方式對(duì)酶解得率的影響

由圖3可知，纖維素酶單獨(dú)作用對(duì)酒糟的酶解效果優(yōu)于木聚糖酶，但與單一酶水解相比，雙酶分步或同步添加的組合法均能有效提高酶解得率，且同步添加纖維素酶及木聚糖酶的還原糖和木糖得率最大，分別為30.75 %和23.59 %。一方面是因?yàn)槟揪厶敲竷?yōu)先吸附到半纖維素和細(xì)小纖維的表面，半纖維素和細(xì)小纖維被酶解溶出。同時(shí)，木聚糖酶破壞了半纖維素對(duì)纖維素酶的吸附作用，使纖維素酶的酶解效率提高[20]。另一方面，木聚糖酶具有水解半纖維素和纖維素的雙重活性，對(duì)纖維素表現(xiàn)出很大的親和性，可以酶解半纖維素和細(xì)小纖維生成還原糖[21]，故纖維素酶和木聚糖酶同步復(fù)合酶解效果最好。

3　結(jié)論

采用纖維素酶和木聚糖酶對(duì)酒糟進(jìn)行復(fù)合酶解，通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)和酶組合實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，纖維素酶和木聚糖酶雙酶同步酶解效果最好，篩選后的纖維素酶和木聚糖酶添加量分別為5 %和4 %，二者同步酶解時(shí)間為48 h，固液比為1∶20（m/v)，該條件下，還原糖和木糖得率分別為30.75 %和23.59 %。

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The Preparation of Fermentable Sugar through the Hydrolysis of Distillers Grains by Two Enzymes

MAWenpeng1，PEI Fangxia2，REN Haiwei2and ZHANG Bingyun2
(1.Xinjiang Agricultural Vocational Technology College, Changji, Xinjiang 831100; 2. School of Life Science and Engineering, Lanzhou University of Technology, Lanzhou,Gansu 730050, China)

Abstract:Cellulose and hemi-cellulose of distillers grains could be converted into fermentable sugar in practice. In this study, the hydrolysis parameters of cellulase and xylanase were investigated respectively from the angle of enzyme adding level, hydrolysis time, and solid-liquid ratio etc. Besides, the effects of different adding patterns of two enzymes on the yield of fermentable sugar were investigated. The results suggested that, the combined use of cellulase and xylanase was superior to single use of celluase/xylanase in the hydrolysis of distillers grains, and simultaneous addition of the two enzymes could achieve the highest yield of fermentable sugar. The best hydrolysis parameters were summed up as follows: the adding level of cellulase was 5 %, the adding level of xylanase was 4 %, hydrolysis time was 48 h, and solid-liquid ratio was 1∶20 (m/v). Under above conditions, the yield rates of reducing sugar and xylose were 30.75 % and 23.59 % respectively.

Key words:distillers grains; cellulase; xylanase; hydrolysis & saccharification; reducing sugar;xylose

通訊作者：任海偉（1983-），男，副教授，研究方向?yàn)槭称房茖W(xué)，E-mail：rhw52571119@163.com。

作者簡(jiǎn)介：馬文鵬（1983-），男，回族，副教授，碩士，研究方向?yàn)槭称房茖W(xué)。

收稿日期：2015-11-16

基金項(xiàng)目：新疆維吾爾自治區(qū)高校科研計(jì)劃項(xiàng)目青年教師科研培育基金（XJEDU2014S086）；甘肅省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（148RJZA015）。

DOI：10.13746/j.njkj.2015438

中圖分類(lèi)號(hào)：TS262.3；TS261.4；TS261.9

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1001-9286（2016）04-0089-04

優(yōu)先數(shù)字出版時(shí)間：2016-01-22；地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.1051.TS.20160122.1015.007.html。