付崇毅，姜 偉，郝利清，王建國，杜金偉

（1.內(nèi)蒙古農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院，內(nèi)蒙古呼和浩特 010031；2.內(nèi)蒙古商都縣林業(yè)工作站，內(nèi)蒙古商都 013450）

近年來隨著草莓組培脫毒苗的推廣普及，草莓組培脫毒苗需求量不斷增加，莖尖組織培養(yǎng)是目前生產(chǎn)上獲得草莓脫毒苗的主要途徑之一。在草莓組織培養(yǎng)中褐化是最常見的問題[1]，其與菌類污染、玻璃化并稱為組織培養(yǎng)的三大難題，褐化嚴(yán)重影響了草莓莖尖生長和分化。本試驗在總結(jié)前期對草莓組培褐化問題研究基礎(chǔ)上，進(jìn)一步研究并優(yōu)化了草莓莖尖組織培養(yǎng)防褐化技術(shù)，以期為內(nèi)蒙古自治區(qū)草莓組培脫毒苗規(guī)?；焖倥嘤N苗提供技術(shù)支持。

1 材料和方法

1.1 試驗材料及地點

選取生長健壯的“紅顏”草莓母株上新長出的匍匐莖頂端3～4 cm長的頂芽為試驗材料。試驗于2015年3月—2015年5月在內(nèi)蒙古農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所試驗場日光溫室及實驗室內(nèi)進(jìn)行。

1.2 試驗處理

試驗Ⅰ：VC溶液的不同濃度浸泡處理對草莓莖尖褐化影響研究。2015年3月，取試驗材料經(jīng)滅菌后，采用不同濃度VC溶液進(jìn)行浸泡處理，浸泡時間10 min（表1）。然后在超凈工作臺上剝?nèi)ビ兹~，由頂芽分生組織上切取0.3～0.4mm莖尖，接種于裝有誘導(dǎo)培養(yǎng)基的三角瓶（50 mL）內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)，每瓶接種4個莖尖。每個處理接種10瓶，3次重復(fù)。培養(yǎng)條件為光照 1 500～2 000 Lx，12 h/d，溫度 16～22 ℃。

表1 不同VC溶液濃度對草莓莖尖褐化影響試驗處理

試驗Ⅱ：VC溶液不同浸泡時間對草莓莖尖褐化影響研究。2015年4月，取試驗材料經(jīng)滅菌后，采用300 mg/L VC溶液進(jìn)行不同時間的浸泡處理（表2）。然后在超凈工作臺上剝?nèi)ビ兹~，由頂芽分生組織上切取0.3～0.4mm莖尖，接種于裝有誘導(dǎo)培養(yǎng)基的三角瓶（50 mL）內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)，每瓶接種4個莖尖。每個處理接種10瓶，3次重復(fù)。培養(yǎng)條件為光照1 500～2 000 Lx，12 h/d，溫度 16～22 ℃。

表2 VC溶液不同浸泡時間對草莓莖尖褐化影響試驗

試驗Ⅲ：抗氧化劑和吸附劑對草莓莖尖褐化影響研究。2015年5月，取試驗材料經(jīng)滅菌后，采用300 mg/L VC溶液浸泡12 min（表3）。然后在超凈工作臺上剝?nèi)ビ兹~，由頂芽分生組織上切取0.3～0.4mm莖尖，接種于裝有誘導(dǎo)培養(yǎng)基的三角瓶（50 mL）內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)，誘導(dǎo)培養(yǎng)基中分別添加有PVP（抗氧化劑）或活性炭（吸附劑）。每瓶接種4個莖尖。每個處理接種10瓶，3次重復(fù)。培養(yǎng)條件為光照1 500～2 000 Lx，12 h/d，溫度 16～22 ℃。

表3 不同防褐化措施對草莓莖尖褐化影響試驗

1.3 測定指標(biāo)和方法

各處理在莖尖接種14 d后統(tǒng)計褐化率和萌發(fā)率。褐化：接種后的莖尖表面全部變?yōu)楹稚凑J(rèn)為該莖尖出現(xiàn)褐化。萌發(fā)：接種后的莖尖出現(xiàn)膨大的愈傷組織即認(rèn)為該莖尖被誘導(dǎo)萌發(fā)。

褐化率和萌發(fā)率分別按以下公式計算：

1.4 數(shù)據(jù)分析

試驗數(shù)據(jù)采用Excel 2007進(jìn)行處理，SAS9.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。利用隸屬函數(shù)法對各試驗處理效果進(jìn)行綜合評價。

式中Xi為指標(biāo)測定值的平均值，Xmax、Xmin為所有處理某一指標(biāo)平均值的最大值和最小值。各處理各指標(biāo)數(shù)值轉(zhuǎn)換后進(jìn)行累加，取其平均值以評價各處理的防褐化或玻璃化效果。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同VC溶液濃度浸泡處理對草莓莖尖褐化影響

由表4可知，N3萌發(fā)率最高，且與CK間差異顯著（P＜0.05），N1、N2、N4、N5 之間差異不顯著。N3褐化率最低，其次是N4，兩者與CK間均差異顯著（P＜0.05），N1、N2、N5與 CK 間差異不顯著。采用隸屬函數(shù)分析后可知，N3的萌發(fā)率和褐化率隸屬函數(shù)均為1，且綜合評價值最高。

表4 不同VC溶液濃度浸泡處理對草莓莖尖褐化影響比較

2.2 VC溶液不同浸泡時間對草莓莖尖褐化影響

由表5可以看出，VC浸泡處理的草莓莖尖萌發(fā)率顯著（P＜0.05）高于CK，P5萌發(fā)率最高。P4褐變率最低，其次為P5，P4與P5間差異不顯著。P3、P4、P5與對照間差異顯著。利用隸屬函數(shù)通過計算綜合分析可知，P4綜合評價值最高。

表5 VC溶液不同浸泡時間對草莓莖尖褐化影響比較

2.3 抗氧化劑和吸附劑對草莓莖尖褐化影響

由表6可知，Z1萌發(fā)率最高，且褐變率最低，與CK間差異顯著（P＜0.05）。Z2處理能降低褐變率，使萌發(fā)率升高，但與CK間差異不顯著。進(jìn)一步利用隸屬函數(shù)通過計算綜合分析后發(fā)現(xiàn)，Z1綜合評價值最高。

表6 不同防褐化措施對草莓莖尖褐化影響比較

3 討論

相關(guān)研究表明[2-3]，褐化的主要原因是酚類物質(zhì)在多酚氧化酶作用下被氧化形成醌而引起的，在組織培養(yǎng)中加入抗氧化劑或吸附劑[4-8]可預(yù)防醌類物質(zhì)形成[9]，同時VC作為一種抗褐化劑也廣泛應(yīng)用在植物組織培養(yǎng)中[10-11]。采用過濾滅菌方法把VC加入培養(yǎng)基中，雖可以顯著降低草莓莖尖褐化率，但操作費時費工。而利用VC溶液對草莓匍匐莖頂芽進(jìn)行浸泡預(yù)處理，操作更為簡單。本試驗研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)VC溶液濃度為300 mg/L時，可顯著降低草莓莖尖褐變率，并促進(jìn)莖尖愈傷組織萌發(fā)，顯著提高萌發(fā)率。當(dāng)VC浸泡時間達(dá)到9 min后，草莓莖尖褐變率比對照才顯著降低，說明采用VC溶液浸泡預(yù)處理草莓頂芽，必須達(dá)到一定的時間才能抑制草莓莖尖的褐化。此外，在培養(yǎng)基中添加抗氧化劑PVP可顯著降低草莓莖尖褐化率，同時也能促進(jìn)愈傷組織的萌發(fā)，萌發(fā)率可達(dá)到100%。而添加吸附劑活性炭對抑制草莓莖尖褐化的發(fā)生作用不明顯。綜上所述，通過采用VC溶液浸泡預(yù)處理草莓頂芽，在培養(yǎng)基中添加抗氧化劑PVP，綜合兩種抗褐化措施可顯著抑制草莓莖尖褐化的發(fā)生，并能促進(jìn)草莓莖尖愈傷組織的萌發(fā)。

4 結(jié)論

采用VC溶液對草莓頂芽進(jìn)行浸泡預(yù)處理，最適宜濃度為300 mg/L，最適宜浸泡時間為12 min。VC溶液浸泡預(yù)處理后在培養(yǎng)基中添加1.5 g/L PVP對草莓莖尖褐化的發(fā)生抑制效果最好，莖尖愈傷組織萌發(fā)率達(dá)到100%。

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