顧崇梅

酒泉市藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心，甘肅 酒泉 735000

高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定傷科膠囊中3種皂苷的含量

顧崇梅

酒泉市藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心，甘肅 酒泉 735000

目的：建立高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定傷科膠囊中3種皂苷的含量。方法：采用高效液相色譜法，色譜柱為ODS柱(4.6 mm×250 mm，5 μm) ，流動(dòng)相A為乙腈，B為0.05%磷酸溶液，梯度洗脫，條件為：0～18 min (20～35∶80～65) ，18～23 min(35～20∶65～80)，25 min (20∶80)；流速為1.0 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)203 nm。結(jié)果：三七皂苷R1進(jìn)樣量在0.7758～24.8256 μg（r=0.9997）、人參皂苷Rg1進(jìn)樣量在0.852 0～27.264 0 μg（r=0.999 8）、人參皂苷Rb1進(jìn)樣量在0.6432～20.5824 μg（r=為0.999 9）范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，方法重復(fù)性及回收率均符合要求。結(jié)論：本法操作簡(jiǎn)便快捷、結(jié)果準(zhǔn)確可靠，重復(fù)性好，適用于傷科膠囊中3種皂苷含量的測(cè)定。

高效液相色譜法；三七皂苷R1；人參皂苷Rg1；人參皂苷Rb1；傷科膠囊

傷科膠囊是由三七、冰片、乳香、土鱉蟲(chóng)、自然銅等中藥材組成，方中三七行瘀消腫、止血定痛；冰片、乳香等辛散走竄，善行氣血，止疼痛；土鱉蟲(chóng)、自然銅等擅長(zhǎng)治療折傷，續(xù)筋骨。全方君臣佐使配伍合理，共奏活血散瘀、消腫止痛、續(xù)筋接骨之功效。該藥品臨床應(yīng)用廣泛，療效確切，但由于原質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)缺少含量測(cè)定項(xiàng)，不能有效控制藥品質(zhì)量，為進(jìn)一步完善本品質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)，本研究采用高效液相色譜儀對(duì)處方中君藥三七的主要成分人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1，三七皂苷R1進(jìn)行定量分析。

1 材料

1.1 儀器Waters e2695高效液相色譜儀(Waters2998 PDF檢測(cè)器，Empowers色譜工作站)；MS205DU電子分析天平(METTLER TOLEDO)；KH-250DB型超聲波清洗器（昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司）。

1.2 試藥傷科膠囊樣品由酒泉市中醫(yī)院提供(批號(hào)：20140927、20141205、20150312)。人參皂苷Rg1(批號(hào)：110703-201529)、人參皂苷Rb1(批號(hào)：110704-201424)、三七皂苷R1(批號(hào)：110745-201318)均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院，乙腈為色譜純(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司提供，批號(hào)：20150414)，水為重蒸水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 對(duì)照品溶液的制備精密稱取經(jīng)五氧化二磷減壓干燥處理12小時(shí)以上的對(duì)照品三七皂苷R112.93 mg、人參皂苷Rg114.20 mg和人參皂苷Rb110.72 mg，分別加甲醇溶解并稀釋至5 mL容量瓶中，搖勻，即得濃度分別為：三七皂苷R12.586 mg/mL、人參皂苷Rg12.84 mg/mL和人參皂苷Rb12.144 mg/mL的對(duì)照品儲(chǔ)備液。精密量取三七皂苷R1、人參皂苷Rg1和人參皂苷Rb1對(duì)照品儲(chǔ)備液各3.0 mL，加入10 mL的容量瓶中，同時(shí)加入甲醇溶液至刻度，即得濃度分別為：三七皂苷R10.775 8 mg/mL、人參皂苷Rg10.852 mg/mL和人參皂苷 Rb10.6432 mg/mL的混合對(duì)照品溶液。

2.2 供試品溶液的制備取本品20粒的內(nèi)容物，混勻，研細(xì)，精密稱取約10粒，至100 mL的具塞錐形瓶中，精密加甲醇50 mL，稱定重量，放置2小時(shí)，置80℃水浴微沸2小時(shí)，放冷，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，即得。

2.3 陰性對(duì)照溶液的制備按處方比例稱取缺三七的藥材，按制劑工藝制備陰性樣品，并按“2.2”項(xiàng)下方法處理，即得。

2.4 色譜條件色譜柱：Thermo ODS-2HYPERSIL色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相A為乙腈；B為0.05%磷酸溶液；梯度洗脫，條件為：0～18分鐘(20～35∶80～65)，18～23分鐘(35～20∶65～80)，25分鐘(20∶80)；流速為1.0 mL/min，柱溫 25℃，檢測(cè)波長(zhǎng)203 nm，進(jìn)樣量為10 μL；理論板數(shù)按三七皂苷R1峰計(jì)算應(yīng)不低于5 000，3種皂苷分離度均大于1.5。結(jié)果表明在此色譜條件下，3種對(duì)照品能達(dá)到良好的分離效果，且供試品中其他組分陰性對(duì)照在對(duì)照品位置均無(wú)干擾，色譜圖見(jiàn)圖1。

圖1 傷科膠囊HPLC色譜圖

2.5 線性關(guān)系分別精密量取混合對(duì)照品液1、2、4、8、16、32 μL，按“2.4”項(xiàng)下的色譜條件測(cè)定，記錄色譜圖及峰面積積分值，以峰面積積分值(Y)為縱坐標(biāo)，以進(jìn)樣量(X)為橫坐標(biāo)，分別進(jìn)行線性回歸，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 3種皂苷線性關(guān)系考察結(jié)果

2.6 精密度實(shí)驗(yàn)精密吸取對(duì)照品溶液20 μL，按“2.4”項(xiàng)下的色譜條件連續(xù)進(jìn)樣5次，記錄峰面積積分值，計(jì)算，結(jié)果人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1和三七皂苷R1，RSD分別為1.08%、1.23和0.97%，表明儀器精密度良好，符合藥典要求。

2.7 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)精密量取供試品溶液20 μL，按“2.4”項(xiàng)下的色譜條件分別在0、2、4、8、10、12小時(shí)進(jìn)行測(cè)定，記錄色譜圖及峰面積積分值，結(jié)果三七皂苷R1RSD=1.64%、人參皂苷Rg1RSD=1.04%、人參皂苷Rb1RSD=1.46%，表明供試品溶液在12小時(shí)內(nèi)比較穩(wěn)定。

2.8 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)取同一批傷科膠囊(批號(hào)：20140927)，按“2.2”方法制備，依法測(cè)定，記錄峰面積，用外標(biāo)法計(jì)算供試品的平均含量分別為：含三七皂苷R1為3.21 mg/g，RSD=2.12%；人參皂苷Rg1為5.83 mg/g，RSD=1.84%；人參皂苷Rb1為7.90 mg/g，RSD=1.67%，結(jié)果表明此方法重復(fù)性好。

2.9 加樣回收率實(shí)驗(yàn)取已知含量的傷科膠囊(批號(hào)：20140927)內(nèi)容物6份，每份約1.5 g，精密稱定，按“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.4”項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 傷科膠囊中三七的3種皂苷加樣回收率實(shí)驗(yàn)

2.10 樣品含量測(cè)定分別稱取傷科膠囊3批(批號(hào)：20140927、20141205、20150312)各2份，按“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，精密量取供試品溶液及對(duì)照品溶液各10 μL，按“2.4”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，記錄色譜圖，計(jì)算三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1的含量，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 樣品測(cè)定結(jié)果 mg/g

3 討論

3.1 提取條件的選擇在樣品的提取中選用了

70%乙醇回流提取法［1］、水飽和的正丁醇提取和氫氧化鈉萃取法［2］以及甲醇加熱提取法［3］，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中水飽和的正丁醇提取和氫氧化鈉萃取法雖然提取的樣品純度略高，但萃取時(shí)溶劑易乳化，不易操作，70%乙醇回流提取法和甲醇加熱提取法效率相當(dāng)，實(shí)驗(yàn)最后采用了操作簡(jiǎn)便的甲醇加熱提取法。

3.2 流動(dòng)相的選擇在使用流動(dòng)相時(shí)選用了兩種系列的流動(dòng)相條件，一是流動(dòng)相A為乙腈；B為水［1］；梯度洗脫，條件為：0～12 min(19～81)，12～60 min(19～36∶81～64)：二是流動(dòng)相A為乙腈；B為0.05%磷酸溶液［4］；梯度洗脫，條件為：0～18 min (20～35∶80～65)，18～23 min(35～20∶65～80)，25 min (20∶80)。兩種方法比較，第二種方法雜質(zhì)色譜峰較少，時(shí)間較短，而且三七皂苷R1和人參皂苷Rg1的分離效果較好，故選用第二種方法。

3.3 供試品三種皂甙含量的確定《中華人民共和國(guó)藥典》一部規(guī)定，三七藥材中含人參皂苷Rg1(C42H72014)、人參皂苷Rb1(C54H92023)及三七皂苷R1(C47H80018)的總量不得少于5.0%，根據(jù)傷科膠囊中三七藥材的處方量和每粒膠囊的裝量計(jì)算出該制劑每粒含人參皂苷Rg1(C42H72014)、人參皂苷Rb1(C54H92023)及三七皂苷R1(C47H80018)的總量應(yīng)不得少于4.0 mg。

［1］ 國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典：一部［M］.北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社,2010：11-12.

［2］ 唐云，倪瑋燁，束志凌.HPLC法測(cè)定散結(jié)鎮(zhèn)痛膠囊中三七皂苷R1、人參皂苷Rg1及人參皂苷Rb1的含量［J］.藥學(xué)進(jìn)展，2009，33(7)：328-329.

［3］ 單玲玲，劉善新，王平，等.三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1提取工藝研究［J］.中華中醫(yī)藥雜志，2013，28(8)：2411-2413.

［4］ 陳亮，錢一帆.HPLC測(cè)定田七痛經(jīng)膠囊中人參皂苷Rg1、Rb1及三七皂苷R1含量［J］.中國(guó)中醫(yī)藥信息雜志，2015，22(10)：77-80.

Simultaneous Determination of the Contents of Three Kinds of Saponins in ShangKe Capsules by High Performance Liquid Chromatography

GU Chongmei
Jiuquan drug inspection and Testing Center,Jiuquan 735000,China

A

1004-6852(2016)11-0027-03

2016-02-05

顧崇梅(1973—)，女，副主任藥師。研究方向：藥品質(zhì)量控制。