涂 成，黃 威，陳安磊，宋 歌，陳春蘭，王 衛(wèi)，謝小立

(1 中國科學院亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所，亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)過程重點實驗室，長沙 410125；2 中國科學院大學，北京 100049；3 中國科學院南京土壤研究所，南京 210008)

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測定土壤硝態(tài)氮的紫外分光光度法和鎘柱還原法比較①

涂 成1,2，黃 威1,2，陳安磊1*，宋 歌3，陳春蘭1，王 衛(wèi)1，謝小立1

(1 中國科學院亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所，亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)過程重點實驗室，長沙 410125；2 中國科學院大學，北京 100049；3 中國科學院南京土壤研究所，南京 210008)

摘 要：使用改進的紫外分光光度法(校正因素法)和基于鎘柱還原的流動注射分析法(鎘柱還原法)測定了中國10種不同類型土壤的含量，分析了兩種方法的差異性及其適用性。統(tǒng)計分析表明，改進紫外分光光度法與鎘柱還原法測定的結(jié)果具有極顯著的相關性，測定樣品的準確度介于89%～104%，具有可比性。在濃度適用上略有差異，對含量極低的土壤樣品，采用鎘柱還原法可提高精確度；對于含量高的土樣選用紫外法可提高測定精確度，測定結(jié)果變異性低于鎘柱還原法，且紫外法測定值都要高于鎘柱還原法。從儀器操作及校準角度來看，紫外法測定操作過程簡便，影響因子較少，對批量快速測定更為適用。

關鍵詞：紫外分光光度法；鎘柱還原法；流動注射分析儀；土壤硝態(tài)氮

1 材料與方法

1.1 供試土樣

從中國 10 個地區(qū)采集了 10 種土壤樣品，采樣點概況及供試土壤的基本性質(zhì)見表 1。土壤含量介于 1～100 mg/kg 之間。由于受樣品保存時間、水分含量、溫度高低等因素的影響，新鮮土壤不適合用作分析方法的比較研究材料，本實驗統(tǒng)一使用風干過 60 目篩的土樣進行測定。

1.2 儀器

紫外可見光分光光度計(UV2450)，光程為 1 cm的石英比色皿；流動注射分析儀(FIAstar 5000)。

1.3 測定方法

本文使用的測定方法為紫外分光光度法[8-9]和基于鎘柱還原的流動注射法。

表1　采樣點概況及供試土壤的基本理化性狀Table 1 Descriptions of sampling sites and properties of the selected soils

1.3.1 紫外分光光度法(以下簡稱為紫外法)波長選擇：Norman等[10]以及李酉開[11]都選用210 nm波長，在該波長工作范圍為N 0.05～1.5 mg/L，極大多數(shù)無機鹽類已無吸收，但本研究中變化范圍比較大，宋歌等[13]的研究表明該情況下選用220 nm測定比較合適，該波長下靈敏度雖有所降低，但工作范圍卻擴展為N 0.1～3.0 mg/L。因此，本研究選用220 nm波長。

操作步驟：稱取40.00 g土樣于250 ml聚乙烯瓶中，加入100 ml 1 mol/L KCl溶液，置于往復振蕩機中，(25±1)℃ 條件下以150 r/min速度振蕩1 h，懸液靜置3～5 min后，將上清液用慢速定量濾紙過濾于塑料瓶中待測。同時，向聚乙烯瓶中僅加入浸提液重復上述步驟作為空白，待測液應在當天測定完畢。加標回收實驗中，在浸提前將適量的標液加入，然后加浸提液振蕩提取，以后步驟相同。

測定浸提液在 220 nm 和 275 nm 處吸光度A220和 A275。按下式計算校正吸光度 A：

采用 Norman 等[10,12]的方法去除浸提液中的再測定處理后的溶液在 220 nm 和 275 nm處的吸光度，計算二者的比值，即為 f。本方法參照宋歌等[13]在 9 種不同類型土壤上測定得到的 2.2作為 f 值。建立 A 與 濃度之間的相關曲線后，就可算出浸提液中 濃度。本方法采用工作范圍為 0.1～5.0 mg/L 和 0.005～0.8 mg/L兩套定標標準。

1.3.2 基于鎘柱還原的流動注射法(以下簡稱為鎘柱還原法)儀器配置：NO2/NO3方法盒，540 nm 測量濾光片和 720 nm 參比濾光片，5000 3139 預裝還原鎘柱。

測定原理：包含亞硝酸鹽/硝酸鹽的樣品與緩沖溶液混合后經(jīng)過鎘柱，樣品中的硝酸根被鎘還原劑還原為亞硝酸根，原有的和從硝酸根還原得到的亞硝酸根與酸性的氨基苯磺酰胺(磺胺)溶液生成偶氮化合物，與萘胺鹽酸鹽進一步反應形成紅色含氮染料，在540 nm處進行測量。本方法所測試的氮為土壤浸出液中的硝酸鹽和亞硝酸鹽總和，但與硝酸鹽量相比本研究樣品中亞硝酸鹽極低，可忽略不計。

操作步驟：樣品前處理操作步驟同1.3.1，濾液上流動注射儀測定。為提高樣品低濃度時的測定精度，本方法采用工作范圍為0.1～5.0 mg/L 和 0.005～0.8 mg/L兩套定標標準，樣品圈分別為40 μl和400 μl。在樣圈變換過程中同時進行時間校正，防止讀數(shù)波峰延遲。

1.4 統(tǒng)計方法

使用 SAS8.1 對測定結(jié)果進行統(tǒng)計分析，其中不同方法測定結(jié)果的比較使用單因素方差分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 方法的檢出限和定量限比較

檢出限是指產(chǎn)生一個能可靠地被檢出的分析信號所需要的某元素的最低濃度或含量，而定量限是指樣品中被測物能被定量測定的最低值。對兩種方法的校準曲線進行統(tǒng)計，所有校準曲線線性擬合的判定系數(shù)均高于0.999 0。根據(jù)MacDougall等方法[14]和國際純粹與應用化學聯(lián)合會(IUPAC)的規(guī)定，采用空白測量(不少于20次)平均值加3倍標準差作為方法的檢出限，采用空白測量平均值加10倍標準差作為方法的定量限。本研究中采用工作范圍為0.1～5.0 mg/L和0.005～0.8 mg/L兩套定標標準。紫外分光光度法低標定標標準(0.005～0.8 mg/L)的檢出限為0.24 mg/kg，定量限為0.55 mg/kg，而鎘柱還原法的檢出限為0.18 mg/kg，定量限為0.38 mg/kg；高標定標標準(0.1～5.0 mg/L)中紫外分光光度法的檢出限為0.20 mg/kg，定量限的為0.44 mg/kg，而鎘柱還原法的檢出限為0.23 mg/kg，定量限為0.55 mg/kg?？梢娫诘蜐舛葧r，鎘柱還原法的精確度略高于紫外分光光度法，而高濃度測量時其精確度略低于紫外分光光度法。但鎘柱還原法在定標標準改變時，需要調(diào)整流動注射儀的樣品圈，如低濃度測定時，需要把樣品圈分別從40 μl換成400 μl，測高濃度時再換成40 μl的樣品圈，而紫外法可直接測定，不需要改變儀器配置。

2.2 測定均值比較

表2　兩種方法土壤硝態(tài)氮的測定結(jié)果(mg/kg)Table 2 Comparison between the two methods indetermination

表2　兩種方法土壤硝態(tài)氮的測定結(jié)果(mg/kg)Table 2 Comparison between the two methods indetermination

注：同列數(shù)據(jù)小寫字母不同表示兩種方法測定差異達到P＜0.05 顯著水平。

方法 　　項目土樣編號A 　B 　C 　D 　E 　F 　G 　H 　I 　J鎘柱法　均值 　8.12 b 　4.33 b 　32.23 b　 5.14 b　 9.68 b 　3.18 b　 46.11 a　 0.01 b 　11.82 a　 0.51 a標準差 　0.20 　0.13 　1.36 　0.27 　0.21 　0.15 　1.61 　0.02 　0.71 　0.04紫外法CV(%)　2.5 　3.1 　4.2 　5.2 　2.2 　4.6 　3.5 　138.4 　6.0 　7.8均值 　10.13 a 　5.74 a 　33.96 a　 5.44 a　 10.66 a　 3.43 a　 46.93 a　 0.10 a 　12.22 a　 0.47 a標準差 　0.25 　0.13 　0.74 　0.19 　0.15 　0.04 　0.78 　0.04 　0.38 　0.04 CV(%)　2.5 　2.3 　2.3 　3.5 　1.4 　1.1 　1.7 　40.5 　3.1 　8.7

兩種方法對每種土樣都進行了12批次測定，結(jié)果表明兩種方法的重現(xiàn)性較好，各自平行測定值差異不顯著。從兩種測定結(jié)果的變異系數(shù)來看，兩種方法的精確度都較高，但在高含量測定時紫外法的精確度較高，以往研究也得到類似的結(jié)果[3,10-11]。

兩種測定方法的結(jié)果有顯著差異，但有機質(zhì)含量對測定結(jié)果干擾在兩種方法差異性比較上并不一致，如北京褐土(J)有機質(zhì)含量較低，而沈陽的潮棕壤(G)和常熟的水稻土(I)有機質(zhì)含量較高，但兩種方法未出現(xiàn)顯著性差異，而其余土壤的測定結(jié)果表現(xiàn)出紫外法與鎘柱還原法有顯著差異性(P＜0.05)。宋歌等[13]利用紫外法和鍍銅鎘還原-重氮化偶合比色法測得不同土壤的結(jié)果也出現(xiàn)了顯著性差異(P＜0.05)，陜紅等[15]研究也發(fā)現(xiàn)分析方法可顯著影響土壤中的測定值。本研究表明，測定方法間存在顯著差異的土樣均為紫外法測定結(jié)果高于鎘柱還原法，這與陜紅等[15]利用3種土壤進行測定方法比較的結(jié)果是一致的。兩種方法測定結(jié)果出現(xiàn)差異可能與紫外法f 值的取值大小有關。每一種土壤的校正因數(shù)f 值取決于測試時選用的波長和有機質(zhì)的性質(zhì)。宋歌等[13]研究表明，紫外法與鍍銅鎘還原-重氮化偶合比色法相比較時，f 值取值為2.2，比取值為2.0的測定結(jié)果差異更小，但仍有個別土壤出現(xiàn)差異。因此，f 取何值時能夠盡可能使全部類型的土壤測定的結(jié)果更為可信，且與經(jīng)典方法無差異，這值得我們進一步研究分析。

2.3 兩種分析方法準確度比較

表4結(jié)果表明，鎘柱還原法測得回收率的范圍是91%～104%，紫外法測得的回收率范圍是89%～97%(除樣品H外)，兩種方法的回收率都達到了技術(shù)標準的實驗要求[16]。對于含量次低的樣品J，鎘柱還原法測定的精確度更高些(表2)，而回收試驗也表明鎘柱還原法測定的準確度高于紫外法，可見從準確度角度考慮，鎘柱還原法更適合低含量的測定。劉建坤等[17]總結(jié)紫外分光光度法和鎘柱還原法測水中時表明，紫外分光光度法的LLD(檢出下限)遠高于鎘柱還原法，同樣說明低濃度的測定適宜選用鎘柱還原法。對于高含量的土樣測定，無論是重復測定結(jié)果還是加標回收試驗結(jié)果，都表現(xiàn)出紫外法的變異系數(shù)遠小于鎘柱還原法，說明前者對含量較高的樣品(本研究中＞3 mg/kg)測定精確度更好。

表3　兩種測定方法的硝態(tài)氮回收率(n = 6)Table 3 Recoveries of the two soil N-N determination methods

表3　兩種測定方法的硝態(tài)氮回收率(n = 6)Table 3 Recoveries of the two soil N-N determination methods

方法 　　項目土樣編號A 　B 　C 　D 　E 　F 　G 　H 　I 　J鎘柱法 　　回收率(%)　96 　92 　94 　91 　104 　94 　96 　93 　92 　94 CV(%)　2.5 　3.1 　4.2 　5.2 　2.2 　4.6 　3.5 　140.7 　6.0 　7.5紫外法 　　回收率(%)　97 　94 　94 　91 　96 　96 　94 　84 　91 　89 CV(%)　2.5 　2.4 　2.2 　3.4 　1.4 　2.6 　1.5 　41.6 　3.1 　8.9

另外，鎘柱還原法盡管使用了自動化的流動注射分析儀避免了人為操作誤差，具有分析速度快、操作自動化等優(yōu)點，但受鎘柱還原率、時間校正等因子影響，在儀器校準等方面要求高于紫外法，可能會出現(xiàn)重復性和穩(wěn)定性較差的現(xiàn)象。葉祥盛等[18]對鎘柱還原法與酚二磺酸比色法比較發(fā)現(xiàn)鎘柱還原法精密度不如酚二磺酸比色法，但兩者準確度相同。

2.4 兩種分析方法的相關性及適用性分析

鎘柱還原法與紫外法測定結(jié)果的相關性分析表明，兩種方法測定值之間極顯著相關(y = 1.018x + 0.581 2，R2= 0.998，P＜0.01，n = 12)，因此這兩種方法之間具有可比性。宋歌等[13]對4種方法測定的結(jié)果進行比較發(fā)現(xiàn)，紫外分光光度法與酚二磺酸比色法等3種經(jīng)典方法完全可以進行對比。葉祥盛等[17]研究表明，基于鎘柱還原的流動注射分析法與酚二磺酸比色法相關性極顯著，兩種方法測定的結(jié)果相差很小。這說明紫外法和鎘柱還原法測定的結(jié)果是可信的。

從儀器操作和校準上，鎘柱還原法較紫外法更為復雜，其耗材如鎘柱等成本高，也易形成污染。紫外法測定所需要的儀器便宜，低濃度測定結(jié)果與鎘柱還原法相比并沒有顯著差異，而高濃度測定時優(yōu)勢明顯(精密度、穩(wěn)定性及精確度較高)，操作簡便，在自動進樣裝置配合下紫外法的適用范圍可能更廣。

3 結(jié)論

兩種測試分析方法所測定的值有一定的差異，在如何消除測定值的差異性上，需要深入研究如何消除干擾因子、選擇合理 f 值，繼而減小兩種方法的測定差異性，提高方法的適用性。

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Comparison Between Ultraviolet Spectrophotometry and Cadmium Reduction Method in Determination of Soil Nitrate-N

TU Cheng1,2,HUANG Wei1,2,CHEN Anlei1*,SONG Ge3,CHEN Chunlan1,WANG Wei1,XIE Xiaoli1
(1 Key Laboratory of Agro-ecological Processes in Subtropical Region,Institute of Subtropical Agriculture,Chinese Academy of Sciences,Changsha 410125,China; 2 University of Chinese Academy of Sciences,Beijing 100049,China; 3 Institute of Soil Science,Chinese Academy of Sciences,Nanjing 210008,China)

Abstract:The modified UV spectrophotometry and cadmium reduction method(flow injection analysis)are two main methods applied to rapid analysis ofTo explore the difference and application in the measurement ofby the two methods,10 soil samples from different regions of China were determined by the two methods.Results showed that significant correlations existed betweencontents determined by the two methods,the precision of the two methods ranged from 89% to 104%.There are difference in methods application depend on the content range,for low content ofcadmium reduction method was better than UV spectrophotometry in accuracy,but for high content ofUV spectrophotometry was better with higher precision and lower variability,and the measured value using UV spectrophotometry method were higher than that using cadmium reduction method.UV spectrophotometry was more suitable for rapid analysis of large batches of soil samples for its simple operation and less interference factors.

Key words:UV spectrophotometry; Cadmium reduction method; Flow injection analysis;

作者簡介：涂成(1990—)，女，湖北天門人，碩士研究生，主要從事農(nóng)田環(huán)境研究。E-mail:1060033527@qq.com

* 通訊作者(alchen@isa.ac.cn)

基金項目：①國家自然科學基金項目(31200339)、湖南省科技計劃項目(2014NK3083)和公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項(201203030)資助。

DOI:10.13758/j.cnki.tr.2016.01.022

中圖分類號：S151.9+5