劉 娟，鐘相根，鄧秀蘭，李 配，齊明月，趙娜妹

北京中醫(yī)藥大學基礎醫(yī)學院，北京 100029

COPD模型大鼠氣道黏液高分泌機制及健脾益肺化痰方干預作用*

劉 娟，鐘相根，鄧秀蘭△，李 配，齊明月，趙娜妹

北京中醫(yī)藥大學基礎醫(yī)學院，北京 100029

目的：觀察健脾益肺化痰系列方對慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)模型大鼠的防治作用及其機制。方法：采用單純香煙煙熏法建立COPD大鼠模型。將60只Wistar雄性大鼠隨機分為正常組、模型組、健脾益肺化痰方組、健脾益肺方組、化痰方組和羧甲司坦組，每組10只。健脾益肺化痰方組、健脾益肺方組、化痰方組和羧甲司坦組大鼠分別給予相應的藥物灌胃治療，正常組和模型組灌胃等體積純凈水。用酶聯(lián)免疫測定法(ELISA)檢測各組大鼠肺泡灌洗液(BALF)中黏蛋白5AC(MUC5AC)、黏蛋白5B(MUC5B)、白細胞介素1β(IL-1β)、環(huán)氧化酶2(COX2)、轉化生長因子α(TGF-α)、前列腺素E2(PGE2)的含量。結果：與正常組比較，模型組大鼠肺泡灌洗液(BALF)中MUC5AC、MUC5B、IL-1β、COX2、TGF-α、PGE2含量顯著升高(P＜0.05)。與模型組比較，健脾益肺化痰組、健脾益肺組、化痰組大鼠肺泡灌洗液(BALF)中MUC5AC、MUC5B、IL-1β、COX2、TGF-α、PGE2含量均降低(P＜0.05)。結論：健脾益肺化痰系列方中以標本兼治的健脾益肺化痰方尤為突出，能降低COPD模型大鼠肺泡灌洗液中MUC5AC、MUC5B、IL-1β、COX2、TGF-α、PGE2的含量，抑制氣道黏液高分泌傳導通路，使氣道結構重塑，改善氣道通氣狀況，最終改善COPD模型大鼠肺功能。

COPD；氣道黏液高分泌；標本兼治；健脾益肺化痰系列方

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)是以氣道不完全可逆性氣流受限為特征的慢性疾病，與肺部對香煙煙霧等有害氣體或有害顆粒的異常炎癥反應有關。COPD以氣道、肺實質和肺血管的慢性炎癥為特征，同時氣道黏液高分泌是其重要的病理生理特征，可加重氣道阻塞，并致下呼吸道感染難以控制，已被認為是影響COPD病死率和預后的獨立危險因素［1］。氣管、支氣管杯狀細胞化生是黏蛋白的主要來源，也是黏液過度分泌的結構基礎。研究顯示［2］，黏蛋白5AC(MUC5AC)、黏蛋白C5B(MUC5B)是構成黏液的主要低聚物黏蛋白，在COPD患者中表達明顯增加，MUC5AC存在于氣道上皮杯狀細胞，MUC5B存在于黏膜下腺體。研究表明［3-4］參與COPD對黏液分泌有作用的細胞因子和炎性介質有IL-1β、IL-4、IL-6、IL-8、IL-9、IL-13、IL-17，以 及TNF-α、EGF、前列腺素、白三烯等，且它們之間存在協(xié)同效應。目前認為杯狀細胞化生及MUC5AC基因表達的關鍵介導環(huán)節(jié)涉及白細胞介素-1β(IL-1β)和表皮生長因子受體(EGFR)信號傳導通路。

本課題在“黏液高分泌”及“痰”相關理論的指導下，采用單純香煙煙熏建立COPD大鼠模型，以健脾益肺化痰系列方藥進行干預治療，觀察發(fā)現健脾益肺化痰系列方可顯著改善COPD大鼠肺功能、血氣及肺組織病理狀況［5］，本研究擬從氣道黏液高分泌角度，進一步探討健脾益肺化痰系列方防治COPD的作用機制及針對“痰”進一步辨證論治的差異性。

1 材料與方法

1.1 實驗動物SPF級健康雄性Wistar大鼠60只，體質量(180±20)g，鼠齡10～12周［購于北京維通利華實驗動物公司，動物許可證號：SCXK(京) 2012-0001]，于北京中醫(yī)藥大學實驗動物中心適應性飼養(yǎng)7天。

1.2 實驗用藥實驗用中藥材全部購自北京同仁堂醫(yī)藥藥材有限公司，經北京中醫(yī)藥大學藥用植物教研室鑒定。生藥劑量比例按原著換算，依照人單位體質量生藥量求得大鼠單位體質量生藥量，擴大10倍。各組藥物分別以純凈水煎煮30分鐘，提取2次。再合并煎液，并將所得藥液用雙層紗布過濾，水浴加熱蒸發(fā)濃縮，貯于冰箱中備用。羧甲司坦組予羧甲司坦(北京曙光藥業(yè)股份有限公司生產，批號：H11021036，規(guī)格：250 mg×12片×2板/盒)500 mg/kg灌胃，劑量參考文獻［6］。

1.2.1 健脾益肺化痰方 由四君子湯、玉屏風散、二陳湯加桔梗化裁方組成。藥物組成：黨參15 g，茯苓15 g，白術10 g，炙甘草5 g，黃芪15 g，防風6 g，半夏10 g，陳皮10 g，桔梗10 g。

1.2.2 健脾益肺方 四君子湯合玉屏風散組成。藥物組成：黨參15 g，茯苓15 g，白術10 g，炙甘草5 g，黃芪15 g，防風6 g。

1.2.3 化痰方 即二陳湯加桔?；梅?，藥物組成：半夏10 g，陳皮10 g，茯苓15 g，炙甘草5 g，桔梗10 g。

1.3 儀器與試劑大前門牌香煙(烤煙型，焦油量12 mg，煙氣煙堿量0.9 mg，煙氣一氧化碳含量14 mg)；自制動物熏煙箱(60 cm×50 cm×40 cm)；自動切片機、自動包埋機；溫控儀鼓風干燥箱(上海躍進醫(yī)療器械廠)；高精度可調節(jié)移液器，槍頭(白槍頭、黃槍頭、藍槍頭)；吸水紙(自備)；電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海益恒實驗儀器有限公司生產)；TECAN全波長酶標儀(Thermo生產，Multiskan MK3)；離心機(Tomy Seiko生產)；試管及離心管，容量瓶，蒸餾水。

1.4 實驗方法

1.4.1 實驗分組及給藥 將60只Wistar大鼠隨機分為正常組、模型組、健脾益肺化痰方組、健脾益肺方組、化痰方組、羧甲司坦組，共6組，每組10只。模型組于吸煙造模12周后每天給予等體積純凈水灌胃，各給藥組于吸煙第13周起于每日上午吸煙前半小時給予相應藥物灌胃；正常組每天給予等體積純凈水灌胃。

1.4.2 COPD大鼠模型建立 參考文獻［7］方法，采用單純香煙煙熏法復制COPD大鼠模型。模型組及各給藥組大鼠放入自制被動吸煙玻璃熏箱，箱頂留有通氣孔，燃燒大前門牌香煙，由三通管導入煙霧。1次熏煙燃燒大前門香煙12支，每支香煙約產生煙霧1 L，煙霧濃度約5%，持續(xù)0.5小時，每日吸煙2次，上下午各1次，每周5天，連續(xù)16周。1.4.3 實驗取材 實驗大鼠在末次給藥后，禁食12小時，4%戊巴比妥鈉腹腔麻醉。隨機挑選等量的各實驗組動物，行正中切口，氣管插管，進行生理鹽水支氣管肺泡灌洗3次，5 mL/次。待注入生理鹽水后，輕輕按摩肺組織30秒，回收支氣管肺泡灌洗液(BALF)，記錄回收的灌洗液量(保證回收率＞80%)。將回收的BALF離心(3 000 r/min，4℃) 10分鐘，用于ELISA檢測。

1.4.4 酶聯(lián)免疫測定法(ELISA) 檢測大鼠肺泡灌洗液中MUC5AC、MUC5B、IL-1β、COX2、TGF-α、PGE2的含量。

1.4.4.1 試劑盒組成 酶標板：12條×8孔；標準品：2瓶(凍干品)；生物素標記抗體：1×120 μL/瓶；辣根過氧化物酶標記親和素：1×120 μL/瓶；生物素標記抗體稀釋液：1×15 mL/瓶；辣根過氧化物酶標記親和素稀釋液：1×15 mL/瓶；樣本稀釋液：1× 50 mL/瓶；濃洗滌液：1×20 mL/瓶；底物溶液：1× 10 mL/瓶；終止液：1×10 mL/瓶；板貼：4張；密封袋：1個。

1.4.4.2 操作步驟 1)將各種試劑移至室溫(18～25℃)平衡至少30分鐘，按各自試劑配制方法配制試劑以備用；2)加樣：分別設標準品孔、待測樣本孔。每孔分別加標準品或待測樣本100 μL，輕輕晃動混勻，覆上板貼，37℃溫育2小時；3)棄去液體，甩干，不用洗滌；4)每孔加生物素標記抗體工作液100 μL，覆上新的板貼，37℃溫育1小時；5)棄去孔內液體，甩干，洗板3次。每次浸泡2分鐘，200 μL/孔，甩干；6)每孔加辣根過氧化物酶標記親和素工作液100 μL，覆上新的板貼，37℃溫育1小時；7)棄去孔內液體，甩干，洗板5次。每次浸泡2分鐘，200 μL/孔，甩干；8)依序每孔加底物溶液90 μL，37℃避光顯色15～30分鐘；9)依序每孔加終止液50 μL，終止反應；10)在反應終止后5分鐘內用酶標儀在450 nm波長依序測量各孔的光密度。

1.5 統(tǒng)計學方法數據采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件分析，計量資料以(±s)表示，多組樣本間均數的比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

模型組大鼠肺泡灌洗液中MUC5AC、MUC5B、IL-1β、COX2、TGF-α、PGE2的含量均顯著升高，與正常組比較差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。健脾益肺化痰組、健脾益肺組、化痰組大鼠肺泡灌洗液中MUC5AC、MUC5B、IL-1β、COX2、TGF-α、PGE2的含量均降低，與模型組比較差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。3組中藥給藥組之間比較，健脾益肺化痰組(標本兼治組)COPD模型大鼠炎癥因子IL-1β、TGF-α的含量下降較明顯，化痰組(治標組)次之，健脾益肺組(治本組)COPD模型大鼠IL-1β、TGF-α含量下降最低。健脾益肺化痰組(標本兼治組)COPD模型大鼠炎癥因子COX2、PGE2的含量下降較明顯，健脾益肺組(治本組)次之，化痰組(治標組)COPD模型大鼠COX2、PGE2含量下降最低，見表1—2。

表1 各組大鼠肺泡灌洗液中MUC5AC、MUC5B的含量(±s) pg/mL

表1 各組大鼠肺泡灌洗液中MUC5AC、MUC5B的含量(±s) pg/mL

注：*表示與正常組比較，P＜0.05；#表示與模型組比較，P＜0.05；☆表示與健脾益肺組比較，P＜0.05；△表示與化痰組比較，P＜0.05。

組別 只數 MUC5AC MUC5B正常組 10 142.2±23.8 87.8±49.5模型組 10 782.1±93.2*1972.9±551.2*健脾益肺化痰組 10 402.5±55.6#△760.4±111.9#△健脾益肺組 10 495.1±83.1#1905.4±453.0#化痰組 10 629.8±48.6#☆1919.7±286.8#☆羧甲司坦組 10 556.5±86.9 1445.9±255.4

表2 各組大鼠肺泡灌洗液中IL-1β、COX2、TGF-α、PGE2的含量(±s) pg/mL

表2 各組大鼠肺泡灌洗液中IL-1β、COX2、TGF-α、PGE2的含量(±s) pg/mL

注：*表示與正常組比較，P＜0.05；#表示與模型組比較，P＜0.05；☆表示與健脾益肺組比較，P＜0.05；△表示與化痰組比較，P＜0.05。

組別 只數 IL-1β COX2TGF-α PGE2正常組 10 65.53±7.36 82.79±13.50 260.15±51.05 5.38±3.95模型組 10 164.43±34.97*128.36±10.45*397.21±102.84*28.76±4.38*健脾益肺化痰組 10 96.30±15.26#96.69±18.04#205.56±43.48#△☆11.33±5.34#健脾益肺組 10 152.73±24.79#△115.83±25.66#356.24±68.22 12.16±2.54#化痰組 10 101.05±23.51#117.48±26.97 341.30±64.60 12.21±3.75#羧甲司坦組 10 117.55±8.99 95.09±36.00 242.70±70.07 10.04±6.58

3 討論

杯狀細胞化生和黏液高分泌過度分泌是COPD氣道慢性炎癥的重要病理改變，過度分泌的黏液潴留于氣道，加重了已經狹窄氣道的阻塞，加速了肺功能的下降進程，容易導致氣道內感染的發(fā)生，病情惡化。COPD氣道黏液高分泌的結構基礎是杯狀細胞化生/增生，而IL-13、IL-1β、TNF-α信號通路參與刺激誘導了杯狀細胞的化生/增生。此外，EGFR信號轉導通路是諸多刺激因子誘導MUC5AC基因表達的共同通路，多種刺激物可通過NE/TNF-α/TGF-α/EGFR等信號途徑，上調MUC5AC基因轉錄和MUC5AC生成［8］。IL-1β激活COX2/PGE2；經MAPK激活細胞外信號調節(jié)激酶1/2(extracellular signal-regulated kinasel1/2，ERK1/2)和p38-MAPK途徑，激活環(huán)磷酸腺苷(cAMP)反應元件結合蛋白(CREB)，從而誘導MUC5AC基因的表達［9 ］。

COPD屬中醫(yī)學“肺脹”“咳嗽”“喘證”“痰飲”范疇，在對其病證病機的認識中，始終重視痰的作用［10-13］；在治療過程中，也積極化痰，大多以益氣健脾化痰法為原則［14］。中醫(yī)學認為“脾為生痰之源，肺為貯痰之器”，肺脾氣虛，津液不化，痰濁潴留，伏痰形成；外邪引動伏痰，引發(fā)COPD。結合現代醫(yī)學與中醫(yī)學對本病進行較為全面的研究［15］，認識到現代醫(yī)學的“氣道黏液高分泌”就是中醫(yī)學的“痰”。相關臨床研究［16-18］表明，健脾益肺化痰系列方治療穩(wěn)定期COPD患者，具有減輕臨床癥狀，減少急性發(fā)作頻率，改善呼吸功能等作用。藥理研究［19］表明，健脾益肺化痰系列方具有增強機體免疫功能、抗變態(tài)反應、抗菌抗病毒、抗纖維化、增強腎上腺皮質功能等功效。臨床上通過抑制黏液高分泌或化痰，可以有效緩解COPD的發(fā)?。?0-21］。本實驗選用健脾益肺化痰方及其拆方，從氣道黏液高分泌角度探討其作用機制，并著重對比分析“健脾益肺化痰標本兼治”的干預作用。

綜上所述，健脾益肺化痰系列方中以標本兼治的健脾益肺化痰方尤為突出，可以通過抑制COPD氣道上皮杯狀細胞化生及黏液高分泌信號轉導，從而抑制氣道黏液高分泌，使氣道結構重塑，改善氣道通氣狀況，最終改善COPD模型大鼠肺功能。這可能是健脾益肺化痰標本兼治法改善COPD大鼠肺功能的效應機制之一，可為臨床使用健脾益肺化痰系列方防治COPD提供了部分實驗依據。

［1］ Mac Nee W.Pathogenesis of chronic obstructive pulmonary disease［J］.Proc Am Thorac Soc，2005，2(4)：258-266.

［2］ Kirkham S，Sheehan JK，Knight D，et al.Heterogeneity of airways mucus：variations in the amounts and glycoforms of the major oligomeric mucins MUC5AC and MUC5B［J］.Biochem J，2002，361(3)：537-546.

［3］ Takeyama K，Jung B，Shim JJ，et al.Activation of epidermal growth factor receptors is responsible for mucin synthesis induced by cigarette smoke［J］.Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol，2001，280(1)：165-172.

［4］ 鐘相根，李宇航，祝小惠.慢性阻塞性肺疾病氣道黏液高分泌機制及中醫(yī)藥干預作用［J］.中華中醫(yī)藥雜志，2011，26(8)：1686-1689.

［5］ 李配，鄧秀蘭，鐘相根，等.健脾益肺化痰方對慢性阻塞性肺疾病模型大鼠肺組織病理的影響［J］.中華中醫(yī)藥學刊，2015，33(6)：1330-1332.

［6］ 孫麗.羧甲司坦對慢性被動吸煙大鼠氣道細菌負荷的影響及相關機制的研究［D］.沈陽：中國醫(yī)科大學，2010.

［7］ 李配.基于標本兼治“化痰”的健脾益肺化痰方對COPD大鼠氣道黏液高分泌的干預作用及其差異研究［D］.北京：北京中醫(yī)藥大學，2015.

［8］ Kim ST，Ye MK，Shin SH.Effects of Asian and dust on mucin gene expression and activation of nasal polyp epithelial cells［J］.Am J Rhinol Allergy，2011，25(5)：303-306.

［9］ Cosio MG，Saetta M，Agusti A.Immunologic aspects of chronic obstructive pulmonary disease［J］.N Engl J Med，2009，360(23)：2445-2454.

［10］王振偉，楊佩蘭，沈麗，等.百部養(yǎng)肺煎膏治療COPD穩(wěn)定期患者的臨床研究［J］.西部中醫(yī)藥，2015，28(5)：56-59.

［11］王慧卿，李躍進.痰熱清注射液治療慢性阻塞性肺病急性加重期42例［J］.河北中醫(yī)，2008，30(8)：870.

［12］李竹英，郅扶旻，劉文波.益氣健脾化痰法對COPD穩(wěn)定期患者肺功能及免疫功能的影響［J］.中醫(yī)藥信息，2014(1)：51-53.

［13］王蘭娣，潘文.沙美特羅替卡松聯(lián)合益氣養(yǎng)陰合劑治療輕癥及緩解期COPD 36例［J］.西部中醫(yī)藥，2012，25(5)：76-77.

［14］孫朔.健脾化痰法治療慢性阻塞性肺疾病的臨床觀察［J］.中國中醫(yī)基礎醫(yī)學雜志，2010，16(2)：143-144.

［15］鐘相根，祝小惠，鄭子安，等.論“痰”在慢性阻塞性肺疾病發(fā)病及治療中的重要性［J］.中華中醫(yī)藥雜志，2012，27(12)：3159-3161.

［16］吳蕾，林琳，許銀姬，等.健脾益肺Ⅱ號治療慢性阻塞性肺疾病穩(wěn)定期178例臨床研究［J］.中醫(yī)雜志，2011，52(17)：1465-1468.

［17］Li SY，Li JS，Wang MH，et al.Effects of comprehensive therapy based on traditional Chinese medicine patterns in stable chronic obstructive pulmonary disease：a four-center，open label，randomized，controlled study［J］.BMC Complement Alternat Med，2012，12(1)：1-11.

［18］楊珺超，王真，樓雅芳，等.益氣健脾顆粒劑聯(lián)合西藥治療慢性阻塞性肺疾病穩(wěn)定期肺脾氣虛型60例臨床觀察［J］.中醫(yī)雜志，2013，54(22)：1933-1936.

［19］王本祥.現代中藥藥理學［M］.天津：天津科學技術出版社，1997：1144-1147.

［20］楊峰，敖素華.清熱化痰法對氣道黏液高分泌大鼠氣道炎癥影響機制［J］.遼寧中醫(yī)藥大學學報，2014，16(5)：21-24.

［21］王勝，熊玲玲，任薇，等.益氣健脾方對慢性阻塞性肺疾病模型大鼠氣道炎癥和氣道黏液高分泌的影響［J］.中國中西醫(yī)結合雜志，2015，35(8)：993-999.

Airway Mucus Hypersecretion Mechanism in Rat with COPD Model and Intervention Process of Tonifying the Spleen and Nourishing the Lung as well as Eliminating Phlegm

LIU Juan,ZHONG Xianggen,DENG Xiulan△,LI Pei,QI Mingyue,ZHAO Namei College of Basic Medical Sciences,Beijing University of Chinese Medicine,Beijing 100029,China

A

1004-6852(2016)11-0011-04

2016-01-14

國家自然科學基金資助項目(編號81173314，81473666)；國家中醫(yī)藥管理局中醫(yī)藥重點學科基本科研項目(編號2013-ZDXKKF-03)。

劉娟(1987—)，女，在讀碩士研究生。研究方向：呼吸系統(tǒng)疾病的中醫(yī)藥防治。

△通訊作者：鄧秀蘭(1963—)，女，碩士學位，副教授。研究方向：呼吸系統(tǒng)疾病的診治。