劉麗清，李美艷，王愛武△

1 山東中醫(yī)藥大學(xué)，山東 濟南 250000；2 山東大學(xué)附屬省立醫(yī)院；3 山東宏濟堂制藥集團有限公司

綿茵陳中綠原酸的提取工藝及純化工藝優(yōu)選

劉麗清1，2，李美艷3，王愛武3△

1 山東中醫(yī)藥大學(xué)，山東 濟南 250000；2 山東大學(xué)附屬省立醫(yī)院；3 山東宏濟堂制藥集團有限公司

目的：優(yōu)選綿茵陳的提取工藝及純化工藝。方法：以綠原酸含量為指標，采用高效液相色譜法測定綠原酸含量，以加水量、提取時間、提取次數(shù)為考察因素，采用正交實驗法優(yōu)選綿茵陳的提取工藝；采用不同乙醇濃度沉淀綿茵陳水提取液中綠原酸的含量。結(jié)果：最佳提取工藝為用12倍量水提取3次，1 h/次；最佳純化工藝為70%乙醇沉淀綿茵陳水提液中綠原酸。結(jié)論：最佳提取工藝對綿茵陳中綠原酸有較高提取率，水提醇沉純化綿茵陳中綠原酸的含量采用70%乙醇。

綿茵陳；綠原酸；提取工藝；純化工藝

綿茵陳為菊科植物濱蒿Artemisia scoparia Waldst.et Kit.或茵陳蒿Artemisiacapillaris Thunb.的干燥地上部分，是臨床常用中藥之一。其味苦、辛，微寒，歸脾、胃、肝、膽經(jīng)，具有清利濕熱、利膽退黃之功效［1］，臨床主要應(yīng)用于治療黃疸、膽囊炎、肝內(nèi)膽汁淤積癥、陰道炎、濕熱型濕疹等病癥［2-3］。綠原酸是其主要活性成分之一。本研究采用傳統(tǒng)水提取法優(yōu)化綿茵陳的提取工藝，水提醇沉法優(yōu)化其純化工藝［4-5］，以期為綿茵陳中綠原酸的獲得提供一種最經(jīng)濟、穩(wěn)定的提取純化工藝。

1 儀器與試藥

1.2 試藥試驗中茵陳藥材購于山東省立醫(yī)院藥劑科中草藥房，經(jīng)本院藥劑科王愛武主任藥師鑒定，符合2010年版《中國藥典》相關(guān)項下要求；綠原酸對照品購于中國食品藥品檢定研究院(批號：110753-201415)；乙腈、磷酸為色譜純；水為重蒸水；其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 含量測定

2.1.1 色譜條件 按2010年版《中國藥典》茵陳藥材項下方法，HPLC測定茵陳藥材及各樣品中綠原酸的含量。色譜柱為Agilent Eclipse XDB-C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相為乙睛-0.05%磷酸溶液(10：90)；流速1 mL/min；檢測波長327 nm；柱溫35 ℃；進樣量20 μL。

2.1.2 線性關(guān)系考察 精密稱取綠原酸對照品適量，置棕色瓶中，用50%甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，配成濃度為0.44 mg/mL的儲備液。分別精密吸取儲備液溶液0.1、0.3、0.5、0.7、0.9 mL置10 mL容量瓶中，加50%甲醇稀釋至刻度，搖勻，按“2.1.1”項下色譜條件進樣，記錄峰面積；以對照品峰面積為縱坐標，對照品質(zhì)量濃度為橫坐標，得回歸方程Y=22 290 X+17 724(r=0.999 3)，結(jié)果表明綠原酸在4.4～39.6 μg/mL范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

2.2 提取工藝優(yōu)選

2.2.1 正交實驗設(shè)計 根據(jù)綿茵陳中主要成分綠原酸的化學(xué)性質(zhì)，選用經(jīng)濟的水提取。對提取工藝條件進行正交篩選實驗，篩選條件包括加水量、提取時間、提取次數(shù)，以綠原酸含量為測定指標采用L9(34)正交實驗，見表1。

表1 綿茵陳正交實驗因素水平

2.2.2 樣品的制備 根據(jù)表1正交實驗因素水平設(shè)計實驗，準確稱取茵陳藥材9份，每份50 g，水提取，提取液合并，濾過，濾液減壓濃縮，得干膏，研細備用。

優(yōu)點：優(yōu)秀的顯示效果及操控布局，配備光學(xué)防抖系統(tǒng)的等效28-140mm鏡頭。缺點：較為一般的畫質(zhì)表現(xiàn)。

2.2.3 供試品的制備 取干膏粉末約0.3 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇補足減失的重量，搖勻，離心，精密量取上清液5 mL，置25 mL棕色瓶中，加50%甲醇至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。按照“2.1.1”項下色譜條件進樣測定，見表2—3。

表2 綿茵陳優(yōu)選正交實驗安排

表3 綿茵陳正交實驗方差分析

由直觀分析可知，3個因素對提取工藝的影響順序為C＞A＞B。方差分析結(jié)果表明C因素對提取工藝結(jié)果有顯著性影響，其他因素則無顯著性差異。綜合考慮確定最佳提取工藝為A3B1C3，即用12倍量水提取3次，1 h/次。

2.2.4 驗證實驗 準確稱取茵陳藥材3份，每份50 g，按照上述優(yōu)選提取工藝進行3次驗證實驗，結(jié)果顯示驗證結(jié)果與實驗結(jié)果基本一致，見表4。

表4 綿茵陳提取驗證結(jié)果

2.3 純化工藝優(yōu)選

2.3.1 樣品制備 取茵陳2 500 g，加12倍量水提取3次，1 h/次，過濾，濾液濃縮至300 mL清膏，均分為5份，分別加入95%乙醇36.4、55.6、85.7、140、266.7 mL，使藥液含乙醇濃度分別為40%、50%、60%、70%、80%，靜置24小時，過濾，回收乙醇，減壓濃縮得干膏，研細備用。按照“2.2.3”項制備供試品溶液，按照“2.1.1”項下色譜條件進樣測定。

2.3.2 沉淀產(chǎn)物和干膏得率測定 取上述過濾所得沉淀，置干燥至恒重的蒸發(fā)皿中，于105℃干燥3小時至恒重后取出，置干燥器中冷卻30分鐘后稱重，40%、50%、60%、70%、80%乙醇沉淀物分別為32.84、45.27、55.27、64.18、68.66 mg/g生藥。取上述干膏適量，相當于原藥材10 g，按照沉淀產(chǎn)物測定方法計算干膏得率，結(jié)果見圖1、表5。

圖1 綿茵陳水提醇沉結(jié)果

表5 綿茵陳水提醇沉結(jié)果

由圖1、表5可知，水提醇沉結(jié)果隨著乙醇濃度的增加，綠原酸轉(zhuǎn)移率也增加，但到80%乙醇時和70%乙醇基本趨于平衡，考慮實際經(jīng)濟因素，選擇70%乙醇沉淀為精制茵陳綠原酸的有效方法。2.3.3 驗證實驗 準確稱取茵陳藥材3份，每份50 g，按照上述優(yōu)選提取工藝和純化工藝進行3次驗證實驗，結(jié)果顯示驗證結(jié)果與實驗結(jié)果基本一致，見表6。

表6 綿茵陳提取驗證結(jié)果

3 討論

綠原酸是含有羥基和鄰苯二酚的有機酸，可溶于水、甲醇、乙醇、乙酸乙酯和丙酮等溶劑，為優(yōu)選最經(jīng)濟實用的提取純化工藝，本實驗采用水提取綿茵陳中綠原酸的含量，以醇沉法純化水提取液。結(jié)果表明水提醇沉法精制綿茵陳中綠原酸的效果較好。

通過正交實驗分析可知，影響綿茵陳綠原酸提取率因素的程度由大到小依次為：提取次數(shù)、加水量、提取時間。通過方差分析，實驗確定的水提取最佳工藝參數(shù)為：用12倍量水提取3次，1 h/次。通過不同乙醇濃度精制茵陳水提液中綠原酸的含量，最佳純化工藝為70%乙醇沉淀，綠原酸轉(zhuǎn)移率為78.94%。

［1］ 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：一部［M］.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：223-224.

［2］ 孫遠南，馮健.茵陳蒿的化學(xué)成分與藥理作用研究進展［J］.中國現(xiàn)代醫(yī)生，2011，49(21)：12-14.

［3］ 董巖，王新芳，崔長軍，等.茵陳蒿的化學(xué)成分和藥理作用研究進展［J］.時珍國醫(yī)國藥，2008，19(4)：874-876.

［4］ 徐建國，田呈瑞，胡青平，等.綿菌陳中綠原酸的提取工藝研究［J］.中國農(nóng)學(xué)通報，2007，23(9)：162-165.

［5］ 雷昌，夏新華，黃瑪莎，等.二種純化工藝對茵陳水提液的影響研究［J］.中成藥，2013，35(12)：2626-2630.

文后參考文獻著錄格式示例（一）

連續(xù)出版物（期刊，含外文期刊）

［序號］主要責任者（作者為3位以下全部著錄，3位以上著錄前3位，后加“，等”）．文獻題名［文獻類型標志］.刊名，年，卷（期）：起頁-止頁.

示例：

1）期刊分卷

［1］ 羅侃，羅暢，剡雄.從循證醫(yī)學(xué)與中醫(yī)辨證論治談中西醫(yī)結(jié)合的前景［J］.中國中西醫(yī)結(jié)合急救雜志，

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［2］ Guilbert TW，Norgan WJ，Zeiger RS，et al.Long-term inhaled corticosteroids in preschool

children at high risk for asthma［J］. N Engl J Med，2006，354（19）：1985-1997.

2）期刊不分卷

［3］ Turan I，Wredmark T，F(xiàn)ellander-Tsai L. Arthroscopic ankle arthrodesis in rheumatoid arthritis［J］.Clin Orthop，1995(320)：110-114.

3）期刊無卷和期

［4］ Browell DA，Lennard TW.Imunologic status of the cancer patients and the effects of blood transfusion on antitumor responses［J］.Curr Opin Gen Surg，1993：325-333.

Optimization of Extraction Process and Purification Process of Chlorogenic Acid from MianYinChen

LIU Liqing1,2,LI Meiyan3,WANG Aiwu3△
1 Shandong University of Traditional Chinese Medicine,Jinan 250000,China;
2 Provincial Hospital Affiliated to Shandong University;
3 Shandong HongJitang Pharmaceutical Group CO.LTD

A

1004-6852(2016)11-0018-03

2015-09-27

劉麗清(1989—)，女，在讀碩士研究生。研究方向：醫(yī)院新制劑開發(fā)及臨床藥學(xué)。

△通訊作者：王愛武(1966—)，女，主任藥師。研究方向：醫(yī)院新制劑開發(fā)及臨床藥學(xué)。